肝炎患者血清及肝组织TTVDNA的检测
作者：鲁文清 阎惠平 王金科
单位：鲁文清 王金科 广西南宁市第四医院(530023)；阎惠平 北京市肝炎研究所
关键词：TTV；斑点杂交；原位杂交；肝炎；
广西预防医学990412
摘 要 用斑点杂交和原位杂交方法分别检测肝炎患者血清和肝组织内TTVDNA。结果显示TTVDNA斑点杂交法阳性率为25.33%(19/75)，原位杂交法阳性率为28.57%(2/7)，提示TTV可能是一种嗜肝病毒并对其临床意义进行讨论。
1997年日本学者Nishizawa T首先报道从输血后肝炎病人血清中检出一种与输血后肝炎相关的新型病毒，命名为TTV(transfusion transmitted virus)[1]。本文报道了用斑点杂交和原位杂交方法检测肝炎患者血清和肝组织中的TTVDNA，并初步探讨其临床意义。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 标本来源 75例肝炎患者为1998年1～10月在广西南宁市第四医院及北京市佑安医院的住院病人，肝炎的诊断符合1995年第5次全国传染病寄生虫病学术会议制定的诊断标准，其中男性45例，女性30例。血清标本为抽取患者静脉血，放置沉淀后吸取血清，保存于-20℃备检。7例肝组织为南宁市第四医院住院病人的肝穿刺活检组织，组织病理证实为肝炎。
1.2 材料 地高辛标记的TTVDNA探针(Dig-TTVDNA)由北京市肝炎研究所提供，供斑点杂交及原位杂交用的试剂盒为德国宝灵曼公司产品。
1.3 实验方法
1.3.1 斑点杂交 每份血清取100μl，用含蛋白酶K的裂解液消化，然后用酚、氯仿抽提，用冷无水乙醇沉淀核酸，经离心、干燥后每份再用20μl三蒸水溶解核酸，100℃变性后在醋酸纤维膜上点膜，此后步骤严格按宝灵曼公司的试剂盒的方法操作。阳性对照采用TTV阳性血清及PCR扩增阳性产物，阴性对照采用非特异性的鱼精DNA及PCR扩增阴性产物。阳性及阴性对照物由北京市肝炎研究所提供。
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1.3.2 原位杂交 石蜡包埋的肝组织中TTVDNA的原位杂交方法按文献[2]进行操作以预杂交液替代Dig-TTVDNA探针做为空白对照。阳性对照片由北京市肝炎研究所提供。
以上检测均于1998年底在北京市肝炎研究所完成。
2 结果
斑点杂交法检测75例肝炎患者血清，TTVDNA阳性19例，阳性率25.33%，见表1。在乙肝组检出TTV阳性的9例，原诊断为慢性乙肝及乙肝后肝硬化；在非甲～戊型肝炎组TTV阳性的7例中，5例表现为急性肝炎，2例为亚重肝(此2例HGV阴性)；在非甲非乙型肝炎组TTV阳性的3例。2例为非甲非乙非丙型(缺戊型指标)，1例为非甲非乙非戊型(缺丙型指标)，其中2例为急性肝炎。
表1 各肝病组TTVDNA检测结果 分组
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例数
阳性数
阳性率(%)
乙肝组
40
9
22.50
非甲～戊肝组
18
7
38.88
非甲非乙肝组
12
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3
25.00
甲肝组
3
0
0
酒精肝组
2
0
0
合计
75
19
25.33
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(*非甲非乙肝组为丙型或戊型指标不全者)
原位杂交法检测7例肝炎患者肝组织，TTVDNA阳性2例，阳性率为28.57%。TTVDNA均出现于细胞核内，可见胞核内出现均质的蓝紫色颗粒，阳性细胞在肝组织内呈弥漫分布。其中1例血清检查为非甲～戊型，肝组织免疫组化检查HBsAg(-)、HBcAg(-)，另1例合并感染HBV，肝组织免疫组化HBsAg(+)、HBcAg(+)。
3 讨论
继1997年日本学者首次报道发现TTV后，1998年我国学者周育森在国内首先检测并报道了中国人TTV的基因序列[3]，进而制备了TTVDNA探针。目前我国一些作者认为TTV可能是输血后肝炎的病因之一[4]，部分非甲～庚型肝炎可能与TTV相关[5]。
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本文结果显示，TTV在各组肝炎病人血清中总检出率是25.3%，而在非甲～戊型肝炎患者中检出率最高(38.88%)，在2例肝炎病人肝组织中检出TTVDNA，提示TTV可能是一种嗜肝病毒，是一部分非甲～戊型肝炎的病原。许德军等[6]认为，在不明原因肝炎患者肝组织中TTVDNA的检出表明TTV为一种新型的肝炎病毒，并能引起临床和病理改变。孟庆华等[7]认为，TTV是部分非甲～戊和庚型肝炎病人的致病因子，也可能是促进肝衰竭的重要因素之一。本文中TTV阳性的2例亚重肝病人为非甲～庚型，故推断TTV可致重度肝损害。
