阿霉素致大鼠肝细胞凋亡及亚硒酸钠的保护作用
作者：李晖 钱素娟 于维汉 王守智 刘秀萍 高旭 周令望
单位：李 晖 刘秀萍 高 旭 哈尔滨医科大学 基础医学院，黑龙江 哈尔滨 150086；钱素娟 于维汉 周令望 哈尔滨医科大学 克山病研究所，黑龙江 哈尔滨 150086；王守智 中国地方病学防治研究中心，黑龙江 哈尔滨 150086
关键词：阿霉素；细胞凋亡；亚硒酸钠；转化生长因子—β
中国地方病学杂志990407 摘要 目的 探讨阿霉素对肝细胞的损伤机制及亚硒酸钠对肝细胞的保护作用。方法 通过复制大鼠阿霉素性心肌损伤的动物模型，以亚硒酸钠作为保护因素，应用原位末端标记法(TUNEL)和免疫组化技术检测大鼠肝细胞凋亡和肝细胞转化生长因子β1表达，并观察了大鼠血清中脂质过氧化含量。结果 阿霉素组大鼠肝组织可见细胞凋亡和肝细胞中转化生长因子β1的异常表达；阿霉素组大鼠血清中脂质过氧化物明显升高；亚硒酸钠对阿霉素的损伤有明显的保护作用。结论 阿霉素诱导肝细胞凋亡可能是其肝脏损伤机制之一，并且细胞凋亡与转化生长因子β1的高表达和血清中脂质过氧化水平升高有密切关系。
, 百拇医药
中图分类号O613.52;Q255 [文献标识码]A [文章编号]1000-4955(1999)04-0265-03
Liver cells apoptosis induced by adriamycin and protective effect of selenium in rats
LI Hui,QIAN Su-juan,YU Wei-han,et al
(Dept of Biochemistry,Harbin Medical University,Harbin 150086,China)
abstract Objective To explore the mechanism of liver injury induced by adriamycin(ADR) and the protective effect of sodium selenite.Methods Using Wistar rats as animal pattem of ADR-induced myocardial injury and sodium selenite as protective agent.The double flourescent staining of apoptosis and expression of transforming growth factor β1 (TGF β1) were examined in liver tissue of animal pattern of ADR-injury by immunohistochemical and TUNEL,and the level of lipid peroxidation in serum was observed.Results In liver tissue of ADR-injury grope were showed apoptosis and abnormal expression of transforming growth factor β1(TGFβ1),which distributed around the focus.There were increasing level of lipid peroxidation in serum.Selenium had protective effec for the liver cell injury induced by ADR.Conclusions Apoptosis,abnormal expression of TGFβ1 and elevation of lipid peroxidation involved liver injury mechanisms induced by ADR.
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Key words Adriamycin；Apoptosis；Selenium；TGFβ1
