人白细胞介素-15 cDNA在中国仓鼠卵巢细胞中的高效稳定表达△
作者：薛莉 崔莲仙 何维 巴德年
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所免疫学室， 北京 100005
关键词：白细胞介素-15；中国仓鼠卵巢细胞；真核基因表达
人白细胞介素 摘要 目的 在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达人白细胞介素-15(IL-15)，为IL-15的功能研究提供有利条件。 方法 采用PCR技术扩增人IL-15编码区cDNA片段，构建重组真核表达载体，再以脂质体法转染至CHO细胞进行表达，鉴定表达产物的生物学活性。结果 共获得8株高效表达IL-15的阳性克隆，其平均活性为(318.54±32.72)U/(106 cells.d)，稳定传代6个月后仍保持其表达活性。结论 人IL-15 cDNA在CHO细胞中获得高效稳定表达。
中图号 R392.12
, 百拇医药
Efficient, Stable Expression of Human Interleukin-15 cDNA in
Chinese Hamster Oval Cells
Xue Li Cui Lianxian He Wei# Ba Denian
(Department of Immunology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS and PUMC, Beijing 100005)
Objective To express the human interleukin 15(IL-15) cDNA in Chinese hamster oval(CHO) cells, which would benefit to the further research in the biological activities and the clinical applications of IL-15. Methods The entire human interleukin-15(IL-15) coding region, deleted of all the uncoding fragments, was amplified by PCR. The amplified products were subcloned into the EcoRⅠ and XbaⅠ sites of the pcDNA3 plasmid, forming the recombinant eukaryotic expressing vector, pcDNA3-IL-15, which was then identified by the Bg1Ⅱ enzymatic digestion, PCR amplification and the sequence analysis. The construct was transfected into CHO cells by means of lipofectamine, followed by a series of determinations to screen the positive cell colonies, such as RT-PCR, SDS-PAGE, ELISA and CTLL-2 proliferation assay. Results 8 positive cell colonies highly expressed human IL-15 were obtained after G418 selection. The bioassay showed that the mean activities of the supernatants from the CHO-IL-15 cells were (318.54±32.76) U/(106 cells.d) and maintained stable after 6 months culture. Conclusions Human IL-15 cDNA was expressed efficiently and persistently in CHO cells.
, 百拇医药
Key words interleukin-15; Chinese hamster oval cell; eukaryotic gene expression
研究表明，IL-15的生物学作用与IL-2相似，如诱导T、B和NK细胞增殖分化，诱导LAK/CTL活性，发挥抗感染、抗肿瘤作用等[1～3]。IL-15可在多种组织细胞表达，虽然原核细胞也能够高效表达蛋白质，但因其缺乏真核生物所具有的转录、翻译和翻译后等多级水平调控及修饰机制，使其应用受限。本研究采用哺乳类动物细胞表达体系对IL-15基因进行表达，以期产生更接近于体内天然状态的具有糖基化的人IL-15蛋白，为深入开展IL-15的生物学功能及临床应用研究提供条件。
1 材料和方法
质粒、菌种和细胞 质粒pBscript-SK-IL-15(含人IL-15 cDNA包括非编码区在内的574 bp序列)由本组构建，真核表达质粒pcDNA3由欧洲分子生物学实验室(EMBL)张友明博士惠赠，DH5α菌种为本室传代保存，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)由军事医学科学院赵明博士惠赠。
, 百拇医药
酶及主要生化试剂 限制性内切酶EcoRⅠ、XbaⅠ和T4 DNA连接酶为德国Boehringer Mannheim公司产品，脂质体(lipofectamine)、Trizol试剂和RPMI-1640、CHO-S-SFMⅡ培养基均为Gibco BRL公司产品，IL-15纯品由英国NIBSC惠赠，兔抗人IL-15抗体购自PeproTech公司，生物素标记羊抗兔IgG和HRP标记链霉卵白素购自北京中山公司、噻唑蓝(MTT)为Sigma公司产品，其它试剂均为进口或国产分析纯级产品。
PCR扩增 以P1：5′-GTACGAATTCATGAGAATTTCGAAACCACATTT-3′、P2：5′-TCGATCTAGATCAAGAAGTGTTGATGAACATTT-3′作为引物，以pBs cript-SK-IL-15为模板，在50 μl体系内进行扩增。反应条件：94℃ 3 min，然后94℃ 50 s, 61℃ 50 s, 72℃ 50 s, 循环30次，最后72℃延伸5 min。
, 百拇医药
重组表达质粒pcDNA3-IL-15的构建及鉴定 质粒的提取、酶解、纯化，DNA片段的体外连接、转化，均按文献[4]进行。重组质粒以BglⅡ酶解和PCR扩增鉴定，并进行DNA序列测定分析。
脂质体法转染CHO细胞 CHO细胞(5×105个)接种于6孔细胞培养板内，37℃、5%CO2培养，待细胞呈50%～70%融合时，以脂质体介导转染。
细胞总RNA提取及RT-PCR扩增 参照TrizolTM试剂盒说明书，提取各G418抗性细胞克隆总RNA，以Oligo(dT)为引物在AMV逆转录酶作用下反转录获得cDNA第1链，再以此作为模板，以P1，P2为引物进行PCR扩增。
SDS-PAGE检测 收集细胞上清，进行SDS-PAGE和蛋白银染分析[4]。
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IL-15活性测定 采用CTLL-2细胞依赖株增殖反应测定法[5]，每种浓度设3个复孔，实验重复3次。以IL-15标准品或待测样品中最大吸光度值作为100%，其它测定值与之相除，得出每一吸光度值所对应的百分比，然后以此百分比做纵坐标，以稀释度为横坐标，用对数正态概率纸作图。求出样品和标准品吸光度百分比为50%时的稀释倍数，再计算出活性。
ELISA法检测IL-15 用PCR扩增的阳性细胞克隆的培养上清和一定浓度的IL-15标准品包板，BSA封闭后，加入兔抗人IL-15抗体，湿盒温育，再依次加入生物素标记的羊抗兔IgG和HRP标记的链霉卵白素，分别温育后，以邻苯二胺显色。
统计学处理 采用方差分析处理数据。
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2 结果
pcDNA3-IL-15重组表达质粒的构建和鉴定结果 以pBs cript-SK-IL-15为模板，经PCR扩增出1条486 bp IL-15 cDNA片段(图1)。该片段与pcDNA3质粒定向连接后，构成pcDNA3-IL-15重组质粒。pcDNA3-IL-15经BglⅡ单酶解，获得1.1 kb和4.7 kb两个片段，而pcDNA3对照经酶解仅出现一条线性带(图2)。再以pcDNA3-IL-15作为模板，通过PCR亦扩增出一条约486 bp的片段(图略)。同时，DNA序列测定结果表明，该序列与预计相符。
图 1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig 1 Agarose electrophoresis of PCR products
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1. pBR322/HinfⅠ Marker; 2,3: PCR products
图 2 pcDNA3-IL-15重组质粒的酶切图谱分析
Fig 2 Restriction analysis of pcDNA3-IL-15 plasmid
1. λDNA/Hind Ⅲ Marker; 2. pcDNA3-IL-15/Bg1 Ⅱ; 3.pcDNA3-IL-15;4.pcDNA3/Bg1 Ⅱ; 5. pcDNA3
CHO细胞的转染及重组人IL-15表达 pcDNA3-IL-15质粒转入CHO细胞后，经G418筛选，获得8株抗性克隆，称为CHO-IL-15细胞。分别提取这8株细胞的总RNA，经RT-PCR，均扩增出特异的486 bp IL-15 cDNA片段(图3)。
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图 3 CHO-IL-15细胞克隆的RT-PCR分析
Fig 3 RT-PCR analysis of IL-15 expression in the CHO-IL-15 cell colonies
1. pBR322/HinfⅠ Marker; 2,3,4,5,6,7,8,9: RT-PCR products; 10. negative control
SDS-PAGE和ELISA结果 CHO-IL-15细胞无血清培养上清的SDS-PAGE分析显示，在相对分子质量约14 000～15 000处出现一条区带，而空载对照组CHO-neo细胞上清未见任何条带(图4)。ELISA实验证实，CHO-IL-15上清与抗人IL-15抗体发生特异结合，出现明显的酶联显色反应，上清内rIL-15的平均表达水平为(3.01±0.238)μg/ml。
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图 4 表达产物的SDS-PAGE分析
Fig 4 SDS-PAGE analysis of the supernatants from the CHO-IL-15 Cells
1. Low protein molecular weight standard; 2,3: CHO-IL15; 4. CHO-neo
重组IL-15生物活性测定结果 CTLL-2细胞依赖株增殖测定的结果表明，各株CHO-IL-15细胞培养上清内的IL-15生物学活性平均为(318.54±32.76)U/(106 cells.d)。各阳性克隆株分别传代6个月，经冻存、复苏3次后均仍保持对G418的稳定抗性和IL-15的持续表达，0、3、6个月3次生物活性测定结果显示，未见活性明显下降(P>0.05)。各克隆细胞株断续培养、冻存和复苏17个月后，Northern Blot检测结果表明，至少有5种细胞克隆即CHO-IL-15 A、B、C、D、E仍保留IL-15 mRNA转录本。
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3 讨论
人IL-15是一种新近发现的细胞因子，其cDNA含有316 bp 5′非编码区，400 bp 3′非编码区和486 bp的开放读码框架，编码N末端48个氨基酸组成的信号肽和114个氨基酸组成的成熟蛋白[6]。据文献报道，人IL-15 5′非编码区存在10个AUG密码，去除这些上游AUG将有助于mRNA转录效率的提高[7]。所以，本研究从编码信号肽的AUG起始，设计PCR引物，扩增包括信号肽和成熟蛋白在内的486 bp IL-15 cDNA。IL-15 cDNA含有一个特异的Bg1Ⅱ酶切位点，通过对PCR扩增产物的Bg1Ⅱ单酶切可以初步鉴定其序列的正确性，结果获得182 bp和306 bp两个片段，与理论估计值相符。
pcDNA3是一种公认的效率较高的质粒型真核表达载体，受控于人巨细胞病毒(CMV)启动子。IL-15 cDNA经定向克隆与pcDNA3体外重组后，首先将其转染COS-7细胞作瞬时表达，在证实其确有表达后，再转染CHO细胞。经过G418抗性筛选，共获得8株阳性克隆。RT-PCR、SDS-PAGE和ELISA检测分析分别显示了IL-15 mRNA在CHO细胞中的转录和有效表达。 为确定经ELISA定量的表达产物的生物学活性，本实验采用CTLL-2细胞增殖法对无血清培养上清进行检测，发现IL-15的平均表达活性为(318.54±32.76)U/(106 cells.d)，且连续传代6个月，经冻存、复苏3次后，各克隆表达活性未见明显变化，再经断续培养、冻存和复苏17个月后，至少有5个细胞克隆内仍保留IL-15 mRNA转录本；证明了经筛选得到的CHO抗性细胞株能够稳定表达IL-15。有关人IL-15基因在CHO细胞中的表达，尚未见报道。本研究结果表明，人IL-15在CHO细胞中已获高效稳定表达。上述结果为进一步研究IL-15的生物学功能和临床应用提供了有利的条件。
, http://www.100md.com
△国家教委博士点基金(96002345)资助；#通讯作者
参考文献
1 Grabstein Kh, Eisenman J, Shanebeck K, et al. Cloning of a T cell growth factor that interacts with the β chain of the interleukin-2 receptor. Science, 1994, 264: 965～968
2 Kanegane H, Tosato, Giovanna. Activation of naive and memory T cells by interleukin-15. Blood, 1996, 88:230～235
3 Jullien D, Sieling PA, Uyemura K, et al. IL-15, an immunomodulator of T cell responses in intracellular infection. J Immunol, 1997, 158: 800～806
, 百拇医药
4 J. 萨姆布鲁克， EF. 弗里奇， T. 曼尼阿蒂斯. 分子克隆实验指南. 第二版. 北京： 科学出版社，1996
5 巴德年. 当代免疫学技术与应用. 北京： 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1998.221
6 Anderson DM, Johnson L, Glaccum MB, et al. Chromosomal assignment and genomic structure of IL15. Genomics, 1995, 25:701～706
7 Bamford RN, Battiata AP, Burton J, et al. Interleukin (IL) 15/IL-T production by the adult T-cell leukemia cell line HuT-102 is associated with a human T-cell lymphotrophic virus type I R region/IL-15 fusion message that lacks many upstream AUGS that normally attenuate IL-15 mRNA translation. Proc Nat1 Acad Sci USA, 1996, 93:2897～2902
, 百拇医药
(1998-04-20收稿)
人白细胞介素-15 cDNA在中国仓鼠卵巢细胞
中的高效稳定表达△
薛莉 崔莲仙 何维 巴德年
摘要 目的 在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达人白细胞介素-15(IL-15)，为IL-15的功能研究提供有利条件。 方法 采用PCR技术扩增人IL-15编码区cDNA片段，构建重组真核表达载体，再以脂质体法转染至CHO细胞进行表达，鉴定表达产物的生物学活性。结果 共获得8株高效表达IL-15的阳性克隆，其平均活性为(318.54±32.72)U/(106 cells.d)，稳定传代6个月后仍保持其表达活性。结论 人IL-15 cDNA在CHO细胞中获得高效稳定表达。
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关键词 白细胞介素-15 中国仓鼠卵巢细胞 真核基因表达
中图号 R392.12
Efficient, Stable Expression of Human Interleukin-15 cDNA in
Chinese Hamster Oval Cells
Xue Li Cui Lianxian He Wei# Ba Denian
(Department of Immunology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS and PUMC, Beijing 100005)
Objective To express the human interleukin 15(IL-15) cDNA in Chinese hamster oval(CHO) cells, which would benefit to the further research in the biological activities and the clinical applications of IL-15. Methods The entire human interleukin-15(IL-15) coding region, deleted of all the uncoding fragments, was amplified by PCR. The amplified products were subcloned into the EcoRⅠ and XbaⅠ sites of the pcDNA3 plasmid, forming the recombinant eukaryotic expressing vector, pcDNA3-IL-15, which was then identified by the Bg1Ⅱ enzymatic digestion, PCR amplification and the sequence analysis. The construct was transfected into CHO cells by means of lipofectamine, followed by a series of determinations to screen the positive cell colonies, such as RT-PCR, SDS-PAGE, ELISA and CTLL-2 proliferation assay. Results 8 positive cell colonies highly expressed human IL-15 were obtained after G418 selection. The bioassay showed that the mean activities of the supernatants from the CHO-IL-15 cells were (318.54±32.76) U/(106 cells.d) and maintained stable after 6 months culture. Conclusions Human IL-15 cDNA was expressed efficiently and persistently in CHO cells.
