氟与1，25双羟维生素D联用对去卵巢大鼠后肢骨的骨计量学和生物力学性质的影响△
作者：金小岚 孟迅吾 周学瀛 刘鸿瑞 杨新宇 李世英 崔 伟
单位：金小岚 周学瀛 中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院内分泌科, 北京100730；刘鸿瑞 中国医学科学院协和医院病理科；杨新宇 李世英 中国医学科学院协和医院骨科，北京 100730；崔伟 北京航天医学工程研究所，北京 100094；孟迅吾 通讯作者
关键词：骨计量学；骨生物力学；氟；1；25双羟维生素D
中国医学科学院学报990401 摘要 目的 评价促进骨形成的药物与成骨细胞分化诱导剂联用对绝经后骨质疏松的潜在治疗作用。方法 观察氟钙剂(0.45 ng F+13.56 mg Ca2+)/(k.d)单独应用(O+F)以及与1，25双羟维生素D(135 pmol/d皮下注射)联用(O+F+D)对去卵巢(OVX)大鼠胫骨近端次级松质骨骨计量学指标和股骨中段骨生物力学性质的影响。结果 与OVX组比较，O+F组、O+F+D组骨小梁面积百分比(%Tb Ar)、 骨小梁宽度(Tb Wi)、 骨小梁数量(Tb N)，成骨细胞表面(%Ob Pm)、骨小梁分离度(Tb Sp)均明显增加，而吸收侵蚀表面(%E Pm)显著降低(P<0.05， P<0.01，P<0.001)；平均骨壁宽度(W Wi)在O+F组无显著变化，而在O+F+D组则明显增加。与假手术组比较，O+F组的矿化延迟时间(MLT)明显增加(P<0.05)，而O+F+D组无显著变化，O+F和O+F+D组均未见股骨干力学强度下降。结论 上述两种处理均有防止去卵巢所致的骨量丢失和加速骨吸收、保护小梁骨显微结构、刺激骨形成的作用，而联合用药作用更为显著，并且消除了单用氟钙剂所致的潜在的矿化缺陷。两种处理均未损害股骨干的力学强度。
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中图号 R318
Effects of Combined Treatment with Flouride and 1,25-Dihydroxyvitamin
D3 on the Histomorphometry and Biomechanical Properties of Bone
in Ovariectomized Rats
D3 on the Histomorphometry and Biomechanical Properties of Bone
in Ovariectomized Rats
Jin Xiaolan Meng Xunwu# Zhou Xueying Liu Hongrui Yang Xinyu, et al
, 百拇医药
(Department of Endocrinology, PUMC Hospital, CAMS and PUMC Beijing, 100730)
Objective To evaluate the potential use of a combination of bone formation-promoting agents and a differentiation agent of osteoblast as a treatment for postmenopausal osteoporosis. Methods The effects of combined and separate administration of flouride-Ca (0.45 ng F-+13.56 mg Ca2+)/(kg.d) and 1,25-dihydroxyvitamin D (135 pmol/d s.c.) on the histomorphometric parameters in the secondary spongiosa of proximal tibia and biomechanical properties of femoral midshaft in ovariectomized (OVX) rats were examined. Results Compared with OVX group, OVX+fluoride-Ca group (O+F) and OVX+Fluoride-Ca+1,25-dihydroxyvitamin D(O+F+D) two kinds of treatment caused 42%, 91% more in %Tb Ar, 14%, 38% more in Tb Wi, 24%, 46% more in Tb N, 26%, 43% less in Tb Sp, 45%, 42% less in % E Pm, 30%, 60% more in Ob Pm respectively. W Wi in O+F treatment had no significant difference from OVX group but 15.2% in O+F+D treatment compared with sham group, MLT increased 16% in O+F group, had no difference from O+F+D. No significant alteration of mechanical strength at femoral midshaft in both O+F and O+F+D was found. There were significant difference in above changes of parameters except % Ob Pm. Conclusions Above two treatments could prevent the loss of cancellous bone, reduced the resorption caused by OVX, protected trabecular microarchitecture, and stimulated bone formation significantly. The combined treatment avoided potential mineralization defect caused by F-Ca treatment alone, and two treatments maintained mechanical strength at femoral midshaft.