阿霉素(Adriamycin,ADR)是有效的蒽醌类抗癌药物之一，由于其副作用，在临床应用时受到明显限制。ADR可以诱导多种肿瘤细胞[1]和心肌细胞凋亡[2]，但导致肝细胞凋亡作用还未见报导。亚硒酸钠(Se)是一种重要的抗氧化物质，Se除了作为谷胱苷肽过氧化物酶的组成成分外，还参与体内多种酶的合成。本研究以Se作为保护因素，观察了ADR致大鼠肝细胞凋亡，血清中脂质过氧化物含量和转化生长因子β表达，旨在探讨ADR致大鼠肝细胞凋亡和Se保护作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物：采用Wistar大鼠，体重160～210g，雌雄各半，随机分成3组。I组：ADR损伤组20只，Ⅱ组：ADR+Se组20只；Ⅲ组：正常对照组20只。
, 百拇医药
1.2 主要试剂：阿霉素(ADR)广东省汕头市汕头明治医药有限公司制造，日本明治医药株氏会社监制;亚硒酸钠(分析纯)沈阳试剂二厂出品；细胞凋亡检测试剂盒(美国Oncor公司；蛋白酶K(美国Gibco公司)；转化生长因子β检测试剂盒(福州迈新生物技术开发公司)。
1.3 动物模型制作及动物预处理：I组：ADR 每次4.0mg/kg ip，隔日1次，共注射3次，累积剂量为12.0mg/kg。Ⅱ组：ADR处理同I组，在给ADR前一周给亚硒酸钠每天0.2mg/kg ip.连续给7天，并继续按此剂量在给ADR同时给亚硒酸钠7天，后改为每周2次。Ⅲ组：给相同体积生理盐水ip。动物在给ADR6周后处死。
1.4 制备肝细胞石蜡包埋标本：断颈处死动物，迅速取肝组织，常规进行固定，脱水，石蜡包埋。
1.5 DNA裂口末端标记(T/U NEL)检测凋亡细胞：T/U NEL法是标记DNA特异酶切片段末端，通过显色反应鉴别凋亡细胞的方法。操作严格按说明书进行[3]。
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1.6 肝细胞DNA电泳图谱：取肝组织约100mg，按照提取小片段DNA方法提取DNA[3]。制备1.5%琼脂糖凝胶，加10μl DNA提取液和1μl 6×载样缓冲液至上样孔，电压50V，电泳3小时，于紫外透射仪观察电泳条带。
1.7 血清脂质过氧化物水平检测：采用丙二醛法检测[4]血清中丙二醛(MDA)水平。以1，1，3，3-四乙氧基丙烷为标准品，由标准曲线查得MDA含量。
1.8 转化生长因子β1(TGF-β1)检测：采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生素蛋白连接的过氧化物来检测肝组织中的TGF-β1蛋白表达。操作过程按说明书进行。
2 结果
2.1 T/U NEL法检测肝脏凋亡细胞：凋亡细胞因含有特异的DNA酶切片段末端而核呈棕褐色染色，正常细胞核呈绿色。Ⅰ组：85%(17/20)大鼠肝脏组织中出现凋亡阳性细胞，多分布于中央静脉周围以及肝包膜下，Ⅱ组和Ⅲ组大鼠肝组织中未见凋亡阳性细胞(见图1，图2)。
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图1 ADR组肝组织(T/U NEL)检测结果(66×).
图2 ADR+Se组肝组织(T/U NEL)检测结果(33×).
2.2 肝细胞DNA电泳结果：如图3，1为标准分子量物质，2为Ⅲ组，肝组织DNA，3为Ⅱ组肝细胞DNA，均为正常基因组DNA电泳图。4为I组肝组织DNA，可见到小片段DNA电泳条带。
图3 肝细胞DNA电泳图
2.3 血清中脂质过氧化物检测结果：见附表。经F检验：F值=15.00,P<0.001,组间差异极显著，各组间经Q检验，Ⅰ∶Ⅲ MDA含量明显增高(P<0.01)，差异有极显著性意义；Ⅰ∶Ⅱ MDA含量明显增高(P<0.05)，差异有显著性意义；Ⅱ∶Ⅲ，P>0.05无统计学意义。
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附表 大鼠血清中MDA含量检测结果(nmol/ml) 分组
n
血清MDA
ⅠADR组
ⅡSe组
Ⅲ对照组
20
20
20
8.67±0.55
6.21±0.69
4.0405±0.68
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2.4 转化生长因子β1检测结果：I组肝细胞膜上可见到黄色染色的TGF-β1阳性表达(见图4)，其表达部位与凋亡细胞的存在部位基本一致。Ⅱ和Ⅲ组均未见到阳性染色。
图4 免疫组化法检测肝组织TGF-β1表达结果(33×).