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Key words interleukin-15; Chinese hamster oval cell; eukaryotic gene expression
研究表明，IL-15的生物学作用与IL-2相似，如诱导T、B和NK细胞增殖分化，诱导LAK/CTL活性，发挥抗感染、抗肿瘤作用等[1～3]。IL-15可在多种组织细胞表达，虽然原核细胞也能够高效表达蛋白质，但因其缺乏真核生物所具有的转录、翻译和翻译后等多级水平调控及修饰机制，使其应用受限。本研究采用哺乳类动物细胞表达体系对IL-15基因进行表达，以期产生更接近于体内天然状态的具有糖基化的人IL-15蛋白，为深入开展IL-15的生物学功能及临床应用研究提供条件。
1 材料和方法
质粒、菌种和细胞 质粒pBscript-SK-IL-15(含人IL-15 cDNA包括非编码区在内的574 bp序列)由本组构建，真核表达质粒pcDNA3由欧洲分子生物学实验室(EMBL)张友明博士惠赠，DH5α菌种为本室传代保存，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)由军事医学科学院赵明博士惠赠。
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酶及主要生化试剂 限制性内切酶EcoRⅠ、XbaⅠ和T4 DNA连接酶为德国Boehringer Mannheim公司产品，脂质体(lipofectamine)、Trizol试剂和RPMI-1640、CHO-S-SFMⅡ培养基均为Gibco BRL公司产品，IL-15纯品由英国NIBSC惠赠，兔抗人IL-15抗体购自PeproTech公司，生物素标记羊抗兔IgG和HRP标记链霉卵白素购自北京中山公司、噻唑蓝(MTT)为Sigma公司产品，其它试剂均为进口或国产分析纯级产品。
PCR扩增 以P1：5′-GTACGAATTCATGAGAATTTCGAAACCACATTT-3′、P2：5′-TCGATCTAGATCAAGAAGTGTTGATGAACATTT-3′作为引物，以pBs cript-SK-IL-15为模板，在50 μl体系内进行扩增。反应条件：94℃ 3 min，然后94℃ 50 s, 61℃ 50 s, 72℃ 50 s, 循环30次，最后72℃延伸5 min。
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重组表达质粒pcDNA3-IL-15的构建及鉴定 质粒的提取、酶解、纯化，DNA片段的体外连接、转化，均按文献[4]进行。重组质粒以BglⅡ酶解和PCR扩增鉴定，并进行DNA序列测定分析。
脂质体法转染CHO细胞 CHO细胞(5×105个)接种于6孔细胞培养板内，37℃、5%CO2培养，待细胞呈50%～70%融合时，以脂质体介导转染。
细胞总RNA提取及RT-PCR扩增 参照TrizolTM试剂盒说明书，提取各G418抗性细胞克隆总RNA，以Oligo(dT)为引物在AMV逆转录酶作用下反转录获得cDNA第1链，再以此作为模板，以P1，P2为引物进行PCR扩增。
SDS-PAGE检测 收集细胞上清，进行SDS-PAGE和蛋白银染分析[4]。
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IL-15活性测定 采用CTLL-2细胞依赖株增殖反应测定法[5]，每种浓度设3个复孔，实验重复3次。以IL-15标准品或待测样品中最大吸光度值作为100%，其它测定值与之相除，得出每一吸光度值所对应的百分比，然后以此百分比做纵坐标，以稀释度为横坐标，用对数正态概率纸作图。求出样品和标准品吸光度百分比为50%时的稀释倍数，再计算出活性。
ELISA法检测IL-15 用PCR扩增的阳性细胞克隆的培养上清和一定浓度的IL-15标准品包板，BSA封闭后，加入兔抗人IL-15抗体，湿盒温育，再依次加入生物素标记的羊抗兔IgG和HRP标记的链霉卵白素，分别温育后，以邻苯二胺显色。
统计学处理 采用方差分析处理数据。
, 百拇医药
2 结果
pcDNA3-IL-15重组表达质粒的构建和鉴定结果 以pBs cript-SK-IL-15为模板，经PCR扩增出1条486 bp IL-15 cDNA片段(图1)。该片段与pcDNA3质粒定向连接后，构成pcDNA3-IL-15重组质粒。pcDNA3-IL-15经BglⅡ单酶解，获得1.1 kb和4.7 kb两个片段，而pcDNA3对照经酶解仅出现一条线性带(图2)。再以pcDNA3-IL-15作为模板，通过PCR亦扩增出一条约486 bp的片段(图略)。同时，DNA序列测定结果表明，该序列与预计相符。
图 1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig 1 Agarose electrophoresis of PCR products
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1. pBR322/HinfⅠ Marker; 2,3: PCR products
图 2 pcDNA3-IL-15重组质粒的酶切图谱分析
Fig 2 Restriction analysis of pcDNA3-IL-15 plasmid
1. λDNA/Hind Ⅲ Marker; 2. pcDNA3-IL-15/Bg1 Ⅱ; 3.pcDNA3-IL-15;4.pcDNA3/Bg1 Ⅱ; 5. pcDNA3
CHO细胞的转染及重组人IL-15表达 pcDNA3-IL-15质粒转入CHO细胞后，经G418筛选，获得8株抗性克隆，称为CHO-IL-15细胞。分别提取这8株细胞的总RNA，经RT-PCR，均扩增出特异的486 bp IL-15 cDNA片段(图3)。
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图 3 CHO-IL-15细胞克隆的RT-PCR分析
Fig 3 RT-PCR analysis of IL-15 expression in the CHO-IL-15 cell colonies
1. pBR322/HinfⅠ Marker; 2,3,4,5,6,7,8,9: RT-PCR products; 10. negative control
SDS-PAGE和ELISA结果 CHO-IL-15细胞无血清培养上清的SDS-PAGE分析显示，在相对分子质量约14 000～15 000处出现一条区带，而空载对照组CHO-neo细胞上清未见任何条带(图4)。ELISA实验证实，CHO-IL-15上清与抗人IL-15抗体发生特异结合，出现明显的酶联显色反应，上清内rIL-15的平均表达水平为(3.01±0.238)μg/ml。
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图 4 表达产物的SDS-PAGE分析
Fig 4 SDS-PAGE analysis of the supernatants from the CHO-IL-15 Cells
1. Low protein molecular weight standard; 2,3: CHO-IL15; 4. CHO-neo
重组IL-15生物活性测定结果 CTLL-2细胞依赖株增殖测定的结果表明，各株CHO-IL-15细胞培养上清内的IL-15生物学活性平均为(318.54±32.76)U/(106 cells.d)。各阳性克隆株分别传代6个月，经冻存、复苏3次后均仍保持对G418的稳定抗性和IL-15的持续表达，0、3、6个月3次生物活性测定结果显示，未见活性明显下降(P>0.05)。各克隆细胞株断续培养、冻存和复苏17个月后，Northern Blot检测结果表明，至少有5种细胞克隆即CHO-IL-15 A、B、C、D、E仍保留IL-15 mRNA转录本。
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3 讨论
人IL-15是一种新近发现的细胞因子，其cDNA含有316 bp 5′非编码区，400 bp 3′非编码区和486 bp的开放读码框架，编码N末端48个氨基酸组成的信号肽和114个氨基酸组成的成熟蛋白[6]。据文献报道，人IL-15 5′非编码区存在10个AUG密码，去除这些上游AUG将有助于mRNA转录效率的提高[7]。所以，本研究从编码信号肽的AUG起始，设计PCR引物，扩增包括信号肽和成熟蛋白在内的486 bp IL-15 cDNA。IL-15 cDNA含有一个特异的Bg1Ⅱ酶切位点，通过对PCR扩增产物的Bg1Ⅱ单酶切可以初步鉴定其序列的正确性，结果获得182 bp和306 bp两个片段，与理论估计值相符。
pcDNA3是一种公认的效率较高的质粒型真核表达载体，受控于人巨细胞病毒(CMV)启动子。IL-15 cDNA经定向克隆与pcDNA3体外重组后，首先将其转染COS-7细胞作瞬时表达，在证实其确有表达后，再转染CHO细胞。经过G418抗性筛选，共获得8株阳性克隆。RT-PCR、SDS-PAGE和ELISA检测分析分别显示了IL-15 mRNA在CHO细胞中的转录和有效表达。 为确定经ELISA定量的表达产物的生物学活性，本实验采用CTLL-2细胞增殖法对无血清培养上清进行检测，发现IL-15的平均表达活性为(318.54±32.76)U/(106 cells.d)，且连续传代6个月，经冻存、复苏3次后，各克隆表达活性未见明显变化，再经断续培养、冻存和复苏17个月后，至少有5个细胞克隆内仍保留IL-15 mRNA转录本；证明了经筛选得到的CHO抗性细胞株能够稳定表达IL-15。有关人IL-15基因在CHO细胞中的表达，尚未见报道。本研究结果表明，人IL-15在CHO细胞中已获高效稳定表达。上述结果为进一步研究IL-15的生物学功能和临床应用提供了有利的条件。
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△国家教委博士点基金(96002345)资助；#通讯作者
作者单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所免疫学室， 北京 100005
参考文献
1 Grabstein Kh, Eisenman J, Shanebeck K, et al. Cloning of a T cell growth factor that interacts with the β chain of the interleukin-2 receptor. Science, 1994, 264: 965～968
2 Kanegane H, Tosato, Giovanna. Activation of naive and memory T cells by interleukin-15. Blood, 1996, 88:230～235
, 百拇医药
3 Jullien D, Sieling PA, Uyemura K, et al. IL-15, an immunomodulator of T cell responses in intracellular infection. J Immunol, 1997, 158: 800～806
4 J. 萨姆布鲁克， EF. 弗里奇， T. 曼尼阿蒂斯. 分子克隆实验指南. 第二版. 北京： 科学出版社，1996
5 巴德年. 当代免疫学技术与应用. 北京： 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1998.221
6 Anderson DM, Johnson L, Glaccum MB, et al. Chromosomal assignment and genomic structure of IL15. Genomics, 1995, 25:701～706
, 百拇医药
7 Bamford RN, Battiata AP, Burton J, et al. Interleukin (IL) 15/IL-T production by the adult T-cell leukemia cell line HuT-102 is associated with a human T-cell lymphotrophic virus type I R region/IL-15 fusion message that lacks many upstream AUGS that normally attenuate IL-15 mRNA translation. Proc Nat1 Acad Sci USA, 1996, 93:2897～2902
(1998-04-20收稿)
人白细胞介素-15 cDNA在中国仓鼠卵巢细胞
中的高效稳定表达△
, http://www.100md.com
薛莉 崔莲仙 何维 巴德年
摘要 目的 在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达人白细胞介素-15(IL-15)，为IL-15的功能研究提供有利条件。 方法 采用PCR技术扩增人IL-15编码区cDNA片段，构建重组真核表达载体，再以脂质体法转染至CHO细胞进行表达，鉴定表达产物的生物学活性。结果 共获得8株高效表达IL-15的阳性克隆，其平均活性为(318.54±32.72)U/(106 cells.d)，稳定传代6个月后仍保持其表达活性。结论 人IL-15 cDNA在CHO细胞中获得高效稳定表达。
关键词 白细胞介素-15 中国仓鼠卵巢细胞 真核基因表达
中图号 R392.12
Efficient, Stable Expression of Human Interleukin-15 cDNA in
, 百拇医药
Chinese Hamster Oval Cells
Xue Li Cui Lianxian He Wei# Ba Denian
(Department of Immunology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS and PUMC, Beijing 100005)
Objective To express the human interleukin 15(IL-15) cDNA in Chinese hamster oval(CHO) cells, which would benefit to the further research in the biological activities and the clinical applications of IL-15. Methods The entire human interleukin-15(IL-15) coding region, deleted of all the uncoding fragments, was amplified by PCR. The amplified products were subcloned into the EcoRⅠ and XbaⅠ sites of the pcDNA3 plasmid, forming the recombinant eukaryotic expressing vector, pcDNA3-IL-15, which was then identified by the Bg1Ⅱ enzymatic digestion, PCR amplification and the sequence analysis. The construct was transfected into CHO cells by means of lipofectamine, followed by a series of determinations to screen the positive cell colonies, such as RT-PCR, SDS-PAGE, ELISA and CTLL-2 proliferation assay. Results 8 positive cell colonies highly expressed human IL-15 were obtained after G418 selection. The bioassay showed that the mean activities of the supernatants from the CHO-IL-15 cells were (318.54±32.76) U/(106 cells.d) and maintained stable after 6 months culture. Conclusions Human IL-15 cDNA was expressed efficiently and persistently in CHO cells.