本文TTV阳性的非甲～戊型肝炎共7例，均表现为急性肝炎及亚重肝，检出TTV阳性的慢性肝炎病人都是原有慢性乙肝及乙肝后肝硬化，本文认为，TTV多引起急性肝炎。但孟庆华等[7]认为TTV可能是导致肝炎慢性化的病原之一。本文TTVDNA阳性的肝炎患者的临床表现以乏力、食欲下降、恶心、黄疸等为主要症状，与其他病毒性肝炎的临床表现无异。
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马为民等报道，乙型和丙型肝炎常重叠TTV感染[8]。本文乙肝组40例中检出9例TTVDNA阳性，而1例乙肝病人肝组织中检出TTVDNA，说明乙肝可以重叠感染TTV。本文用原位杂交法在肝细胞检出TTVDNA，但因所检测的样本数太少，仍不能有力说明肝内TTV的感染与病变程度的关系。
参考文献
1 Nishizaw T.Okamoto H,konishi K,et al.A novel DNA virus(TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatits of unknown etiology.Biochem Biophys Res Commun.1997,24(1):92
2 阎惠平，郎振为，黄德庄，等.地高辛素标记探针原位杂交法检测肝和肝外组织中乙型肝炎病毒DNA.中华内科杂志，1994，33(3)：168
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3 周育森，何忠平，董京芳，等.中国人TTV部分基因克隆及序列测定.军事医学科学院院刊，1998，22：107
4 黄呈辉，周育森，陈汝光，等.献血员中TTV病毒DNA检测及部分基因序列分析.中华实验和临床病毒学杂志，1998，12(3)：237
5 周伯平，马为民，王大生，等.深圳地区不同人群TTV感染情况的调查.中华实验和临床病毒学杂志，1998，12(3)：241
6 许德军，郎振为，王国玉，等.肝组织中TTVDNA原位检测及临床病理分析.胃肠病学和肝病学杂志，1998，7(3)：224
7 孟庆华，周育森，刘德恭，等.TTV在肝炎患者中的检测及临床意义探讨.中华实验和临床病毒学杂志，1998，12(2)：111
8 马为民，周伯平，王大生，等.一种新的可经输血传播病毒(TTV)的分子流行病学研究.中华肝脏病杂志，1998，6(3)：167
1999-04-21收稿。1999-06-10修回。, http://www.100md.com
单位：鲁文清 王金科 广西南宁市第四医院(530023)；阎惠平 北京市肝炎研究所
关键词：TTV；斑点杂交；原位杂交；肝炎；
广西预防医学990412
摘 要 用斑点杂交和原位杂交方法分别检测肝炎患者血清和肝组织内TTVDNA。结果显示TTVDNA斑点杂交法阳性率为25.33%(19/75)，原位杂交法阳性率为28.57%(2/7)，提示TTV可能是一种嗜肝病毒并对其临床意义进行讨论。
1997年日本学者Nishizawa T首先报道从输血后肝炎病人血清中检出一种与输血后肝炎相关的新型病毒，命名为TTV(transfusion transmitted virus)[1]。本文报道了用斑点杂交和原位杂交方法检测肝炎患者血清和肝组织中的TTVDNA，并初步探讨其临床意义。
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1 材料与方法
1.1 标本来源 75例肝炎患者为1998年1～10月在广西南宁市第四医院及北京市佑安医院的住院病人，肝炎的诊断符合1995年第5次全国传染病寄生虫病学术会议制定的诊断标准，其中男性45例，女性30例。血清标本为抽取患者静脉血，放置沉淀后吸取血清，保存于-20℃备检。7例肝组织为南宁市第四医院住院病人的肝穿刺活检组织，组织病理证实为肝炎。
1.2 材料 地高辛标记的TTVDNA探针(Dig-TTVDNA)由北京市肝炎研究所提供，供斑点杂交及原位杂交用的试剂盒为德国宝灵曼公司产品。
1.3 实验方法
1.3.1 斑点杂交 每份血清取100μl，用含蛋白酶K的裂解液消化，然后用酚、氯仿抽提，用冷无水乙醇沉淀核酸，经离心、干燥后每份再用20μl三蒸水溶解核酸，100℃变性后在醋酸纤维膜上点膜，此后步骤严格按宝灵曼公司的试剂盒的方法操作。阳性对照采用TTV阳性血清及PCR扩增阳性产物，阴性对照采用非特异性的鱼精DNA及PCR扩增阴性产物。阳性及阴性对照物由北京市肝炎研究所提供。
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1.3.2 原位杂交 石蜡包埋的肝组织中TTVDNA的原位杂交方法按文献[2]进行操作以预杂交液替代Dig-TTVDNA探针做为空白对照。阳性对照片由北京市肝炎研究所提供。
以上检测均于1998年底在北京市肝炎研究所完成。
2 结果