3 讨论
近年的研究表明，细胞凋亡的失调(凋亡过度或凋亡不足)与许多疾病的发生发展有关。目前，对细胞凋亡的研究手段很多，本研究所采用的原位末端标记法和凝胶电泳法是应用广、简便、快速而又较敏感的方法。
本研究结果显示：ADR诱导肝细胞凋亡可能是肝损伤机制之一。诱导凋亡的因素很多，不同的细胞其诱导因素各不相同，具有普遍性意义的有DNA损伤因素。ADR可以损伤DNA系统，导致DNA链的断裂。这种作用可能启动或抑制了某种凋亡相关基因或因子，而诱导了凋亡的发生。再之，ADR在机体内经代谢，产生大量自由基，其中包括羟自由基H2O2等，它们和蛋白质、DNA和脂质等反应，可引起蛋白质氧化、DNA链断裂、细胞膜起泡、脂质氧化等，而细胞膜起泡和脂质氧化正是细胞凋亡的特征。本研究结果显示ADR组血清脂质过氧化物水平明显增高，与该组肝细胞凋亡呈相关关系。
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TGF-β1是与肝细胞凋亡关系密切的细胞活性多肽，目前认为TGF-β1参与了肝细胞凋亡的发生。正常肝组织用免疫组化方法一般不能检测到TGF-β。本研究结果显示ADR组肝细胞凋亡区域出现TGF-β1的高表达；而在Se组和正常对照组未见有阳性表达。因此我们认为：TGF-β1的激活表达是肝细胞再生终止的信号之一，并参与了ADR所致的肝细胞凋亡的发生。有学者认为，TGF-β可作为肝细胞凋亡的分子标志之一。
近年的研究强调对细胞膜结构有保护作用。本研究结果显示，Se可降低体内脂质过氧化物的作用，含硒的谷胱甘肽过氧化物酶可以加速ROOH游离基和H2O2的分解，从而保护细胞免受过氧化物的损伤，阻止了肝细胞凋亡的发生，从而发挥保护肝脏功能的作用。
作者简介：李 晖，女，1956年生，医学博士
, 百拇医药
参考文献
[1] Skladanowski A,et al.Adriamycin and daunomycin induce programmed cell death (apoptosis) in tumour cell[J].Biochem Pharmacol,1993,46:375.
[2] 李 晖，钱素娟，周令望，等.心肌细胞凋亡的实验研究[J].哈尔滨医科大学学报，1997，31(3):197-198.
[3] 张雪莲.卵巢颗粒细胞的凋亡机制及影响因素探讨[D].哈尔滨医科大学博士论文，1996.
[4] 周 强，许立庆，郭风学，等.血清脂质过氧化物的快速荧光测定[J].哈尔滨医科大学学报，1995，29(6)：458-459.
收稿日期1998-03-06, http://www.100md.com
单位：李 晖 刘秀萍 高 旭 哈尔滨医科大学 基础医学院，黑龙江 哈尔滨 150086；钱素娟 于维汉 周令望 哈尔滨医科大学 克山病研究所，黑龙江 哈尔滨 150086；王守智 中国地方病学防治研究中心，黑龙江 哈尔滨 150086
关键词：阿霉素；细胞凋亡；亚硒酸钠；转化生长因子—β
中国地方病学杂志990407 摘要 目的 探讨阿霉素对肝细胞的损伤机制及亚硒酸钠对肝细胞的保护作用。方法 通过复制大鼠阿霉素性心肌损伤的动物模型，以亚硒酸钠作为保护因素，应用原位末端标记法(TUNEL)和免疫组化技术检测大鼠肝细胞凋亡和肝细胞转化生长因子β1表达，并观察了大鼠血清中脂质过氧化含量。结果 阿霉素组大鼠肝组织可见细胞凋亡和肝细胞中转化生长因子β1的异常表达；阿霉素组大鼠血清中脂质过氧化物明显升高；亚硒酸钠对阿霉素的损伤有明显的保护作用。结论 阿霉素诱导肝细胞凋亡可能是其肝脏损伤机制之一，并且细胞凋亡与转化生长因子β1的高表达和血清中脂质过氧化水平升高有密切关系。
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中图分类号O613.52;Q255 [文献标识码]A [文章编号]1000-4955(1999)04-0265-03
Liver cells apoptosis induced by adriamycin and protective effect of selenium in rats
LI Hui,QIAN Su-juan,YU Wei-han,et al
(Dept of Biochemistry,Harbin Medical University,Harbin 150086,China)
abstract Objective To explore the mechanism of liver injury induced by adriamycin(ADR) and the protective effect of sodium selenite.Methods Using Wistar rats as animal pattem of ADR-induced myocardial injury and sodium selenite as protective agent.The double flourescent staining of apoptosis and expression of transforming growth factor β1 (TGF β1) were examined in liver tissue of animal pattern of ADR-injury by immunohistochemical and TUNEL,and the level of lipid peroxidation in serum was observed.Results In liver tissue of ADR-injury grope were showed apoptosis and abnormal expression of transforming growth factor β1(TGFβ1),which distributed around the focus.There were increasing level of lipid peroxidation in serum.Selenium had protective effec for the liver cell injury induced by ADR.Conclusions Apoptosis,abnormal expression of TGFβ1 and elevation of lipid peroxidation involved liver injury mechanisms induced by ADR.