, 百拇医药
Key words interleukin-15; Chinese hamster oval cell; eukaryotic gene expression
研究表明，IL-15的生物学作用与IL-2相似，如诱导T、B和NK细胞增殖分化，诱导LAK/CTL活性，发挥抗感染、抗肿瘤作用等[1～3]。IL-15可在多种组织细胞表达，虽然原核细胞也能够高效表达蛋白质，但因其缺乏真核生物所具有的转录、翻译和翻译后等多级水平调控及修饰机制，使其应用受限。本研究采用哺乳类动物细胞表达体系对IL-15基因进行表达，以期产生更接近于体内天然状态的具有糖基化的人IL-15蛋白，为深入开展IL-15的生物学功能及临床应用研究提供条件。
1 材料和方法
质粒、菌种和细胞 质粒pBscript-SK-IL-15(含人IL-15 cDNA包括非编码区在内的574 bp序列)由本组构建，真核表达质粒pcDNA3由欧洲分子生物学实验室(EMBL)张友明博士惠赠，DH5α菌种为本室传代保存，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)由军事医学科学院赵明博士惠赠。
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酶及主要生化试剂 限制性内切酶EcoRⅠ、XbaⅠ和T4 DNA连接酶为德国Boehringer Mannheim公司产品，脂质体(lipofectamine)、Trizol试剂和RPMI-1640、CHO-S-SFMⅡ培养基均为Gibco BRL公司产品，IL-15纯品由英国NIBSC惠赠，兔抗人IL-15抗体购自PeproTech公司，生物素标记羊抗兔IgG和HRP标记链霉卵白素购自北京中山公司、噻唑蓝(MTT)为Sigma公司产品，其它试剂均为进口或国产分析纯级产品。
PCR扩增 以P1：5′-GTACGAATTCATGAGAATTTCGAAACCACATTT-3′、P2：5′-TCGATCTAGATCAAGAAGTGTTGATGAACATTT-3′作为引物，以pBs cript-SK-IL-15为模板，在50 μl体系内进行扩增。反应条件：94℃ 3 min，然后94℃ 50 s, 61℃ 50 s, 72℃ 50 s, 循环30次，最后72℃延伸5 min。
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重组表达质粒pcDNA3-IL-15的构建及鉴定 质粒的提取、酶解、纯化，DNA片段的体外连接、转化，均按文献[4]进行。重组质粒以BglⅡ酶解和PCR扩增鉴定，并进行DNA序列测定分析。
脂质体法转染CHO细胞 CHO细胞(5×105个)接种于6孔细胞培养板内，37℃、5%CO2培养，待细胞呈50%～70%融合时，以脂质体介导转染。
细胞总RNA提取及RT-PCR扩增 参照TrizolTM试剂盒说明书，提取各G418抗性细胞克隆总RNA，以Oligo(dT)为引物在AMV逆转录酶作用下反转录获得cDNA第1链，再以此作为模板，以P1，P2为引物进行PCR扩增。
SDS-PAGE检测 收集细胞上清，进行SDS-PAGE和蛋白银染分析[4]。
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IL-15活性测定 采用CTLL-2细胞依赖株增殖反应测定法[5]，每种浓度设3个复孔，实验重复3次。以IL-15标准品或待测样品中最大吸光度值作为100%，其它测定值与之相除，得出每一吸光度值所对应的百分比，然后以此百分比做纵坐标，以稀释度为横坐标，用对数正态概率纸作图。求出样品和标准品吸光度百分比为50%时的稀释倍数，再计算出活性。
ELISA法检测IL-15 用PCR扩增的阳性细胞克隆的培养上清和一定浓度的IL-15标准品包板，BSA封闭后，加入兔抗人IL-15抗体，湿盒温育，再依次加入生物素标记的羊抗兔IgG和HRP标记的链霉卵白素，分别温育后，以邻苯二胺显色。
统计学处理 采用方差分析处理数据。
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2 结果
pcDNA3-IL-15重组表达质粒的构建和鉴定结果 以pBs cript-SK-IL-15为模板，经PCR扩增出1条486 bp IL-15 cDNA片段(图1)。该片段与pcDNA3质粒定向连接后，构成pcDNA3-IL-15重组质粒。pcDNA3-IL-15经BglⅡ单酶解，获得1.1 kb和4.7 kb两个片段，而pcDNA3对照经酶解仅出现一条线性带(图2)。再以pcDNA3-IL-15作为模板，通过PCR亦扩增出一条约486 bp的片段(图略)。同时，DNA序列测定结果表明，该序列与预计相符。
图 1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig 1 Agarose electrophoresis of PCR products
, 百拇医药
1. pBR322/HinfⅠ Marker; 2,3: PCR products
图 2 pcDNA3-IL-15重组质粒的酶切图谱分析
Fig 2 Restriction analysis of pcDNA3-IL-15 plasmid
1. λDNA/Hind Ⅲ Marker; 2. pcDNA3-IL-15/Bg1 Ⅱ; 3.pcDNA3-IL-15;4.pcDNA3/Bg1 Ⅱ; 5. pcDNA3
CHO细胞的转染及重组人IL-15表达 pcDNA3-IL-15质粒转入CHO细胞后，经G418筛选，获得8株抗性克隆，称为CHO-IL-15细胞。分别提取这8株细胞的总RNA，经RT-PCR，均扩增出特异的486 bp IL-15 cDNA片段(图3)。
, 百拇医药
图 3 CHO-IL-15细胞克隆的RT-PCR分析
Fig 3 RT-PCR analysis of IL-15 expression in the CHO-IL-15 cell colonies
1. pBR322/HinfⅠ Marker; 2,3,4,5,6,7,8,9: RT-PCR products; 10. negative control
SDS-PAGE和ELISA结果 CHO-IL-15细胞无血清培养上清的SDS-PAGE分析显示，在相对分子质量约14 000～15 000处出现一条区带，而空载对照组CHO-neo细胞上清未见任何条带(图4)。ELISA实验证实，CHO-IL-15上清与抗人IL-15抗体发生特异结合，出现明显的酶联显色反应，上清内rIL-15的平均表达水平为(3.01±0.238)μg/ml。
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图 4 表达产物的SDS-PAGE分析
Fig 4 SDS-PAGE analysis of the supernatants from the CHO-IL-15 Cells
1. Low protein molecular weight standard; 2,3: CHO-IL15; 4. CHO-neo
重组IL-15生物活性测定结果 CTLL-2细胞依赖株增殖测定的结果表明，各株CHO-IL-15细胞培养上清内的IL-15生物学活性平均为(318.54±32.76)U/(106 cells.d)。各阳性克隆株分别传代6个月，经冻存、复苏3次后均仍保持对G418的稳定抗性和IL-15的持续表达，0、3、6个月3次生物活性测定结果显示，未见活性明显下降(P>0.05)。各克隆细胞株断续培养、冻存和复苏17个月后，Northern Blot检测结果表明，至少有5种细胞克隆即CHO-IL-15 A、B、C、D、E仍保留IL-15 mRNA转录本。
, 百拇医药
3 讨论
人IL-15是一种新近发现的细胞因子，其cDNA含有316 bp 5′非编码区，400 bp 3′非编码区和486 bp的开放读码框架，编码N末端48个氨基酸组成的信号肽和114个氨基酸组成的成熟蛋白[6]。据文献报道，人IL-15 5′非编码区存在10个AUG密码，去除这些上游AUG将有助于mRNA转录效率的提高[7]。所以，本研究从编码信号肽的AUG起始，设计PCR引物，扩增包括信号肽和成熟蛋白在内的486 bp IL-15 cDNA。IL-15 cDNA含有一个特异的Bg1Ⅱ酶切位点，通过对PCR扩增产物的Bg1Ⅱ单酶切可以初步鉴定其序列的正确性，结果获得182 bp和306 bp两个片段，与理论估计值相符。
pcDNA3是一种公认的效率较高的质粒型真核表达载体，受控于人巨细胞病毒(CMV)启动子。IL-15 cDNA经定向克隆与pcDNA3体外重组后，首先将其转染COS-7细胞作瞬时表达，在证实其确有表达后，再转染CHO细胞。经过G418抗性筛选，共获得8株阳性克隆。RT-PCR、SDS-PAGE和ELISA检测分析分别显示了IL-15 mRNA在CHO细胞中的转录和有效表达。 为确定经ELISA定量的表达产物的生物学活性，本实验采用CTLL-2细胞增殖法对无血清培养上清进行检测，发现IL-15的平均表达活性为(318.54±32.76)U/(106 cells.d)，且连续传代6个月，经冻存、复苏3次后，各克隆表达活性未见明显变化，再经断续培养、冻存和复苏17个月后，至少有5个细胞克隆内仍保留IL-15 mRNA转录本；证明了经筛选得到的CHO抗性细胞株能够稳定表达IL-15。有关人IL-15基因在CHO细胞中的表达，尚未见报道。本研究结果表明，人IL-15在CHO细胞中已获高效稳定表达。上述结果为进一步研究IL-15的生物学功能和临床应用提供了有利的条件。
, 百拇医药
△国家教委博士点基金(96002345)资助；#通讯作者
作者单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所免疫学室， 北京 100005
参考文献
1 Grabstein Kh, Eisenman J, Shanebeck K, et al. Cloning of a T cell growth factor that interacts with the β chain of the interleukin-2 receptor. Science, 1994, 264: 965～968
2 Kanegane H, Tosato, Giovanna. Activation of naive and memory T cells by interleukin-15. Blood, 1996, 88:230～235
, 百拇医药
3 Jullien D, Sieling PA, Uyemura K, et al. IL-15, an immunomodulator of T cell responses in intracellular infection. J Immunol, 1997, 158: 800～806
4 J. 萨姆布鲁克， EF. 弗里奇， T. 曼尼阿蒂斯. 分子克隆实验指南. 第二版. 北京： 科学出版社，1996
5 巴德年. 当代免疫学技术与应用. 北京： 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1998.221
6 Anderson DM, Johnson L, Glaccum MB, et al. Chromosomal assignment and genomic structure of IL15. Genomics, 1995, 25:701～706
, 百拇医药
7 Bamford RN, Battiata AP, Burton J, et al. Interleukin (IL) 15/IL-T production by the adult T-cell leukemia cell line HuT-102 is associated with a human T-cell lymphotrophic virus type I R region/IL-15 fusion message that lacks many upstream AUGS that normally attenuate IL-15 mRNA translation. Proc Nat1 Acad Sci USA, 1996, 93:2897～2902
(1998-04-20收稿)
人白细胞介素-15 cDNA在中国仓鼠卵巢细胞
中的高效稳定表达△
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薛莉 崔莲仙 何维 巴德年
摘要 目的 在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达人白细胞介素-15(IL-15)，为IL-15的功能研究提供有利条件。 方法 采用PCR技术扩增人IL-15编码区cDNA片段，构建重组真核表达载体，再以脂质体法转染至CHO细胞进行表达，鉴定表达产物的生物学活性。结果 共获得8株高效表达IL-15的阳性克隆，其平均活性为(318.54±32.72)U/(106 cells.d)，稳定传代6个月后仍保持其表达活性。结论 人IL-15 cDNA在CHO细胞中获得高效稳定表达。
关键词 白细胞介素-15 中国仓鼠卵巢细胞 真核基因表达
中图号 R392.12
Efficient, Stable Expression of Human Interleukin-15 cDNA in
, 百拇医药
Chinese Hamster Oval Cells
Xue Li Cui Lianxian He Wei# Ba Denian
(Department of Immunology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS and PUMC, Beijing 100005)
Objective To express the human interleukin 15(IL-15) cDNA in Chinese hamster oval(CHO) cells, which would benefit to the further research in the biological activities and the clinical applications of IL-15. Methods The entire human interleukin-15(IL-15) coding region, deleted of all the uncoding fragments, was amplified by PCR. The amplified products were subcloned into the EcoRⅠ and XbaⅠ sites of the pcDNA3 plasmid, forming the recombinant eukaryotic expressing vector, pcDNA3-IL-15, which was then identified by the Bg1Ⅱ enzymatic digestion, PCR amplification and the sequence analysis. The construct was transfected into CHO cells by means of lipofectamine, followed by a series of determinations to screen the positive cell colonies, such as RT-PCR, SDS-PAGE, ELISA and CTLL-2 proliferation assay. Results 8 positive cell colonies highly expressed human IL-15 were obtained after G418 selection. The bioassay showed that the mean activities of the supernatants from the CHO-IL-15 cells were (318.54±32.76) U/(106 cells.d) and maintained stable after 6 months culture. Conclusions Human IL-15 cDNA was expressed efficiently and persistently in CHO cells.
