微囊化猪胰岛对人新鲜血清免疫隔离作用的体外研究
作者：张苏河 栗夏莲 李青菊 程 栋 李鹏诺 田晨光 李凤良 欧阳安
单位：张苏河 栗夏莲 李青菊 李鹏诺 田晨光 李凤良 河南医科大学第二附属医院(郑州，450003)；程 栋 焦作市人民医院；欧阳安 河南医科大学第一附属医院
关键词：猪ICC；微囊；血清；胰岛素
中国慢性病预防与控制990418 中图分类号 R392.6 文献标识码 B
免疫排斥和供体短缺是胰岛移植面临的主要问题。当猪胰岛移植于人体时，体内天然存在的抗猪抗体在免疫排斥反应中起一定作用〔1〕。免疫隔离膜的研究为这些问题的解决带来了新的希望。本研究参考Zekorn〔2〕及姜枫琴〔3〕等的一步成囊法，用自行精制的海藻酸钠，将新生猪胰岛样细胞团(ICC)微囊化。通过观察与正常人血清共同孵育后的微囊ICC和游离ICC的胰岛素释放的变化，探讨微囊对ICC的保护作用。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 材料 海藻酸钠：上海化学制剂厂产品，本室自行精制。胶原酶Ⅴ型：美国Sigma公司产品。胰岛素放免药盒：中国原子能科学研究院同位素研究所产品。
1.2 方法
1.2.1 猪ICC的分离纯化 参照姜枫琴〔3〕等人方法并加以改进，分离出ICC，移入加10%灭活小牛血清的RPMI-1640培养液中，置细胞培养箱中培养。于第二、四天各半量换液一次，除去悬浮的腺泡组织、细胞碎片及单核细胞。经双硫腙染色，确认分离的细胞较纯净，纯度80%～90%。
1.2.2 微囊ICC的制备 将培养3～4天ICC按比例加入一定浓度海藻酸钠溶液中，经自制微囊发生器喷入30 mmol/L氯化钡液中使其成囊，过夜培养。同期游离ICC为对照。
, 百拇医药
1.2.3 正常人血清 取正常人血分离血清。分为新鲜血清及灭活血清(56℃40分钟灭活)。
1.2.4 分组及步骤 分组如下：①微囊ICC对照组，②游离ICC对照组，③新鲜血清-微囊ICC组，④新鲜血清-游离ICC组⑤灭活血清-微囊ICC组⑥灭活血清-游离ICC组。步骤：用自制手挑器计数ICC，每个样本三个复孔，数据取平均值。①、②组加RPMI-1640液，③、④组加新鲜血清，⑤、⑥组加灭活血清。于细胞培养箱中培养24 h，弃上清后做胰岛素释放试验，留取上清测基础胰岛素释放值(5.1 mmol/L葡萄糖刺激)及刺激后胰岛素释放值(16.7 mmol/L葡萄糖+10 mmol/L茶硷刺激后)。
1.3 统计学处理 采用多个样本均数两两比较的方差分析法，SPSS统计软件包进行统计学处理。
2 结 果
2.1 ICC形态 ICC经双硫腙染色后呈桔红色，边缘清晰。微囊ICC直径约500～600 μm，外形完整，大小均匀，每个微囊含1～3个胰岛。
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2.2 人血清对ICC胰岛素释放的影响 (见表1)。
表1 人血清对微囊ICC和游离ICC胰岛素释放的影响(
±s) 组别
例数
基础胰岛素(mU/L)
刺激后胰岛素(mU/L)
微囊ICC对照组
6
97.61±11.99
234.33±28.31
游离ICC对照组
, 百拇医药
6
100.17±10.91
252.50±42.87
新鲜血清-微囊ICC组
6
95.16±15.91
239.17±41.71
新鲜血清-游离ICC组
6
90.01±17.14
172.78±41.25*＃
, 百拇医药 灭活血清-微囊ICC组
6
87.35±19.56
238.00±46.71
灭活血清-游离ICC组
6
89.68±16.67
228.33±32.11
*与游离ICC对照组比较，P<0.05；#与新鲜血清-微囊ICC比较，P<0.05
3 讨 论
动物实验发现，胰岛移植后受体的IgG、IgM、G3沉积于胰岛上，补体被激活。人血清中存在天然抗猪抗体IgG、IgM。它们的作用位点是猪红细胞、淋巴细胞及血管内皮细胞上的一种普通碳氢化合物，简称Gal α(1，3)Gal。在器官移植时，天然抗猪抗体与该位点结合，引起超急性排斥反应。猪胰岛由于已去除了血管内皮细胞，移植后不应发生超急性排斥反应。但在对灵长类动物的移植实验中发现，超急性排斥反应仍不可避免。Sandrin〔4〕发现，猪的实质器官如胰、肾、肝等亦分布有Gal α(1，3)Gal，故人体中的天然抗猪抗体能与移植胰岛上的抗原位点结合，激活补体，通过补体介导的细胞毒性途径，引发超急性排斥反应。