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Key words bone histomorphometry; bone biomechanics; fluoride; 1,25-dihydroxyvitamin D
近年来体外实验和骨计量学研究结果表明，氟主要刺激成骨前体细胞(osteoblast precursors)增殖，而对分化成熟的成骨细胞的作用较弱[1]。活性维生素D(VD)是一种分化诱导因子，可诱导成骨细胞的分化成熟[2]，且在低剂量时并不刺激破骨细胞的活性[3]，因此，将两种药物联用，有可能同时刺激成骨细胞的增殖和分化成熟两个环节，使骨形成明显增加。此外，活性VD还可促进肠钙的吸收，对维持体内钙稳态，预防氟诱导的矿化障碍和继发性甲状旁腺功能亢进有重要作用[4]。但在整体水平，该治疗方案对骨再建和骨矿化以及皮质骨生物力学的影响尚未见报道。
本研究比较成年去卵巢大鼠在单用氟钙剂及氟钙剂与活性VD联用时骨再建及骨力学性质的变化，试图为临床防治绝经后骨质疏松提供理论和实验依据。
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1 材料和方法
动物模型的建立和给药 选用24只4月龄未交配过的健康雌性Wistar大鼠(军事医学科学院动物中心提供，体重230～280 g)，随机分为4组(每组6只)：假手术组(sham)，去卵巢不处理组(OVX)，去卵巢应用氟钙剂组(O+F)，去卵巢用氟钙剂加活性VD组(O+F+D)。动物均饲予标准饲料(含1%钙、0.74%磷，中国医学科学院动物中心提供)，自由饮水，适应性饲养两周后行去卵巢手术，假手术组除不去卵巢外，手术方法同去卵巢组。氟钙剂(意大利罗达药厂生产)剂量：按(0.45 mg F+13.56 mg Ca2+)/(kg.d)灌胃，活性VD 1，25(OH)2D3(瑞士罗氏药厂产品)溶于丙二醇中，以135 pmol/d皮下注射，每周给药6 d。于去卵巢手术次日开始给药，疗程为7周。
标本的收集及处理 处死动物前第6天和第2天，分别用Calcein(20 mg/kg)一次性腹腔注射进行标记。处死前称量体重，右心室采血(离心后取血清，-70℃冻存备用)。处死后取左胫骨置于预冷的70%的乙醇中，于4℃冰箱固定，以备作骨计量学分析。取右股骨放入生理盐水中并置4℃冰箱以备作骨生物力学试验用。
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骨切片的制备[5] 胫骨标本经乙醇脱水，甲基丙烯酸甲酯包埋，切片(5、10 μm两种不脱钙骨切片)。薄片分别作Golder′s trichrome和Von kossa染色，用于计量学静态指标测定；厚片不染色，在荧光显微镜下作动态指标测定。以半自动图像数字化分析仪进行骨计量学分析(测量胫骨干骺端生长板下1～3 mm范围内次级松质骨)。采用标准的骨计量学术语命名各原始指标和派生参数[6]，各种测量指标及计算公式见表1。
表 1 胫骨近端干骺端网状骨的骨计量学指标推算方法[6]
Table 1 Calculation of proximal tibial metaphyseal cancellous bone Calculated parameters
Abbreviations
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Formulae
Units
Percent trabecular area
%Tb Ar
Tb.Ar/T Ar×100
%
Trabecular width
Tb Wi
(2000/1.199)×Tb Ar/Tb Pm
μm
Trabecular number
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Tb N
1.199/2×Tb Pm/T Ar
No./mm2
Trabecular separation
Tb Sp
(2000/1.199)×(T Ar-Tb Ar)/Tb Pm
μm
Percent eroded perimeter
%E Pm
E Pm/Tb Pm×100
, http://www.100md.com %
Percent labeled perimeter
%L Pm
(dL Pm+sL Pm/2)/Tb Pm×100
%
Mineral apposition rate
MAR
Ir L Wi/Interval
μm/d
Mineralization lag time
MLT
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O Wi/MAR
day
Percent osteoblast perimeter
%Ob Pm
Ob Pm/Tb Pm×100
%
Activation frequency
Act F
1/(Rm P+QP)×365
cycle/yr
骨生物力学测定 以QTS-25型肌理分析仪进行股骨中段的三点弯曲试验，加载速度为7 mm/min，跨距：26.3 mm。测定最大载荷(N)、弹性载荷(N)，最大桡度和弹性桡度(mm)，并直接从载荷-变形曲线上求得上述四项参数。按下列方法求出最大应力(stress):当标本被加载达到最大载荷而发生断裂时，测量断裂处最大外径(B)、最大内径(b)、最小外径(H)和最小内径(h)，按下面公式求出截面惯性矩(J)[7]。