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Key words Adriamycin；Apoptosis；Selenium；TGFβ1
阿霉素(Adriamycin,ADR)是有效的蒽醌类抗癌药物之一，由于其副作用，在临床应用时受到明显限制。ADR可以诱导多种肿瘤细胞[1]和心肌细胞凋亡[2]，但导致肝细胞凋亡作用还未见报导。亚硒酸钠(Se)是一种重要的抗氧化物质，Se除了作为谷胱苷肽过氧化物酶的组成成分外，还参与体内多种酶的合成。本研究以Se作为保护因素，观察了ADR致大鼠肝细胞凋亡，血清中脂质过氧化物含量和转化生长因子β表达，旨在探讨ADR致大鼠肝细胞凋亡和Se保护作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物：采用Wistar大鼠，体重160～210g，雌雄各半，随机分成3组。I组：ADR损伤组20只，Ⅱ组：ADR+Se组20只；Ⅲ组：正常对照组20只。
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1.2 主要试剂：阿霉素(ADR)广东省汕头市汕头明治医药有限公司制造，日本明治医药株氏会社监制;亚硒酸钠(分析纯)沈阳试剂二厂出品；细胞凋亡检测试剂盒(美国Oncor公司；蛋白酶K(美国Gibco公司)；转化生长因子β检测试剂盒(福州迈新生物技术开发公司)。
1.3 动物模型制作及动物预处理：I组：ADR 每次4.0mg/kg ip，隔日1次，共注射3次，累积剂量为12.0mg/kg。Ⅱ组：ADR处理同I组，在给ADR前一周给亚硒酸钠每天0.2mg/kg ip.连续给7天，并继续按此剂量在给ADR同时给亚硒酸钠7天，后改为每周2次。Ⅲ组：给相同体积生理盐水ip。动物在给ADR6周后处死。
1.4 制备肝细胞石蜡包埋标本：断颈处死动物，迅速取肝组织，常规进行固定，脱水，石蜡包埋。
1.5 DNA裂口末端标记(T/U NEL)检测凋亡细胞：T/U NEL法是标记DNA特异酶切片段末端，通过显色反应鉴别凋亡细胞的方法。操作严格按说明书进行[3]。
, 百拇医药
1.6 肝细胞DNA电泳图谱：取肝组织约100mg，按照提取小片段DNA方法提取DNA[3]。制备1.5%琼脂糖凝胶，加10μl DNA提取液和1μl 6×载样缓冲液至上样孔，电压50V，电泳3小时，于紫外透射仪观察电泳条带。
1.7 血清脂质过氧化物水平检测：采用丙二醛法检测[4]血清中丙二醛(MDA)水平。以1，1，3，3-四乙氧基丙烷为标准品，由标准曲线查得MDA含量。
1.8 转化生长因子β1(TGF-β1)检测：采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生素蛋白连接的过氧化物来检测肝组织中的TGF-β1蛋白表达。操作过程按说明书进行。
2 结果
2.1 T/U NEL法检测肝脏凋亡细胞：凋亡细胞因含有特异的DNA酶切片段末端而核呈棕褐色染色，正常细胞核呈绿色。Ⅰ组：85%(17/20)大鼠肝脏组织中出现凋亡阳性细胞，多分布于中央静脉周围以及肝包膜下，Ⅱ组和Ⅲ组大鼠肝组织中未见凋亡阳性细胞(见图1，图2)。
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图1 ADR组肝组织(T/U NEL)检测结果(66×).
图2 ADR+Se组肝组织(T/U NEL)检测结果(33×).