, 百拇医药
Key words interleukin-15; Chinese hamster oval cell; eukaryotic gene expression
研究表明，IL-15的生物学作用与IL-2相似，如诱导T、B和NK细胞增殖分化，诱导LAK/CTL活性，发挥抗感染、抗肿瘤作用等[1～3]。IL-15可在多种组织细胞表达，虽然原核细胞也能够高效表达蛋白质，但因其缺乏真核生物所具有的转录、翻译和翻译后等多级水平调控及修饰机制，使其应用受限。本研究采用哺乳类动物细胞表达体系对IL-15基因进行表达，以期产生更接近于体内天然状态的具有糖基化的人IL-15蛋白，为深入开展IL-15的生物学功能及临床应用研究提供条件。
1 材料和方法
质粒、菌种和细胞 质粒pBscript-SK-IL-15(含人IL-15 cDNA包括非编码区在内的574 bp序列)由本组构建，真核表达质粒pcDNA3由欧洲分子生物学实验室(EMBL)张友明博士惠赠，DH5α菌种为本室传代保存，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)由军事医学科学院赵明博士惠赠。
, 百拇医药
酶及主要生化试剂 限制性内切酶EcoRⅠ、XbaⅠ和T4 DNA连接酶为德国Boehringer Mannheim公司产品，脂质体(lipofectamine)、Trizol试剂和RPMI-1640、CHO-S-SFMⅡ培养基均为Gibco BRL公司产品，IL-15纯品由英国NIBSC惠赠，兔抗人IL-15抗体购自PeproTech公司，生物素标记羊抗兔IgG和HRP标记链霉卵白素购自北京中山公司、噻唑蓝(MTT)为Sigma公司产品，其它试剂均为进口或国产分析纯级产品。
PCR扩增 以P1：5′-GTACGAATTCATGAGAATTTCGAAACCACATTT-3′、P2：5′-TCGATCTAGATCAAGAAGTGTTGATGAACATTT-3′作为引物，以pBs cript-SK-IL-15为模板，在50 μl体系内进行扩增。反应条件：94℃ 3 min，然后94℃ 50 s, 61℃ 50 s, 72℃ 50 s, 循环30次，最后72℃延伸5 min。
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重组表达质粒pcDNA3-IL-15的构建及鉴定 质粒的提取、酶解、纯化，DNA片段的体外连接、转化，均按文献[4]进行。重组质粒以BglⅡ酶解和PCR扩增鉴定，并进行DNA序列测定分析。
脂质体法转染CHO细胞 CHO细胞(5×105个)接种于6孔细胞培养板内，37℃、5%CO2培养，待细胞呈50%～70%融合时，以脂质体介导转染。
细胞总RNA提取及RT-PCR扩增 参照TrizolTM试剂盒说明书，提取各G418抗性细胞克隆总RNA，以Oligo(dT)为引物在AMV逆转录酶作用下反转录获得cDNA第1链，再以此作为模板，以P1，P2为引物进行PCR扩增。
SDS-PAGE检测 收集细胞上清，进行SDS-PAGE和蛋白银染分析[4]。
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IL-15活性测定 采用CTLL-2细胞依赖株增殖反应测定法[5]，每种浓度设3个复孔，实验重复3次。以IL-15标准品或待测样品中最大吸光度值作为100%，其它测定值与之相除，得出每一吸光度值所对应的百分比，然后以此百分比做纵坐标，以稀释度为横坐标，用对数正态概率纸作图。求出样品和标准品吸光度百分比为50%时的稀释倍数，再计算出活性。
ELISA法检测IL-15 用PCR扩增的阳性细胞克隆的培养上清和一定浓度的IL-15标准品包板，BSA封闭后，加入兔抗人IL-15抗体，湿盒温育，再依次加入生物素标记的羊抗兔IgG和HRP标记的链霉卵白素，分别温育后，以邻苯二胺显色。
统计学处理 采用方差分析处理数据。
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2 结果
pcDNA3-IL-15重组表达质粒的构建和鉴定结果 以pBs cript-SK-IL-15为模板，经PCR扩增出1条486 bp IL-15 cDNA片段(图1)。该片段与pcDNA3质粒定向连接后，构成pcDNA3-IL-15重组质粒。pcDNA3-IL-15经BglⅡ单酶解，获得1.1 kb和4.7 kb两个片段，而pcDNA3对照经酶解仅出现一条线性带(图2)。再以pcDNA3-IL-15作为模板，通过PCR亦扩增出一条约486 bp的片段(图略)。同时，DNA序列测定结果表明，该序列与预计相符。
图 1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig 1 Agarose electrophoresis of PCR products
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1. pBR322/HinfⅠ Marker; 2,3: PCR products
图 2 pcDNA3-IL-15重组质粒的酶切图谱分析
Fig 2 Restriction analysis of pcDNA3-IL-15 plasmid
1. λDNA/Hind Ⅲ Marker; 2. pcDNA3-IL-15/Bg1 Ⅱ; 3.pcDNA3-IL-15;4.pcDNA3/Bg1 Ⅱ; 5. pcDNA3
CHO细胞的转染及重组人IL-15表达 pcDNA3-IL-15质粒转入CHO细胞后，经G418筛选，获得8株抗性克隆，称为CHO-IL-15细胞。分别提取这8株细胞的总RNA，经RT-PCR，均扩增出特异的486 bp IL-15 cDNA片段(图3)。
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图 3 CHO-IL-15细胞克隆的RT-PCR分析
Fig 3 RT-PCR analysis of IL-15 expression in the CHO-IL-15 cell colonies
1. pBR322/HinfⅠ Marker; 2,3,4,5,6,7,8,9: RT-PCR products; 10. negative control
SDS-PAGE和ELISA结果 CHO-IL-15细胞无血清培养上清的SDS-PAGE分析显示，在相对分子质量约14 000～15 000处出现一条区带，而空载对照组CHO-neo细胞上清未见任何条带(图4)。ELISA实验证实，CHO-IL-15上清与抗人IL-15抗体发生特异结合，出现明显的酶联显色反应，上清内rIL-15的平均表达水平为(3.01±0.238)μg/ml。
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图 4 表达产物的SDS-PAGE分析
Fig 4 SDS-PAGE analysis of the supernatants from the CHO-IL-15 Cells
1. Low protein molecular weight standard; 2,3: CHO-IL15; 4. CHO-neo
重组IL-15生物活性测定结果 CTLL-2细胞依赖株增殖测定的结果表明，各株CHO-IL-15细胞培养上清内的IL-15生物学活性平均为(318.54±32.76)U/(106 cells.d)。各阳性克隆株分别传代6个月，经冻存、复苏3次后均仍保持对G418的稳定抗性和IL-15的持续表达，0、3、6个月3次生物活性测定结果显示，未见活性明显下降(P>0.05)。各克隆细胞株断续培养、冻存和复苏17个月后，Northern Blot检测结果表明，至少有5种细胞克隆即CHO-IL-15 A、B、C、D、E仍保留IL-15 mRNA转录本。
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3 讨论
人IL-15是一种新近发现的细胞因子，其cDNA含有316 bp 5′非编码区，400 bp 3′非编码区和486 bp的开放读码框架，编码N末端48个氨基酸组成的信号肽和114个氨基酸组成的成熟蛋白[6]。据文献报道，人IL-15 5′非编码区存在10个AUG密码，去除这些上游AUG将有助于mRNA转录效率的提高[7]。所以，本研究从编码信号肽的AUG起始，设计PCR引物，扩增包括信号肽和成熟蛋白在内的486 bp IL-15 cDNA。IL-15 cDNA含有一个特异的Bg1Ⅱ酶切位点，通过对PCR扩增产物的Bg1Ⅱ单酶切可以初步鉴定其序列的正确性，结果获得182 bp和306 bp两个片段，与理论估计值相符。
pcDNA3是一种公认的效率较高的质粒型真核表达载体，受控于人巨细胞病毒(CMV)启动子。IL-15 cDNA经定向克隆与pcDNA3体外重组后，首先将其转染COS-7细胞作瞬时表达，在证实其确有表达后，再转染CHO细胞。经过G418抗性筛选，共获得8株阳性克隆。RT-PCR、SDS-PAGE和ELISA检测分析分别显示了IL-15 mRNA在CHO细胞中的转录和有效表达。 为确定经ELISA定量的表达产物的生物学活性，本实验采用CTLL-2细胞增殖法对无血清培养上清进行检测，发现IL-15的平均表达活性为(318.54±32.76)U/(106 cells.d)，且连续传代6个月，经冻存、复苏3次后，各克隆表达活性未见明显变化，再经断续培养、冻存和复苏17个月后，至少有5个细胞克隆内仍保留IL-15 mRNA转录本；证明了经筛选得到的CHO抗性细胞株能够稳定表达IL-15。有关人IL-15基因在CHO细胞中的表达，尚未见报道。本研究结果表明，人IL-15在CHO细胞中已获高效稳定表达。上述结果为进一步研究IL-15的生物学功能和临床应用提供了有利的条件。
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△国家教委博士点基金(96002345)资助；#通讯作者
作者单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所免疫学室， 北京 100005
参考文献
1 Grabstein Kh, Eisenman J, Shanebeck K, et al. Cloning of a T cell growth factor that interacts with the β chain of the interleukin-2 receptor. Science, 1994, 264: 965～968
2 Kanegane H, Tosato, Giovanna. Activation of naive and memory T cells by interleukin-15. Blood, 1996, 88:230～235
, http://www.100md.com
3 Jullien D, Sieling PA, Uyemura K, et al. IL-15, an immunomodulator of T cell responses in intracellular infection. J Immunol, 1997, 158: 800～806
4 J. 萨姆布鲁克， EF. 弗里奇， T. 曼尼阿蒂斯. 分子克隆实验指南. 第二版. 北京： 科学出版社，1996
5 巴德年. 当代免疫学技术与应用. 北京： 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1998.221
6 Anderson DM, Johnson L, Glaccum MB, et al. Chromosomal assignment and genomic structure of IL15. Genomics, 1995, 25:701～706
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7 Bamford RN, Battiata AP, Burton J, et al. Interleukin (IL) 15/IL-T production by the adult T-cell leukemia cell line HuT-102 is associated with a human T-cell lymphotrophic virus type I R region/IL-15 fusion message that lacks many upstream AUGS that normally attenuate IL-15 mRNA translation. Proc Nat1 Acad Sci USA, 1996, 93:2897～2902
(1998-04-20收稿), http://www.100md.com
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所免疫学室， 北京 100005
关键词：白细胞介素-15；中国仓鼠卵巢细胞；真核基因表达
人白细胞介素 摘要 目的 在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达人白细胞介素-15(IL-15)，为IL-15的功能研究提供有利条件。 方法 采用PCR技术扩增人IL-15编码区cDNA片段，构建重组真核表达载体，再以脂质体法转染至CHO细胞进行表达，鉴定表达产物的生物学活性。结果 共获得8株高效表达IL-15的阳性克隆，其平均活性为(318.54±32.72)U/(106 cells.d)，稳定传代6个月后仍保持其表达活性。结论 人IL-15 cDNA在CHO细胞中获得高效稳定表达。
中图号 R392.12
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Efficient, Stable Expression of Human Interleukin-15 cDNA in
Chinese Hamster Oval Cells
Xue Li Cui Lianxian He Wei# Ba Denian
(Department of Immunology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS and PUMC, Beijing 100005)
Objective To express the human interleukin 15(IL-15) cDNA in Chinese hamster oval(CHO) cells, which would benefit to the further research in the biological activities and the clinical applications of IL-15. Methods The entire human interleukin-15(IL-15) coding region, deleted of all the uncoding fragments, was amplified by PCR. The amplified products were subcloned into the EcoRⅠ and XbaⅠ sites of the pcDNA3 plasmid, forming the recombinant eukaryotic expressing vector, pcDNA3-IL-15, which was then identified by the Bg1Ⅱ enzymatic digestion, PCR amplification and the sequence analysis. The construct was transfected into CHO cells by means of lipofectamine, followed by a series of determinations to screen the positive cell colonies, such as RT-PCR, SDS-PAGE, ELISA and CTLL-2 proliferation assay. Results 8 positive cell colonies highly expressed human IL-15 were obtained after G418 selection. The bioassay showed that the mean activities of the supernatants from the CHO-IL-15 cells were (318.54±32.76) U/(106 cells.d) and maintained stable after 6 months culture. Conclusions Human IL-15 cDNA was expressed efficiently and persistently in CHO cells.