，将求出的截面惯性矩代入以下公式即可求出最大应力
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骨骼的刚度(stiffness,用曲线弹性区的斜率来表示)=
血生化指标的测定 (1) 血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)测定：按文献[8]方法进行(测定试剂购自美国Sigma公司)，批内变异系数为4%，所有标本的测定一批完成；(2) 血清钙、磷和碱性磷酸酶(AKP)的测定：以生化自动分析仪分别采用磷甲酚肽络合酮法、抗坏血酸还原法和对硝基酚磷酸盐法进行测定，一批完成。
统计学处理 实验结果以均值±标准差(
±s)表示，用Epistat统计程序作方差分析，并进行各组间比较。
2 结果
治疗后骨计量学指标的变化
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骨计量学结构参数的变化：与Sham组比较，OVX组骨小梁面积百分比(%Tb Ar)下降39.4%(P<0.01)。其余各组的%Tb Ar、小梁宽度(Tb Wi)、小梁数量(Tb N)、小梁分离度(Tb SP)的变化见表2。
表 2 治疗后网质骨结构指标的变化
Table 2 Effect of treatments on structural parameters of cancellous bone
n
Tb Ar(%)
Tb Wi(μm)
Tb N(No./mm2)
Tb Sp(μm)
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Sham
6
27.21±5.96
48.59±6.87
5.66±0.88
129.50±34.93
OVX
6
16.48±2.80*
45.28±4.15
3.80±0.33*
233.63±36.41***
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O+F
6
23.37±3.47▲▲
51.59±5.13▲
4.73±0.46*▲▲
172.27±15.19*▲
O+F+D
6
31.55±7.33▲▲#
62.71±4.75*▲▲▲#
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5.56±0.85▲▲▲
133.52±32.69▲▲▲#
*P<0.05， ***P<0.001 vs sham; ▲P<0.05, ▲▲P<0.01, ▲▲▲P<0.001 vs OVX; # P<0.05 vs O+F
骨计量学反映细胞活性的参数的变化： 各组成骨细胞表面(%Ob Pm)、总标记表面(%L Pm)、平均骨壁宽度(W Wi)、矿化沉积率(MAR)、吸收侵蚀表面(%E Pm)等指标的变化见表3。
骨矿化的指标的变化：各组矿化延迟时间(MLT)的变化见表3，类骨质宽度(O Wi)各组间差异无显著性(P>0.05)。
表 3 治疗后骨细胞活性的变化
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Table 3 Effect of treatments on cellular activities
n
Ob Pm(%)
L Pm(%)
W Wi(μm)
MAR/(μm.d)
EPm(%)
MLT(d)
Sham
6
2.40±0.37
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12.91±4.19
15.86±1.02
1.93±0.15
3.06±0.67
2.92±0.32
OVX
6
4.96±1.84*
27.33±7.26*
20.32±1.30***
2.31±0.26*
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6.12±2.72*
2.91±0.33
O+F
6
6.44±0.71*
21.99±3.56*
20.35±1.25***
2.53±0.32*
3.34±1.15▲
3.38±0.50*
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O+F+D
6
7.94±2.99*
21.01±2.53*
23.40±2.99***▲▲▲#
2.56±0.32*
3.52±2.35▲
2.61±0.25###
*P<0.05， ***P<0.001 vs sham; ▲P<0.05, ▲▲▲P<0.001 vs OVX; # P<0.05，###P<0.001 vs O+F；d.days
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股骨生物力学性质的变化 各组股骨中段最大载荷(L-max)的变化见表4。但股骨刚度(stiffness)、股骨应力、弹性桡度(D-e)及最大桡度(D-max)等指标各组间差异均无显著性(P>0.05)。