2.2 肝细胞DNA电泳结果：如图3，1为标准分子量物质，2为Ⅲ组，肝组织DNA，3为Ⅱ组肝细胞DNA，均为正常基因组DNA电泳图。4为I组肝组织DNA，可见到小片段DNA电泳条带。
图3 肝细胞DNA电泳图
2.3 血清中脂质过氧化物检测结果：见附表。经F检验：F值=15.00,P<0.001,组间差异极显著，各组间经Q检验，Ⅰ∶Ⅲ MDA含量明显增高(P<0.01)，差异有极显著性意义；Ⅰ∶Ⅱ MDA含量明显增高(P<0.05)，差异有显著性意义；Ⅱ∶Ⅲ，P>0.05无统计学意义。
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附表 大鼠血清中MDA含量检测结果(nmol/ml) 分组
n
血清MDA
ⅠADR组
ⅡSe组
Ⅲ对照组
20
20
20
8.67±0.55
6.21±0.69
4.0405±0.68
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2.4 转化生长因子β1检测结果：I组肝细胞膜上可见到黄色染色的TGF-β1阳性表达(见图4)，其表达部位与凋亡细胞的存在部位基本一致。Ⅱ和Ⅲ组均未见到阳性染色。
图4 免疫组化法检测肝组织TGF-β1表达结果(33×).
3 讨论
近年的研究表明，细胞凋亡的失调(凋亡过度或凋亡不足)与许多疾病的发生发展有关。目前，对细胞凋亡的研究手段很多，本研究所采用的原位末端标记法和凝胶电泳法是应用广、简便、快速而又较敏感的方法。
本研究结果显示：ADR诱导肝细胞凋亡可能是肝损伤机制之一。诱导凋亡的因素很多，不同的细胞其诱导因素各不相同，具有普遍性意义的有DNA损伤因素。ADR可以损伤DNA系统，导致DNA链的断裂。这种作用可能启动或抑制了某种凋亡相关基因或因子，而诱导了凋亡的发生。再之，ADR在机体内经代谢，产生大量自由基，其中包括羟自由基H2O2等，它们和蛋白质、DNA和脂质等反应，可引起蛋白质氧化、DNA链断裂、细胞膜起泡、脂质氧化等，而细胞膜起泡和脂质氧化正是细胞凋亡的特征。本研究结果显示ADR组血清脂质过氧化物水平明显增高，与该组肝细胞凋亡呈相关关系。
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TGF-β1是与肝细胞凋亡关系密切的细胞活性多肽，目前认为TGF-β1参与了肝细胞凋亡的发生。正常肝组织用免疫组化方法一般不能检测到TGF-β。本研究结果显示ADR组肝细胞凋亡区域出现TGF-β1的高表达；而在Se组和正常对照组未见有阳性表达。因此我们认为：TGF-β1的激活表达是肝细胞再生终止的信号之一，并参与了ADR所致的肝细胞凋亡的发生。有学者认为，TGF-β可作为肝细胞凋亡的分子标志之一。
近年的研究强调对细胞膜结构有保护作用。本研究结果显示，Se可降低体内脂质过氧化物的作用，含硒的谷胱甘肽过氧化物酶可以加速ROOH游离基和H2O2的分解，从而保护细胞免受过氧化物的损伤，阻止了肝细胞凋亡的发生，从而发挥保护肝脏功能的作用。
作者简介：李 晖，女，1956年生，医学博士
, 百拇医药
参考文献
[1] Skladanowski A,et al.Adriamycin and daunomycin induce programmed cell death (apoptosis) in tumour cell[J].Biochem Pharmacol,1993,46:375.
[2] 李 晖，钱素娟，周令望，等.心肌细胞凋亡的实验研究[J].哈尔滨医科大学学报，1997，31(3):197-198.
[3] 张雪莲.卵巢颗粒细胞的凋亡机制及影响因素探讨[D].哈尔滨医科大学博士论文，1996.
[4] 周 强，许立庆，郭风学，等.血清脂质过氧化物的快速荧光测定[J].哈尔滨医科大学学报，1995，29(6)：458-459.
收稿日期1998-03-06, http://www.100md.com