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Key words interleukin-15; Chinese hamster oval cell; eukaryotic gene expression
研究表明，IL-15的生物学作用与IL-2相似，如诱导T、B和NK细胞增殖分化，诱导LAK/CTL活性，发挥抗感染、抗肿瘤作用等[1～3]。IL-15可在多种组织细胞表达，虽然原核细胞也能够高效表达蛋白质，但因其缺乏真核生物所具有的转录、翻译和翻译后等多级水平调控及修饰机制，使其应用受限。本研究采用哺乳类动物细胞表达体系对IL-15基因进行表达，以期产生更接近于体内天然状态的具有糖基化的人IL-15蛋白，为深入开展IL-15的生物学功能及临床应用研究提供条件。
1 材料和方法
质粒、菌种和细胞 质粒pBscript-SK-IL-15(含人IL-15 cDNA包括非编码区在内的574 bp序列)由本组构建，真核表达质粒pcDNA3由欧洲分子生物学实验室(EMBL)张友明博士惠赠，DH5α菌种为本室传代保存，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)由军事医学科学院赵明博士惠赠。
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酶及主要生化试剂 限制性内切酶EcoRⅠ、XbaⅠ和T4 DNA连接酶为德国Boehringer Mannheim公司产品，脂质体(lipofectamine)、Trizol试剂和RPMI-1640、CHO-S-SFMⅡ培养基均为Gibco BRL公司产品，IL-15纯品由英国NIBSC惠赠，兔抗人IL-15抗体购自PeproTech公司，生物素标记羊抗兔IgG和HRP标记链霉卵白素购自北京中山公司、噻唑蓝(MTT)为Sigma公司产品，其它试剂均为进口或国产分析纯级产品。
PCR扩增 以P1：5′-GTACGAATTCATGAGAATTTCGAAACCACATTT-3′、P2：5′-TCGATCTAGATCAAGAAGTGTTGATGAACATTT-3′作为引物，以pBs cript-SK-IL-15为模板，在50 μl体系内进行扩增。反应条件：94℃ 3 min，然后94℃ 50 s, 61℃ 50 s, 72℃ 50 s, 循环30次，最后72℃延伸5 min。
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重组表达质粒pcDNA3-IL-15的构建及鉴定 质粒的提取、酶解、纯化，DNA片段的体外连接、转化，均按文献[4]进行。重组质粒以BglⅡ酶解和PCR扩增鉴定，并进行DNA序列测定分析。
脂质体法转染CHO细胞 CHO细胞(5×105个)接种于6孔细胞培养板内，37℃、5%CO2培养，待细胞呈50%～70%融合时，以脂质体介导转染。
细胞总RNA提取及RT-PCR扩增 参照TrizolTM试剂盒说明书，提取各G418抗性细胞克隆总RNA，以Oligo(dT)为引物在AMV逆转录酶作用下反转录获得cDNA第1链，再以此作为模板，以P1，P2为引物进行PCR扩增。
SDS-PAGE检测 收集细胞上清，进行SDS-PAGE和蛋白银染分析[4]。
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IL-15活性测定 采用CTLL-2细胞依赖株增殖反应测定法[5]，每种浓度设3个复孔，实验重复3次。以IL-15标准品或待测样品中最大吸光度值作为100%，其它测定值与之相除，得出每一吸光度值所对应的百分比，然后以此百分比做纵坐标，以稀释度为横坐标，用对数正态概率纸作图。求出样品和标准品吸光度百分比为50%时的稀释倍数，再计算出活性。
ELISA法检测IL-15 用PCR扩增的阳性细胞克隆的培养上清和一定浓度的IL-15标准品包板，BSA封闭后，加入兔抗人IL-15抗体，湿盒温育，再依次加入生物素标记的羊抗兔IgG和HRP标记的链霉卵白素，分别温育后，以邻苯二胺显色。
统计学处理 采用方差分析处理数据。
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2 结果
pcDNA3-IL-15重组表达质粒的构建和鉴定结果 以pBs cript-SK-IL-15为模板，经PCR扩增出1条486 bp IL-15 cDNA片段(图1)。该片段与pcDNA3质粒定向连接后，构成pcDNA3-IL-15重组质粒。pcDNA3-IL-15经BglⅡ单酶解，获得1.1 kb和4.7 kb两个片段，而pcDNA3对照经酶解仅出现一条线性带(图2)。再以pcDNA3-IL-15作为模板，通过PCR亦扩增出一条约486 bp的片段(图略)。同时，DNA序列测定结果表明，该序列与预计相符。
图 1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig 1 Agarose electrophoresis of PCR products
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1. pBR322/HinfⅠ Marker; 2,3: PCR products
图 2 pcDNA3-IL-15重组质粒的酶切图谱分析
Fig 2 Restriction analysis of pcDNA3-IL-15 plasmid
1. λDNA/Hind Ⅲ Marker; 2. pcDNA3-IL-15/Bg1 Ⅱ; 3.pcDNA3-IL-15;4.pcDNA3/Bg1 Ⅱ; 5. pcDNA3
CHO细胞的转染及重组人IL-15表达 pcDNA3-IL-15质粒转入CHO细胞后，经G418筛选，获得8株抗性克隆，称为CHO-IL-15细胞。分别提取这8株细胞的总RNA，经RT-PCR，均扩增出特异的486 bp IL-15 cDNA片段(图3)。
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图 3 CHO-IL-15细胞克隆的RT-PCR分析
Fig 3 RT-PCR analysis of IL-15 expression in the CHO-IL-15 cell colonies
1. pBR322/HinfⅠ Marker; 2,3,4,5,6,7,8,9: RT-PCR products; 10. negative control
SDS-PAGE和ELISA结果 CHO-IL-15细胞无血清培养上清的SDS-PAGE分析显示，在相对分子质量约14 000～15 000处出现一条区带，而空载对照组CHO-neo细胞上清未见任何条带(图4)。ELISA实验证实，CHO-IL-15上清与抗人IL-15抗体发生特异结合，出现明显的酶联显色反应，上清内rIL-15的平均表达水平为(3.01±0.238)μg/ml。
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图 4 表达产物的SDS-PAGE分析
Fig 4 SDS-PAGE analysis of the supernatants from the CHO-IL-15 Cells
1. Low protein molecular weight standard; 2,3: CHO-IL15; 4. CHO-neo
重组IL-15生物活性测定结果 CTLL-2细胞依赖株增殖测定的结果表明，各株CHO-IL-15细胞培养上清内的IL-15生物学活性平均为(318.54±32.76)U/(106 cells.d)。各阳性克隆株分别传代6个月，经冻存、复苏3次后均仍保持对G418的稳定抗性和IL-15的持续表达，0、3、6个月3次生物活性测定结果显示，未见活性明显下降(P>0.05)。各克隆细胞株断续培养、冻存和复苏17个月后，Northern Blot检测结果表明，至少有5种细胞克隆即CHO-IL-15 A、B、C、D、E仍保留IL-15 mRNA转录本。
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3 讨论
人IL-15是一种新近发现的细胞因子，其cDNA含有316 bp 5′非编码区，400 bp 3′非编码区和486 bp的开放读码框架，编码N末端48个氨基酸组成的信号肽和114个氨基酸组成的成熟蛋白[6]。据文献报道，人IL-15 5′非编码区存在10个AUG密码，去除这些上游AUG将有助于mRNA转录效率的提高[7]。所以，本研究从编码信号肽的AUG起始，设计PCR引物，扩增包括信号肽和成熟蛋白在内的486 bp IL-15 cDNA。IL-15 cDNA含有一个特异的Bg1Ⅱ酶切位点，通过对PCR扩增产物的Bg1Ⅱ单酶切可以初步鉴定其序列的正确性，结果获得182 bp和306 bp两个片段，与理论估计值相符。
pcDNA3是一种公认的效率较高的质粒型真核表达载体，受控于人巨细胞病毒(CMV)启动子。IL-15 cDNA经定向克隆与pcDNA3体外重组后，首先将其转染COS-7细胞作瞬时表达，在证实其确有表达后，再转染CHO细胞。经过G418抗性筛选，共获得8株阳性克隆。RT-PCR、SDS-PAGE和ELISA检测分析分别显示了IL-15 mRNA在CHO细胞中的转录和有效表达。 为确定经ELISA定量的表达产物的生物学活性，本实验采用CTLL-2细胞增殖法对无血清培养上清进行检测，发现IL-15的平均表达活性为(318.54±32.76)U/(106 cells.d)，且连续传代6个月，经冻存、复苏3次后，各克隆表达活性未见明显变化，再经断续培养、冻存和复苏17个月后，至少有5个细胞克隆内仍保留IL-15 mRNA转录本；证明了经筛选得到的CHO抗性细胞株能够稳定表达IL-15。有关人IL-15基因在CHO细胞中的表达，尚未见报道。本研究结果表明，人IL-15在CHO细胞中已获高效稳定表达。上述结果为进一步研究IL-15的生物学功能和临床应用提供了有利的条件。
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△国家教委博士点基金(96002345)资助；#通讯作者
参考文献
1 Grabstein Kh, Eisenman J, Shanebeck K, et al. Cloning of a T cell growth factor that interacts with the β chain of the interleukin-2 receptor. Science, 1994, 264: 965～968
2 Kanegane H, Tosato, Giovanna. Activation of naive and memory T cells by interleukin-15. Blood, 1996, 88:230～235
3 Jullien D, Sieling PA, Uyemura K, et al. IL-15, an immunomodulator of T cell responses in intracellular infection. J Immunol, 1997, 158: 800～806
, 百拇医药
4 J. 萨姆布鲁克， EF. 弗里奇， T. 曼尼阿蒂斯. 分子克隆实验指南. 第二版. 北京： 科学出版社，1996
5 巴德年. 当代免疫学技术与应用. 北京： 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1998.221
6 Anderson DM, Johnson L, Glaccum MB, et al. Chromosomal assignment and genomic structure of IL15. Genomics, 1995, 25:701～706
7 Bamford RN, Battiata AP, Burton J, et al. Interleukin (IL) 15/IL-T production by the adult T-cell leukemia cell line HuT-102 is associated with a human T-cell lymphotrophic virus type I R region/IL-15 fusion message that lacks many upstream AUGS that normally attenuate IL-15 mRNA translation. Proc Nat1 Acad Sci USA, 1996, 93:2897～2902
, 百拇医药
(1998-04-20收稿)
人白细胞介素-15 cDNA在中国仓鼠卵巢细胞
中的高效稳定表达△
薛莉 崔莲仙 何维 巴德年
摘要 目的 在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达人白细胞介素-15(IL-15)，为IL-15的功能研究提供有利条件。 方法 采用PCR技术扩增人IL-15编码区cDNA片段，构建重组真核表达载体，再以脂质体法转染至CHO细胞进行表达，鉴定表达产物的生物学活性。结果 共获得8株高效表达IL-15的阳性克隆，其平均活性为(318.54±32.72)U/(106 cells.d)，稳定传代6个月后仍保持其表达活性。结论 人IL-15 cDNA在CHO细胞中获得高效稳定表达。
, 百拇医药
关键词 白细胞介素-15 中国仓鼠卵巢细胞 真核基因表达
中图号 R392.12
Efficient, Stable Expression of Human Interleukin-15 cDNA in
Chinese Hamster Oval Cells
Xue Li Cui Lianxian He Wei# Ba Denian
(Department of Immunology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS and PUMC, Beijing 100005)
Objective To express the human interleukin 15(IL-15) cDNA in Chinese hamster oval(CHO) cells, which would benefit to the further research in the biological activities and the clinical applications of IL-15. Methods The entire human interleukin-15(IL-15) coding region, deleted of all the uncoding fragments, was amplified by PCR. The amplified products were subcloned into the EcoRⅠ and XbaⅠ sites of the pcDNA3 plasmid, forming the recombinant eukaryotic expressing vector, pcDNA3-IL-15, which was then identified by the Bg1Ⅱ enzymatic digestion, PCR amplification and the sequence analysis. The construct was transfected into CHO cells by means of lipofectamine, followed by a series of determinations to screen the positive cell colonies, such as RT-PCR, SDS-PAGE, ELISA and CTLL-2 proliferation assay. Results 8 positive cell colonies highly expressed human IL-15 were obtained after G418 selection. The bioassay showed that the mean activities of the supernatants from the CHO-IL-15 cells were (318.54±32.76) U/(106 cells.d) and maintained stable after 6 months culture. Conclusions Human IL-15 cDNA was expressed efficiently and persistently in CHO cells.