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本实验用人新鲜血清作为天然抗体和补体源，与微囊ICC及游离ICC共同孵育24h，而后测定各组胰岛素释放试验。并同时观察灭活血清组及培养液组的胰岛素释放。结果显示：人新鲜血清具有抑制游离ICC胰岛素释放作用，灭活血清对游离ICC的胰岛素释放则无影响。表明新鲜血清的抑制作用可能是天然抗体与猪ICC的抗原位点结合，激活补体后发生的。天然抗体的作用，可能是体液免疫参与异种胰岛移植排斥反应的病理基础。因此，在猪胰岛移植治疗IDDM的研究中，人体内天然抗体的病理作用应得到重视。本研究中的钡-海藻酸钠微囊能够隔离抗体或补体，具有保护ICC的功能。
参考文献
1 Shaapherder AFM,Daha MR,Vander Woude FJ, et al. IgM,IgG and IgA antibodies in human sera directed against porcine islets of langerhans. Transplantation,1994,58∶1109
, http://www.100md.com
2 Zekorn T, Horcher A, Schnettler R, et al. Barium-cross-linked alginate bead: A simple one-step method for successful immuno-isolated transplantation of islets of langerhams. Acta Piabetol, 1992,29∶99
3 姜枫琴,唐天华,刘凤云,等.微囊新生猪胰岛体外培养的研究.中华器官移植杂志,1995,16∶31
4 Sandrin MS, Vaughan HA, Dabkowski PL, et al. Identification of Gal α(1,3)Gal as the major epitope for pig to human Vascularized xenografts. Transplant Rev,1994,8∶134
收稿日期：1998-05-11
修稿日期：1998-08-12, http://www.100md.com
单位：张苏河 栗夏莲 李青菊 李鹏诺 田晨光 李凤良 河南医科大学第二附属医院(郑州，450003)；程 栋 焦作市人民医院；欧阳安 河南医科大学第一附属医院
关键词：猪ICC；微囊；血清；胰岛素
中国慢性病预防与控制990418 中图分类号 R392.6 文献标识码 B
免疫排斥和供体短缺是胰岛移植面临的主要问题。当猪胰岛移植于人体时，体内天然存在的抗猪抗体在免疫排斥反应中起一定作用〔1〕。免疫隔离膜的研究为这些问题的解决带来了新的希望。本研究参考Zekorn〔2〕及姜枫琴〔3〕等的一步成囊法，用自行精制的海藻酸钠，将新生猪胰岛样细胞团(ICC)微囊化。通过观察与正常人血清共同孵育后的微囊ICC和游离ICC的胰岛素释放的变化，探讨微囊对ICC的保护作用。
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1 材料与方法
1.1 材料 海藻酸钠：上海化学制剂厂产品，本室自行精制。胶原酶Ⅴ型：美国Sigma公司产品。胰岛素放免药盒：中国原子能科学研究院同位素研究所产品。
1.2 方法
1.2.1 猪ICC的分离纯化 参照姜枫琴〔3〕等人方法并加以改进，分离出ICC，移入加10%灭活小牛血清的RPMI-1640培养液中，置细胞培养箱中培养。于第二、四天各半量换液一次，除去悬浮的腺泡组织、细胞碎片及单核细胞。经双硫腙染色，确认分离的细胞较纯净，纯度80%～90%。
1.2.2 微囊ICC的制备 将培养3～4天ICC按比例加入一定浓度海藻酸钠溶液中，经自制微囊发生器喷入30 mmol/L氯化钡液中使其成囊，过夜培养。同期游离ICC为对照。
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1.2.3 正常人血清 取正常人血分离血清。分为新鲜血清及灭活血清(56℃40分钟灭活)。
1.2.4 分组及步骤 分组如下：①微囊ICC对照组，②游离ICC对照组，③新鲜血清-微囊ICC组，④新鲜血清-游离ICC组⑤灭活血清-微囊ICC组⑥灭活血清-游离ICC组。步骤：用自制手挑器计数ICC，每个样本三个复孔，数据取平均值。①、②组加RPMI-1640液，③、④组加新鲜血清，⑤、⑥组加灭活血清。于细胞培养箱中培养24 h，弃上清后做胰岛素释放试验，留取上清测基础胰岛素释放值(5.1 mmol/L葡萄糖刺激)及刺激后胰岛素释放值(16.7 mmol/L葡萄糖+10 mmol/L茶硷刺激后)。