血生化指标的变化 各组AKP、TRAP的变化见表4。血清钙、磷含量各组间差异无显著性(P>0.05)。
表 4 治疗后股骨生物力学和血清AKP和TRAP的变化
Table 4 Changes of femoral biomechanical and serum biochemical parameters
n
L-max
Stiffness
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D-e
D-max
AKP
TRAP
Sham
6
83.80±8.00
130.00±26.00
0.48±0.11
1.09±0.20
78.60±9.70
19.60±2.40
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OVX
6
84.90±12.80
110.10±11.80
0.57±0.08
1.11±0.17
139.80±24.20*
45.60±15.20***
O+F
6
93.24±4.60*
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127.10±6.20
0.59±0.10
1.08±0.15
93.50±10.40*▲▲▲
26.50±3.90***▲▲▲
O+F+D
6
78.80±10.90#
139.00±25.70
0.44±0.19
0.78±0.18
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150.60±15.20*###
28.50±7.40***▲▲▲
*P<0.05， ***P<0.001 vs sham; ▲▲▲P<0.001 vs OVX; # P<0.05，###P<0.001 vs O+F L-max: maximal load; D-e: elastic deformation; D-max: maximal deformation
3 讨论
本实验模型大鼠在去卵巢7周后，其胫骨干骺端次级小梁骨骨量比假手术组减少39.4%(P<0.01)(表2)，与Wronski[9]的研究结果一致，表明动物模型的建立是成功的。此外，去卵巢后骨转换加速，小梁分离度明显增大，小梁数显著减少，而小梁宽度则无明显改变。这表明去卵巢所致的雌激素缺乏早期，骨量丢失的主要机制是破骨细胞活性增强，导致小梁骨“穿孔”吸收，结构破坏；而小梁骨水平的骨再建负平衡所致的骨量减少则居于次要地位。对于去卵巢大鼠分别以单用氟钙剂和氟钙剂+活性VD进行预防性治疗，结果显示，两种处理均可明显增加成骨细胞的表面及平均骨壁宽度，而后一种处理刺激成骨的效应更强。有报道指出，活性VD能增加人成骨细胞样细胞胰岛素样生长因子-Ⅰ的产生[10]和刺激转化生长因子-β样活性[11]，而氟刺激成骨细胞增殖，主要是提高成骨细胞对生长因子的敏感性[12]；因此，两者合用可通过刺激成骨细胞的增殖与分化两个环节，更大限度地增加骨量。尽管本实验两种处理均使成骨细胞表面增加，但单用氟钙剂处理组血清硷性磷酸酶未见明显增高，而在氟钙剂与活性VD合用组却显著升高。提示单用氟处理主要刺激成骨前体细胞的增殖，而加用活性VD则除了刺激成骨细胞增殖外，还诱导其分化成熟。
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虽然，上述两种处理均显著刺激成骨过程，但是吸收表面并未见明显增加，表明氟在刺激成骨的同时，并没有明显增加骨吸收；从而防止去卵巢鼠骨量的丢失。本实验用低剂量的氟钙剂处理去卵巢大鼠，虽然未见类骨质明显增厚，但矿化延迟时间延长，表明仍有潜在的抑制矿化的作用；而加用活性VD使矿化延迟时间接近Sham组水平，消除了矿化缺陷。
骨的生物力学性质是全面评价骨的质量的一项可靠指标，它是骨量、骨结构连续性、骨皮质厚度及骨的材料特性的综合反映；因此，是一种防治措施的最终疗效的评价指标。氟刺激松质骨的成骨作用基本上得到公认，但关于它对皮质骨代谢的影响，目前研究得不多，尤其是对皮质骨生物力学的影响报道更少，结论也不一致。美国Mayo Clinic的研究结果表明，氟虽能明显增加治疗组椎骨骨密度，但使皮质骨的骨密度反而下降，骨折率也明显高于对照组，尽管在试验中给予补充钙[13]。这些结果提示氟治疗可引起骨矿从皮质骨向松质骨再分布。他们对上述患者的骨计量学研究结果表明，用氟治疗的患者有明显的骨软化和继发性甲状旁腺功能亢进的迹象[14]，提示在氟的强烈刺激成骨作用下，可使机体发生钙缺乏。本实验采用的大鼠股骨中段的三点弯曲力学试验，主要反映皮质骨的力学性质。结果发现，单用氟钙剂组与假手术组比较，前者最大载荷明显增加；而氟钙剂与活性VD联用组与假手术组比较，两组间无明显差别。表明用低剂量氟钙剂和活性VD，在增加小梁骨骨量的同时并不引起发生皮质骨矿盐“偷劫”现象，皮质骨强度并无明显下降。
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△国家自然科学基金(3937074)，中国医学科学院基金(91006)资助；
参考文献