, 百拇医药
Key words interleukin-15; Chinese hamster oval cell; eukaryotic gene expression
研究表明，IL-15的生物学作用与IL-2相似，如诱导T、B和NK细胞增殖分化，诱导LAK/CTL活性，发挥抗感染、抗肿瘤作用等[1～3]。IL-15可在多种组织细胞表达，虽然原核细胞也能够高效表达蛋白质，但因其缺乏真核生物所具有的转录、翻译和翻译后等多级水平调控及修饰机制，使其应用受限。本研究采用哺乳类动物细胞表达体系对IL-15基因进行表达，以期产生更接近于体内天然状态的具有糖基化的人IL-15蛋白，为深入开展IL-15的生物学功能及临床应用研究提供条件。
1 材料和方法
质粒、菌种和细胞 质粒pBscript-SK-IL-15(含人IL-15 cDNA包括非编码区在内的574 bp序列)由本组构建，真核表达质粒pcDNA3由欧洲分子生物学实验室(EMBL)张友明博士惠赠，DH5α菌种为本室传代保存，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)由军事医学科学院赵明博士惠赠。
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酶及主要生化试剂 限制性内切酶EcoRⅠ、XbaⅠ和T4 DNA连接酶为德国Boehringer Mannheim公司产品，脂质体(lipofectamine)、Trizol试剂和RPMI-1640、CHO-S-SFMⅡ培养基均为Gibco BRL公司产品，IL-15纯品由英国NIBSC惠赠，兔抗人IL-15抗体购自PeproTech公司，生物素标记羊抗兔IgG和HRP标记链霉卵白素购自北京中山公司、噻唑蓝(MTT)为Sigma公司产品，其它试剂均为进口或国产分析纯级产品。
PCR扩增 以P1：5′-GTACGAATTCATGAGAATTTCGAAACCACATTT-3′、P2：5′-TCGATCTAGATCAAGAAGTGTTGATGAACATTT-3′作为引物，以pBs cript-SK-IL-15为模板，在50 μl体系内进行扩增。反应条件：94℃ 3 min，然后94℃ 50 s, 61℃ 50 s, 72℃ 50 s, 循环30次，最后72℃延伸5 min。
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重组表达质粒pcDNA3-IL-15的构建及鉴定 质粒的提取、酶解、纯化，DNA片段的体外连接、转化，均按文献[4]进行。重组质粒以BglⅡ酶解和PCR扩增鉴定，并进行DNA序列测定分析。
脂质体法转染CHO细胞 CHO细胞(5×105个)接种于6孔细胞培养板内，37℃、5%CO2培养，待细胞呈50%～70%融合时，以脂质体介导转染。
细胞总RNA提取及RT-PCR扩增 参照TrizolTM试剂盒说明书，提取各G418抗性细胞克隆总RNA，以Oligo(dT)为引物在AMV逆转录酶作用下反转录获得cDNA第1链，再以此作为模板，以P1，P2为引物进行PCR扩增。
SDS-PAGE检测 收集细胞上清，进行SDS-PAGE和蛋白银染分析[4]。
, 百拇医药
IL-15活性测定 采用CTLL-2细胞依赖株增殖反应测定法[5]，每种浓度设3个复孔，实验重复3次。以IL-15标准品或待测样品中最大吸光度值作为100%，其它测定值与之相除，得出每一吸光度值所对应的百分比，然后以此百分比做纵坐标，以稀释度为横坐标，用对数正态概率纸作图。求出样品和标准品吸光度百分比为50%时的稀释倍数，再计算出活性。
ELISA法检测IL-15 用PCR扩增的阳性细胞克隆的培养上清和一定浓度的IL-15标准品包板，BSA封闭后，加入兔抗人IL-15抗体，湿盒温育，再依次加入生物素标记的羊抗兔IgG和HRP标记的链霉卵白素，分别温育后，以邻苯二胺显色。
统计学处理 采用方差分析处理数据。
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2 结果
pcDNA3-IL-15重组表达质粒的构建和鉴定结果 以pBs cript-SK-IL-15为模板，经PCR扩增出1条486 bp IL-15 cDNA片段(图1)。该片段与pcDNA3质粒定向连接后，构成pcDNA3-IL-15重组质粒。pcDNA3-IL-15经BglⅡ单酶解，获得1.1 kb和4.7 kb两个片段，而pcDNA3对照经酶解仅出现一条线性带(图2)。再以pcDNA3-IL-15作为模板，通过PCR亦扩增出一条约486 bp的片段(图略)。同时，DNA序列测定结果表明，该序列与预计相符。
图 1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig 1 Agarose electrophoresis of PCR products
, 百拇医药
1. pBR322/HinfⅠ Marker; 2,3: PCR products
图 2 pcDNA3-IL-15重组质粒的酶切图谱分析
Fig 2 Restriction analysis of pcDNA3-IL-15 plasmid
1. λDNA/Hind Ⅲ Marker; 2. pcDNA3-IL-15/Bg1 Ⅱ; 3.pcDNA3-IL-15;4.pcDNA3/Bg1 Ⅱ; 5. pcDNA3
CHO细胞的转染及重组人IL-15表达 pcDNA3-IL-15质粒转入CHO细胞后，经G418筛选，获得8株抗性克隆，称为CHO-IL-15细胞。分别提取这8株细胞的总RNA，经RT-PCR，均扩增出特异的486 bp IL-15 cDNA片段(图3)。
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图 3 CHO-IL-15细胞克隆的RT-PCR分析
Fig 3 RT-PCR analysis of IL-15 expression in the CHO-IL-15 cell colonies
1. pBR322/HinfⅠ Marker; 2,3,4,5,6,7,8,9: RT-PCR products; 10. negative control
SDS-PAGE和ELISA结果 CHO-IL-15细胞无血清培养上清的SDS-PAGE分析显示，在相对分子质量约14 000～15 000处出现一条区带，而空载对照组CHO-neo细胞上清未见任何条带(图4)。ELISA实验证实，CHO-IL-15上清与抗人IL-15抗体发生特异结合，出现明显的酶联显色反应，上清内rIL-15的平均表达水平为(3.01±0.238)μg/ml。
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图 4 表达产物的SDS-PAGE分析
Fig 4 SDS-PAGE analysis of the supernatants from the CHO-IL-15 Cells
1. Low protein molecular weight standard; 2,3: CHO-IL15; 4. CHO-neo
重组IL-15生物活性测定结果 CTLL-2细胞依赖株增殖测定的结果表明，各株CHO-IL-15细胞培养上清内的IL-15生物学活性平均为(318.54±32.76)U/(106 cells.d)。各阳性克隆株分别传代6个月，经冻存、复苏3次后均仍保持对G418的稳定抗性和IL-15的持续表达，0、3、6个月3次生物活性测定结果显示，未见活性明显下降(P>0.05)。各克隆细胞株断续培养、冻存和复苏17个月后，Northern Blot检测结果表明，至少有5种细胞克隆即CHO-IL-15 A、B、C、D、E仍保留IL-15 mRNA转录本。
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3 讨论
人IL-15是一种新近发现的细胞因子，其cDNA含有316 bp 5′非编码区，400 bp 3′非编码区和486 bp的开放读码框架，编码N末端48个氨基酸组成的信号肽和114个氨基酸组成的成熟蛋白[6]。据文献报道，人IL-15 5′非编码区存在10个AUG密码，去除这些上游AUG将有助于mRNA转录效率的提高[7]。所以，本研究从编码信号肽的AUG起始，设计PCR引物，扩增包括信号肽和成熟蛋白在内的486 bp IL-15 cDNA。IL-15 cDNA含有一个特异的Bg1Ⅱ酶切位点，通过对PCR扩增产物的Bg1Ⅱ单酶切可以初步鉴定其序列的正确性，结果获得182 bp和306 bp两个片段，与理论估计值相符。
pcDNA3是一种公认的效率较高的质粒型真核表达载体，受控于人巨细胞病毒(CMV)启动子。IL-15 cDNA经定向克隆与pcDNA3体外重组后，首先将其转染COS-7细胞作瞬时表达，在证实其确有表达后，再转染CHO细胞。经过G418抗性筛选，共获得8株阳性克隆。RT-PCR、SDS-PAGE和ELISA检测分析分别显示了IL-15 mRNA在CHO细胞中的转录和有效表达。 为确定经ELISA定量的表达产物的生物学活性，本实验采用CTLL-2细胞增殖法对无血清培养上清进行检测，发现IL-15的平均表达活性为(318.54±32.76)U/(106 cells.d)，且连续传代6个月，经冻存、复苏3次后，各克隆表达活性未见明显变化，再经断续培养、冻存和复苏17个月后，至少有5个细胞克隆内仍保留IL-15 mRNA转录本；证明了经筛选得到的CHO抗性细胞株能够稳定表达IL-15。有关人IL-15基因在CHO细胞中的表达，尚未见报道。本研究结果表明，人IL-15在CHO细胞中已获高效稳定表达。上述结果为进一步研究IL-15的生物学功能和临床应用提供了有利的条件。
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△国家教委博士点基金(96002345)资助；#通讯作者
作者单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所免疫学室， 北京 100005
参考文献
1 Grabstein Kh, Eisenman J, Shanebeck K, et al. Cloning of a T cell growth factor that interacts with the β chain of the interleukin-2 receptor. Science, 1994, 264: 965～968
2 Kanegane H, Tosato, Giovanna. Activation of naive and memory T cells by interleukin-15. Blood, 1996, 88:230～235
, 百拇医药
3 Jullien D, Sieling PA, Uyemura K, et al. IL-15, an immunomodulator of T cell responses in intracellular infection. J Immunol, 1997, 158: 800～806
4 J. 萨姆布鲁克， EF. 弗里奇， T. 曼尼阿蒂斯. 分子克隆实验指南. 第二版. 北京： 科学出版社，1996
5 巴德年. 当代免疫学技术与应用. 北京： 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1998.221
6 Anderson DM, Johnson L, Glaccum MB, et al. Chromosomal assignment and genomic structure of IL15. Genomics, 1995, 25:701～706
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7 Bamford RN, Battiata AP, Burton J, et al. Interleukin (IL) 15/IL-T production by the adult T-cell leukemia cell line HuT-102 is associated with a human T-cell lymphotrophic virus type I R region/IL-15 fusion message that lacks many upstream AUGS that normally attenuate IL-15 mRNA translation. Proc Nat1 Acad Sci USA, 1996, 93:2897～2902
(1998-04-20收稿)
人白细胞介素-15 cDNA在中国仓鼠卵巢细胞
中的高效稳定表达△
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薛莉 崔莲仙 何维 巴德年
摘要 目的 在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达人白细胞介素-15(IL-15)，为IL-15的功能研究提供有利条件。 方法 采用PCR技术扩增人IL-15编码区cDNA片段，构建重组真核表达载体，再以脂质体法转染至CHO细胞进行表达，鉴定表达产物的生物学活性。结果 共获得8株高效表达IL-15的阳性克隆，其平均活性为(318.54±32.72)U/(106 cells.d)，稳定传代6个月后仍保持其表达活性。结论 人IL-15 cDNA在CHO细胞中获得高效稳定表达。
关键词 白细胞介素-15 中国仓鼠卵巢细胞 真核基因表达
中图号 R392.12
Efficient, Stable Expression of Human Interleukin-15 cDNA in
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Chinese Hamster Oval Cells
Xue Li Cui Lianxian He Wei# Ba Denian
(Department of Immunology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS and PUMC, Beijing 100005)
Objective To express the human interleukin 15(IL-15) cDNA in Chinese hamster oval(CHO) cells, which would benefit to the further research in the biological activities and the clinical applications of IL-15. Methods The entire human interleukin-15(IL-15) coding region, deleted of all the uncoding fragments, was amplified by PCR. The amplified products were subcloned into the EcoRⅠ and XbaⅠ sites of the pcDNA3 plasmid, forming the recombinant eukaryotic expressing vector, pcDNA3-IL-15, which was then identified by the Bg1Ⅱ enzymatic digestion, PCR amplification and the sequence analysis. The construct was transfected into CHO cells by means of lipofectamine, followed by a series of determinations to screen the positive cell colonies, such as RT-PCR, SDS-PAGE, ELISA and CTLL-2 proliferation assay. Results 8 positive cell colonies highly expressed human IL-15 were obtained after G418 selection. The bioassay showed that the mean activities of the supernatants from the CHO-IL-15 cells were (318.54±32.76) U/(106 cells.d) and maintained stable after 6 months culture. Conclusions Human IL-15 cDNA was expressed efficiently and persistently in CHO cells.