1.3 统计学处理 采用多个样本均数两两比较的方差分析法，SPSS统计软件包进行统计学处理。
2 结 果
2.1 ICC形态 ICC经双硫腙染色后呈桔红色，边缘清晰。微囊ICC直径约500～600 μm，外形完整，大小均匀，每个微囊含1～3个胰岛。
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2.2 人血清对ICC胰岛素释放的影响 (见表1)。
表1 人血清对微囊ICC和游离ICC胰岛素释放的影响(
±s) 组别例数
基础胰岛素(mU/L)
刺激后胰岛素(mU/L)
微囊ICC对照组
6
97.61±11.99
234.33±28.31
游离ICC对照组
, 百拇医药
6
100.17±10.91
252.50±42.87
新鲜血清-微囊ICC组
6
95.16±15.91
239.17±41.71
新鲜血清-游离ICC组
6
90.01±17.14
172.78±41.25*＃
, 百拇医药 灭活血清-微囊ICC组
6
87.35±19.56
238.00±46.71
灭活血清-游离ICC组
6
89.68±16.67
228.33±32.11
*与游离ICC对照组比较，P<0.05；#与新鲜血清-微囊ICC比较，P<0.05
3 讨 论
动物实验发现，胰岛移植后受体的IgG、IgM、G3沉积于胰岛上，补体被激活。人血清中存在天然抗猪抗体IgG、IgM。它们的作用位点是猪红细胞、淋巴细胞及血管内皮细胞上的一种普通碳氢化合物，简称Gal α(1，3)Gal。在器官移植时，天然抗猪抗体与该位点结合，引起超急性排斥反应。猪胰岛由于已去除了血管内皮细胞，移植后不应发生超急性排斥反应。但在对灵长类动物的移植实验中发现，超急性排斥反应仍不可避免。Sandrin〔4〕发现，猪的实质器官如胰、肾、肝等亦分布有Gal α(1，3)Gal，故人体中的天然抗猪抗体能与移植胰岛上的抗原位点结合，激活补体，通过补体介导的细胞毒性途径，引发超急性排斥反应。
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本实验用人新鲜血清作为天然抗体和补体源，与微囊ICC及游离ICC共同孵育24h，而后测定各组胰岛素释放试验。并同时观察灭活血清组及培养液组的胰岛素释放。结果显示：人新鲜血清具有抑制游离ICC胰岛素释放作用，灭活血清对游离ICC的胰岛素释放则无影响。表明新鲜血清的抑制作用可能是天然抗体与猪ICC的抗原位点结合，激活补体后发生的。天然抗体的作用，可能是体液免疫参与异种胰岛移植排斥反应的病理基础。因此，在猪胰岛移植治疗IDDM的研究中，人体内天然抗体的病理作用应得到重视。本研究中的钡-海藻酸钠微囊能够隔离抗体或补体，具有保护ICC的功能。
参考文献
1 Shaapherder AFM,Daha MR,Vander Woude FJ, et al. IgM,IgG and IgA antibodies in human sera directed against porcine islets of langerhans. Transplantation,1994,58∶1109
, http://www.100md.com
2 Zekorn T, Horcher A, Schnettler R, et al. Barium-cross-linked alginate bead: A simple one-step method for successful immuno-isolated transplantation of islets of langerhams. Acta Piabetol, 1992,29∶99
3 姜枫琴,唐天华,刘凤云,等.微囊新生猪胰岛体外培养的研究.中华器官移植杂志,1995,16∶31
4 Sandrin MS, Vaughan HA, Dabkowski PL, et al. Identification of Gal α(1,3)Gal as the major epitope for pig to human Vascularized xenografts. Transplant Rev,1994,8∶134
收稿日期：1998-05-11
修稿日期：1998-08-12, http://www.100md.com