斑点杂交法检测75例肝炎患者血清，TTVDNA阳性19例，阳性率25.33%，见表1。在乙肝组检出TTV阳性的9例，原诊断为慢性乙肝及乙肝后肝硬化；在非甲～戊型肝炎组TTV阳性的7例中，5例表现为急性肝炎，2例为亚重肝(此2例HGV阴性)；在非甲非乙型肝炎组TTV阳性的3例。2例为非甲非乙非丙型(缺戊型指标)，1例为非甲非乙非戊型(缺丙型指标)，其中2例为急性肝炎。
表1 各肝病组TTVDNA检测结果 分组
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例数
阳性数
阳性率(%)
乙肝组
40
9
22.50
非甲～戊肝组
18
7
38.88
非甲非乙肝组
12
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3
25.00
甲肝组
3
0
0
酒精肝组
2
0
0
合计
75
19
25.33
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(*非甲非乙肝组为丙型或戊型指标不全者)
原位杂交法检测7例肝炎患者肝组织，TTVDNA阳性2例，阳性率为28.57%。TTVDNA均出现于细胞核内，可见胞核内出现均质的蓝紫色颗粒，阳性细胞在肝组织内呈弥漫分布。其中1例血清检查为非甲～戊型，肝组织免疫组化检查HBsAg(-)、HBcAg(-)，另1例合并感染HBV，肝组织免疫组化HBsAg(+)、HBcAg(+)。
3 讨论
继1997年日本学者首次报道发现TTV后，1998年我国学者周育森在国内首先检测并报道了中国人TTV的基因序列[3]，进而制备了TTVDNA探针。目前我国一些作者认为TTV可能是输血后肝炎的病因之一[4]，部分非甲～庚型肝炎可能与TTV相关[5]。
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本文结果显示，TTV在各组肝炎病人血清中总检出率是25.3%，而在非甲～戊型肝炎患者中检出率最高(38.88%)，在2例肝炎病人肝组织中检出TTVDNA，提示TTV可能是一种嗜肝病毒，是一部分非甲～戊型肝炎的病原。许德军等[6]认为，在不明原因肝炎患者肝组织中TTVDNA的检出表明TTV为一种新型的肝炎病毒，并能引起临床和病理改变。孟庆华等[7]认为，TTV是部分非甲～戊和庚型肝炎病人的致病因子，也可能是促进肝衰竭的重要因素之一。本文中TTV阳性的2例亚重肝病人为非甲～庚型，故推断TTV可致重度肝损害。
本文TTV阳性的非甲～戊型肝炎共7例，均表现为急性肝炎及亚重肝，检出TTV阳性的慢性肝炎病人都是原有慢性乙肝及乙肝后肝硬化，本文认为，TTV多引起急性肝炎。但孟庆华等[7]认为TTV可能是导致肝炎慢性化的病原之一。本文TTVDNA阳性的肝炎患者的临床表现以乏力、食欲下降、恶心、黄疸等为主要症状，与其他病毒性肝炎的临床表现无异。
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马为民等报道，乙型和丙型肝炎常重叠TTV感染[8]。本文乙肝组40例中检出9例TTVDNA阳性，而1例乙肝病人肝组织中检出TTVDNA，说明乙肝可以重叠感染TTV。本文用原位杂交法在肝细胞检出TTVDNA，但因所检测的样本数太少，仍不能有力说明肝内TTV的感染与病变程度的关系。
参考文献
1 Nishizaw T.Okamoto H,konishi K,et al.A novel DNA virus(TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatits of unknown etiology.Biochem Biophys Res Commun.1997,24(1):92
2 阎惠平，郎振为，黄德庄，等.地高辛素标记探针原位杂交法检测肝和肝外组织中乙型肝炎病毒DNA.中华内科杂志，1994，33(3)：168
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3 周育森，何忠平，董京芳，等.中国人TTV部分基因克隆及序列测定.军事医学科学院院刊，1998，22：107
4 黄呈辉，周育森，陈汝光，等.献血员中TTV病毒DNA检测及部分基因序列分析.中华实验和临床病毒学杂志，1998，12(3)：237
5 周伯平，马为民，王大生，等.深圳地区不同人群TTV感染情况的调查.中华实验和临床病毒学杂志，1998，12(3)：241
6 许德军，郎振为，王国玉，等.肝组织中TTVDNA原位检测及临床病理分析.胃肠病学和肝病学杂志，1998，7(3)：224
7 孟庆华，周育森，刘德恭，等.TTV在肝炎患者中的检测及临床意义探讨.中华实验和临床病毒学杂志，1998，12(2)：111
8 马为民，周伯平，王大生，等.一种新的可经输血传播病毒(TTV)的分子流行病学研究.中华肝脏病杂志，1998，6(3)：167
1999-04-21收稿。1999-06-10修回。, http://www.100md.com