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Key words interleukin-15; Chinese hamster oval cell; eukaryotic gene expression
研究表明，IL-15的生物学作用与IL-2相似，如诱导T、B和NK细胞增殖分化，诱导LAK/CTL活性，发挥抗感染、抗肿瘤作用等[1～3]。IL-15可在多种组织细胞表达，虽然原核细胞也能够高效表达蛋白质，但因其缺乏真核生物所具有的转录、翻译和翻译后等多级水平调控及修饰机制，使其应用受限。本研究采用哺乳类动物细胞表达体系对IL-15基因进行表达，以期产生更接近于体内天然状态的具有糖基化的人IL-15蛋白，为深入开展IL-15的生物学功能及临床应用研究提供条件。
1 材料和方法
质粒、菌种和细胞 质粒pBscript-SK-IL-15(含人IL-15 cDNA包括非编码区在内的574 bp序列)由本组构建，真核表达质粒pcDNA3由欧洲分子生物学实验室(EMBL)张友明博士惠赠，DH5α菌种为本室传代保存，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)由军事医学科学院赵明博士惠赠。
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酶及主要生化试剂 限制性内切酶EcoRⅠ、XbaⅠ和T4 DNA连接酶为德国Boehringer Mannheim公司产品，脂质体(lipofectamine)、Trizol试剂和RPMI-1640、CHO-S-SFMⅡ培养基均为Gibco BRL公司产品，IL-15纯品由英国NIBSC惠赠，兔抗人IL-15抗体购自PeproTech公司，生物素标记羊抗兔IgG和HRP标记链霉卵白素购自北京中山公司、噻唑蓝(MTT)为Sigma公司产品，其它试剂均为进口或国产分析纯级产品。
PCR扩增 以P1：5′-GTACGAATTCATGAGAATTTCGAAACCACATTT-3′、P2：5′-TCGATCTAGATCAAGAAGTGTTGATGAACATTT-3′作为引物，以pBs cript-SK-IL-15为模板，在50 μl体系内进行扩增。反应条件：94℃ 3 min，然后94℃ 50 s, 61℃ 50 s, 72℃ 50 s, 循环30次，最后72℃延伸5 min。
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重组表达质粒pcDNA3-IL-15的构建及鉴定 质粒的提取、酶解、纯化，DNA片段的体外连接、转化，均按文献[4]进行。重组质粒以BglⅡ酶解和PCR扩增鉴定，并进行DNA序列测定分析。
脂质体法转染CHO细胞 CHO细胞(5×105个)接种于6孔细胞培养板内，37℃、5%CO2培养，待细胞呈50%～70%融合时，以脂质体介导转染。
细胞总RNA提取及RT-PCR扩增 参照TrizolTM试剂盒说明书，提取各G418抗性细胞克隆总RNA，以Oligo(dT)为引物在AMV逆转录酶作用下反转录获得cDNA第1链，再以此作为模板，以P1，P2为引物进行PCR扩增。
SDS-PAGE检测 收集细胞上清，进行SDS-PAGE和蛋白银染分析[4]。
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IL-15活性测定 采用CTLL-2细胞依赖株增殖反应测定法[5]，每种浓度设3个复孔，实验重复3次。以IL-15标准品或待测样品中最大吸光度值作为100%，其它测定值与之相除，得出每一吸光度值所对应的百分比，然后以此百分比做纵坐标，以稀释度为横坐标，用对数正态概率纸作图。求出样品和标准品吸光度百分比为50%时的稀释倍数，再计算出活性。
ELISA法检测IL-15 用PCR扩增的阳性细胞克隆的培养上清和一定浓度的IL-15标准品包板，BSA封闭后，加入兔抗人IL-15抗体，湿盒温育，再依次加入生物素标记的羊抗兔IgG和HRP标记的链霉卵白素，分别温育后，以邻苯二胺显色。
统计学处理 采用方差分析处理数据。
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2 结果
pcDNA3-IL-15重组表达质粒的构建和鉴定结果 以pBs cript-SK-IL-15为模板，经PCR扩增出1条486 bp IL-15 cDNA片段(图1)。该片段与pcDNA3质粒定向连接后，构成pcDNA3-IL-15重组质粒。pcDNA3-IL-15经BglⅡ单酶解，获得1.1 kb和4.7 kb两个片段，而pcDNA3对照经酶解仅出现一条线性带(图2)。再以pcDNA3-IL-15作为模板，通过PCR亦扩增出一条约486 bp的片段(图略)。同时，DNA序列测定结果表明，该序列与预计相符。
图 1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig 1 Agarose electrophoresis of PCR products
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1. pBR322/HinfⅠ Marker; 2,3: PCR products
图 2 pcDNA3-IL-15重组质粒的酶切图谱分析
Fig 2 Restriction analysis of pcDNA3-IL-15 plasmid
1. λDNA/Hind Ⅲ Marker; 2. pcDNA3-IL-15/Bg1 Ⅱ; 3.pcDNA3-IL-15;4.pcDNA3/Bg1 Ⅱ; 5. pcDNA3
CHO细胞的转染及重组人IL-15表达 pcDNA3-IL-15质粒转入CHO细胞后，经G418筛选，获得8株抗性克隆，称为CHO-IL-15细胞。分别提取这8株细胞的总RNA，经RT-PCR，均扩增出特异的486 bp IL-15 cDNA片段(图3)。
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图 3 CHO-IL-15细胞克隆的RT-PCR分析
Fig 3 RT-PCR analysis of IL-15 expression in the CHO-IL-15 cell colonies
1. pBR322/HinfⅠ Marker; 2,3,4,5,6,7,8,9: RT-PCR products; 10. negative control
SDS-PAGE和ELISA结果 CHO-IL-15细胞无血清培养上清的SDS-PAGE分析显示，在相对分子质量约14 000～15 000处出现一条区带，而空载对照组CHO-neo细胞上清未见任何条带(图4)。ELISA实验证实，CHO-IL-15上清与抗人IL-15抗体发生特异结合，出现明显的酶联显色反应，上清内rIL-15的平均表达水平为(3.01±0.238)μg/ml。
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图 4 表达产物的SDS-PAGE分析
Fig 4 SDS-PAGE analysis of the supernatants from the CHO-IL-15 Cells
1. Low protein molecular weight standard; 2,3: CHO-IL15; 4. CHO-neo
重组IL-15生物活性测定结果 CTLL-2细胞依赖株增殖测定的结果表明，各株CHO-IL-15细胞培养上清内的IL-15生物学活性平均为(318.54±32.76)U/(106 cells.d)。各阳性克隆株分别传代6个月，经冻存、复苏3次后均仍保持对G418的稳定抗性和IL-15的持续表达，0、3、6个月3次生物活性测定结果显示，未见活性明显下降(P>0.05)。各克隆细胞株断续培养、冻存和复苏17个月后，Northern Blot检测结果表明，至少有5种细胞克隆即CHO-IL-15 A、B、C、D、E仍保留IL-15 mRNA转录本。
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3 讨论
人IL-15是一种新近发现的细胞因子，其cDNA含有316 bp 5′非编码区，400 bp 3′非编码区和486 bp的开放读码框架，编码N末端48个氨基酸组成的信号肽和114个氨基酸组成的成熟蛋白[6]。据文献报道，人IL-15 5′非编码区存在10个AUG密码，去除这些上游AUG将有助于mRNA转录效率的提高[7]。所以，本研究从编码信号肽的AUG起始，设计PCR引物，扩增包括信号肽和成熟蛋白在内的486 bp IL-15 cDNA。IL-15 cDNA含有一个特异的Bg1Ⅱ酶切位点，通过对PCR扩增产物的Bg1Ⅱ单酶切可以初步鉴定其序列的正确性，结果获得182 bp和306 bp两个片段，与理论估计值相符。
pcDNA3是一种公认的效率较高的质粒型真核表达载体，受控于人巨细胞病毒(CMV)启动子。IL-15 cDNA经定向克隆与pcDNA3体外重组后，首先将其转染COS-7细胞作瞬时表达，在证实其确有表达后，再转染CHO细胞。经过G418抗性筛选，共获得8株阳性克隆。RT-PCR、SDS-PAGE和ELISA检测分析分别显示了IL-15 mRNA在CHO细胞中的转录和有效表达。 为确定经ELISA定量的表达产物的生物学活性，本实验采用CTLL-2细胞增殖法对无血清培养上清进行检测，发现IL-15的平均表达活性为(318.54±32.76)U/(106 cells.d)，且连续传代6个月，经冻存、复苏3次后，各克隆表达活性未见明显变化，再经断续培养、冻存和复苏17个月后，至少有5个细胞克隆内仍保留IL-15 mRNA转录本；证明了经筛选得到的CHO抗性细胞株能够稳定表达IL-15。有关人IL-15基因在CHO细胞中的表达，尚未见报道。本研究结果表明，人IL-15在CHO细胞中已获高效稳定表达。上述结果为进一步研究IL-15的生物学功能和临床应用提供了有利的条件。
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△国家教委博士点基金(96002345)资助；#通讯作者
作者单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所免疫学室， 北京 100005
参考文献
1 Grabstein Kh, Eisenman J, Shanebeck K, et al. Cloning of a T cell growth factor that interacts with the β chain of the interleukin-2 receptor. Science, 1994, 264: 965～968
2 Kanegane H, Tosato, Giovanna. Activation of naive and memory T cells by interleukin-15. Blood, 1996, 88:230～235
, 百拇医药
3 Jullien D, Sieling PA, Uyemura K, et al. IL-15, an immunomodulator of T cell responses in intracellular infection. J Immunol, 1997, 158: 800～806
4 J. 萨姆布鲁克， EF. 弗里奇， T. 曼尼阿蒂斯. 分子克隆实验指南. 第二版. 北京： 科学出版社，1996
5 巴德年. 当代免疫学技术与应用. 北京： 北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1998.221
6 Anderson DM, Johnson L, Glaccum MB, et al. Chromosomal assignment and genomic structure of IL15. Genomics, 1995, 25:701～706
, 百拇医药
7 Bamford RN, Battiata AP, Burton J, et al. Interleukin (IL) 15/IL-T production by the adult T-cell leukemia cell line HuT-102 is associated with a human T-cell lymphotrophic virus type I R region/IL-15 fusion message that lacks many upstream AUGS that normally attenuate IL-15 mRNA translation. Proc Nat1 Acad Sci USA, 1996, 93:2897～2902
(1998-04-20收稿)
人白细胞介素-15 cDNA在中国仓鼠卵巢细胞
中的高效稳定表达△
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薛莉 崔莲仙 何维 巴德年
摘要 目的 在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达人白细胞介素-15(IL-15)，为IL-15的功能研究提供有利条件。 方法 采用PCR技术扩增人IL-15编码区cDNA片段，构建重组真核表达载体，再以脂质体法转染至CHO细胞进行表达，鉴定表达产物的生物学活性。结果 共获得8株高效表达IL-15的阳性克隆，其平均活性为(318.54±32.72)U/(106 cells.d)，稳定传代6个月后仍保持其表达活性。结论 人IL-15 cDNA在CHO细胞中获得高效稳定表达。
关键词 白细胞介素-15 中国仓鼠卵巢细胞 真核基因表达
中图号 R392.12
Efficient, Stable Expression of Human Interleukin-15 cDNA in
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Chinese Hamster Oval Cells
Xue Li Cui Lianxian He Wei# Ba Denian
(Department of Immunology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS and PUMC, Beijing 100005)
Objective To express the human interleukin 15(IL-15) cDNA in Chinese hamster oval(CHO) cells, which would benefit to the further research in the biological activities and the clinical applications of IL-15. Methods The entire human interleukin-15(IL-15) coding region, deleted of all the uncoding fragments, was amplified by PCR. The amplified products were subcloned into the EcoRⅠ and XbaⅠ sites of the pcDNA3 plasmid, forming the recombinant eukaryotic expressing vector, pcDNA3-IL-15, which was then identified by the Bg1Ⅱ enzymatic digestion, PCR amplification and the sequence analysis. The construct was transfected into CHO cells by means of lipofectamine, followed by a series of determinations to screen the positive cell colonies, such as RT-PCR, SDS-PAGE, ELISA and CTLL-2 proliferation assay. Results 8 positive cell colonies highly expressed human IL-15 were obtained after G418 selection. The bioassay showed that the mean activities of the supernatants from the CHO-IL-15 cells were (318.54±32.76) U/(106 cells.d) and maintained stable after 6 months culture. Conclusions Human IL-15 cDNA was expressed efficiently and persistently in CHO cells.
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Key words interleukin-15; Chinese hamster oval cell; eukaryotic gene expression
研究表明，IL-15的生物学作用与IL-2相似，如诱导T、B和NK细胞增殖分化，诱导LAK/CTL活性，发挥抗感染、抗肿瘤作用等[1～3]。IL-15可在多种组织细胞表达，虽然原核细胞也能够高效表达蛋白质，但因其缺乏真核生物所具有的转录、翻译和翻译后等多级水平调控及修饰机制，使其应用受限。本研究采用哺乳类动物细胞表达体系对IL-15基因进行表达，以期产生更接近于体内天然状态的具有糖基化的人IL-15蛋白，为深入开展IL-15的生物学功能及临床应用研究提供条件。
1 材料和方法
质粒、菌种和细胞 质粒pBscript-SK-IL-15(含人IL-15 cDNA包括非编码区在内的574 bp序列)由本组构建，真核表达质粒pcDNA3由欧洲分子生物学实验室(EMBL)张友明博士惠赠，DH5α菌种为本室传代保存，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)由军事医学科学院赵明博士惠赠。
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酶及主要生化试剂 限制性内切酶EcoRⅠ、XbaⅠ和T4 DNA连接酶为德国Boehringer Mannheim公司产品，脂质体(lipofectamine)、Trizol试剂和RPMI-1640、CHO-S-SFMⅡ培养基均为Gibco BRL公司产品，IL-15纯品由英国NIBSC惠赠，兔抗人IL-15抗体购自PeproTech公司，生物素标记羊抗兔IgG和HRP标记链霉卵白素购自北京中山公司、噻唑蓝(MTT)为Sigma公司产品，其它试剂均为进口或国产分析纯级产品。
PCR扩增 以P1：5′-GTACGAATTCATGAGAATTTCGAAACCACATTT-3′、P2：5′-TCGATCTAGATCAAGAAGTGTTGATGAACATTT-3′作为引物，以pBs cript-SK-IL-15为模板，在50 μl体系内进行扩增。反应条件：94℃ 3 min，然后94℃ 50 s, 61℃ 50 s, 72℃ 50 s, 循环30次，最后72℃延伸5 min。
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重组表达质粒pcDNA3-IL-15的构建及鉴定 质粒的提取、酶解、纯化，DNA片段的体外连接、转化，均按文献[4]进行。重组质粒以BglⅡ酶解和PCR扩增鉴定，并进行DNA序列测定分析。
脂质体法转染CHO细胞 CHO细胞(5×105个)接种于6孔细胞培养板内，37℃、5%CO2培养，待细胞呈50%～70%融合时，以脂质体介导转染。
细胞总RNA提取及RT-PCR扩增 参照TrizolTM试剂盒说明书，提取各G418抗性细胞克隆总RNA，以Oligo(dT)为引物在AMV逆转录酶作用下反转录获得cDNA第1链，再以此作为模板，以P1，P2为引物进行PCR扩增。
SDS-PAGE检测 收集细胞上清，进行SDS-PAGE和蛋白银染分析[4]。
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IL-15活性测定 采用CTLL-2细胞依赖株增殖反应测定法[5]，每种浓度设3个复孔，实验重复3次。以IL-15标准品或待测样品中最大吸光度值作为100%，其它测定值与之相除，得出每一吸光度值所对应的百分比，然后以此百分比做纵坐标，以稀释度为横坐标，用对数正态概率纸作图。求出样品和标准品吸光度百分比为50%时的稀释倍数，再计算出活性。
ELISA法检测IL-15 用PCR扩增的阳性细胞克隆的培养上清和一定浓度的IL-15标准品包板，BSA封闭后，加入兔抗人IL-15抗体，湿盒温育，再依次加入生物素标记的羊抗兔IgG和HRP标记的链霉卵白素，分别温育后，以邻苯二胺显色。
统计学处理 采用方差分析处理数据。
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2 结果
pcDNA3-IL-15重组表达质粒的构建和鉴定结果 以pBs cript-SK-IL-15为模板，经PCR扩增出1条486 bp IL-15 cDNA片段(图1)。该片段与pcDNA3质粒定向连接后，构成pcDNA3-IL-15重组质粒。pcDNA3-IL-15经BglⅡ单酶解，获得1.1 kb和4.7 kb两个片段，而pcDNA3对照经酶解仅出现一条线性带(图2)。再以pcDNA3-IL-15作为模板，通过PCR亦扩增出一条约486 bp的片段(图略)。同时，DNA序列测定结果表明，该序列与预计相符。
图 1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig 1 Agarose electrophoresis of PCR products
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1. pBR322/HinfⅠ Marker; 2,3: PCR products
图 2 pcDNA3-IL-15重组质粒的酶切图谱分析
Fig 2 Restriction analysis of pcDNA3-IL-15 plasmid
1. λDNA/Hind Ⅲ Marker; 2. pcDNA3-IL-15/Bg1 Ⅱ; 3.pcDNA3-IL-15;4.pcDNA3/Bg1 Ⅱ; 5. pcDNA3
CHO细胞的转染及重组人IL-15表达 pcDNA3-IL-15质粒转入CHO细胞后，经G418筛选，获得8株抗性克隆，称为CHO-IL-15细胞。分别提取这8株细胞的总RNA，经RT-PCR，均扩增出特异的486 bp IL-15 cDNA片段(图3)。
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图 3 CHO-IL-15细胞克隆的RT-PCR分析
Fig 3 RT-PCR analysis of IL-15 expression in the CHO-IL-15 cell colonies
1. pBR322/HinfⅠ Marker; 2,3,4,5,6,7,8,9: RT-PCR products; 10. negative control
SDS-PAGE和ELISA结果 CHO-IL-15细胞无血清培养上清的SDS-PAGE分析显示，在相对分子质量约14 000～15 000处出现一条区带，而空载对照组CHO-neo细胞上清未见任何条带(图4)。ELISA实验证实，CHO-IL-15上清与抗人IL-15抗体发生特异结合，出现明显的酶联显色反应，上清内rIL-15的平均表达水平为(3.01±0.238)μg/ml。
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图 4 表达产物的SDS-PAGE分析
Fig 4 SDS-PAGE analysis of the supernatants from the CHO-IL-15 Cells
1. Low protein molecular weight standard; 2,3: CHO-IL15; 4. CHO-neo
重组IL-15生物活性测定结果 CTLL-2细胞依赖株增殖测定的结果表明，各株CHO-IL-15细胞培养上清内的IL-15生物学活性平均为(318.54±32.76)U/(106 cells.d)。各阳性克隆株分别传代6个月，经冻存、复苏3次后均仍保持对G418的稳定抗性和IL-15的持续表达，0、3、6个月3次生物活性测定结果显示，未见活性明显下降(P>0.05)。各克隆细胞株断续培养、冻存和复苏17个月后，Northern Blot检测结果表明，至少有5种细胞克隆即CHO-IL-15 A、B、C、D、E仍保留IL-15 mRNA转录本。
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3 讨论
人IL-15是一种新近发现的细胞因子，其cDNA含有316 bp 5′非编码区，400 bp 3′非编码区和486 bp的开放读码框架，编码N末端48个氨基酸组成的信号肽和114个氨基酸组成的成熟蛋白[6]。据文献报道，人IL-15 5′非编码区存在10个AUG密码，去除这些上游AUG将有助于mRNA转录效率的提高[7]。所以，本研究从编码信号肽的AUG起始，设计PCR引物，扩增包括信号肽和成熟蛋白在内的486 bp IL-15 cDNA。IL-15 cDNA含有一个特异的Bg1Ⅱ酶切位点，通过对PCR扩增产物的Bg1Ⅱ单酶切可以初步鉴定其序列的正确性，结果获得182 bp和306 bp两个片段，与理论估计值相符。
pcDNA3是一种公认的效率较高的质粒型真核表达载体，受控于人巨细胞病毒(CMV)启动子。IL-15 cDNA经定向克隆与pcDNA3体外重组后，首先将其转染COS-7细胞作瞬时表达，在证实其确有表达后，再转染CHO细胞。经过G418抗性筛选，共获得8株阳性克隆。RT-PCR、SDS-PAGE和ELISA检测分析分别显示了IL-15 mRNA在CHO细胞中的转录和有效表达。 为确定经ELISA定量的表达产物的生物学活性，本实验采用CTLL-2细胞增殖法对无血清培养上清进行检测，发现IL-15的平均表达活性为(318.54±32.76)U/(106 cells.d)，且连续传代6个月，经冻存、复苏3次后，各克隆表达活性未见明显变化，再经断续培养、冻存和复苏17个月后，至少有5个细胞克隆内仍保留IL-15 mRNA转录本；证明了经筛选得到的CHO抗性细胞株能够稳定表达IL-15。有关人IL-15基因在CHO细胞中的表达，尚未见报道。本研究结果表明，人IL-15在CHO细胞中已获高效稳定表达。上述结果为进一步研究IL-15的生物学功能和临床应用提供了有利的条件。
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△国家教委博士点基金(96002345)资助；#通讯作者
作者单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所免疫学室， 北京 100005
参考文献
1 Grabstein Kh, Eisenman J, Shanebeck K, et al. Cloning of a T cell growth factor that interacts with the β chain of the interleukin-2 receptor. Science, 1994, 264: 965～968
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, http://www.100md.com
3 Jullien D, Sieling PA, Uyemura K, et al. IL-15, an immunomodulator of T cell responses in intracellular infection. J Immunol, 1997, 158: 800～806
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(1998-04-20收稿), http://www.100md.com