1 Kassem M, Mosekilde L, Eriksen EF, et al. 1,25-Dihydroxyvitamin D, potentiation fluoride-stimulated collagen type Ⅰ production in cultures of human bone morrow stromal osteoblast-like cells. J Bone Miner Res, 1993, 8:1453～1458
2 Reichel H, Koeffler P, Norman AW, et al. The role of vitamin D endocrine system in health and disease. N Engl J Med, 1989, 320:980～991
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7 Katsumata T, Nakamura T, Ohnishi H, et al. Intermittent cyclical etidronate treatment maintains the mass, structure and mechanical property of bone in ovariectomized rats. J Bone Miner Res, 1995, 10:921～931
8 孟迅吾，邢小平，陈 莉，等.血清抗酒石酸酸性磷酸酶浓度测定的初步临床应用.中华内分泌代谢杂志，1995，11：9～11
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9 Wronski TJ, Lowry PL, Walsh CC, et al. Skeletal alterations in ovariectomized rats. Calcif Tissue Int, 1985, 37:324～328
10 Chenu C, Valentin-Operan A, Chavassieux P, et al. Insulin-like growth factor Ⅰ (IGF-I) hormonal regulation by growth hormone and 1,25 (OH) D and activity on human osteoblast-like cells in short-term cultures. Bone, 1990,11:81～86
11 Pethovich PM, Wrana JL, Grigoriadis AE, et al. 1,25-dihydroxyvatimin D increases epidermal growth factor receptors and transforming growth factor β-like activity in a bone-derived cell line. J Biol Chem, 1987, 262: 13424～13428
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13 Riggs BL, Hodgson SF, O Fallon WM, et al. Effect of fluoride treatment on fracture rate in postmenopausal women with osteoporosis. N Engl J Med, 1990, 322:802～809
14 Lundy MW, Stauffer M, Wergedal, JE, et al. Histomorphometric analysis of iliac crest bone biopsies in placebo-treated versus fluoride-treated subjects. Osteoporosis Int, 1995, 5:115～129
(1997-09-10收稿), 百拇医药
单位：金小岚 周学瀛 中国医学科学院 中国协和医科大学 协和医院内分泌科, 北京100730；刘鸿瑞 中国医学科学院协和医院病理科；杨新宇 李世英 中国医学科学院协和医院骨科，北京 100730；崔伟 北京航天医学工程研究所，北京 100094；孟迅吾 通讯作者
关键词：骨计量学；骨生物力学；氟；1；25双羟维生素D
中国医学科学院学报990401 摘要 目的 评价促进骨形成的药物与成骨细胞分化诱导剂联用对绝经后骨质疏松的潜在治疗作用。方法 观察氟钙剂(0.45 ng F+13.56 mg Ca2+)/(k.d)单独应用(O+F)以及与1，25双羟维生素D(135 pmol/d皮下注射)联用(O+F+D)对去卵巢(OVX)大鼠胫骨近端次级松质骨骨计量学指标和股骨中段骨生物力学性质的影响。结果 与OVX组比较，O+F组、O+F+D组骨小梁面积百分比(%Tb Ar)、 骨小梁宽度(Tb Wi)、 骨小梁数量(Tb N)，成骨细胞表面(%Ob Pm)、骨小梁分离度(Tb Sp)均明显增加，而吸收侵蚀表面(%E Pm)显著降低(P<0.05， P<0.01，P<0.001)；平均骨壁宽度(W Wi)在O+F组无显著变化，而在O+F+D组则明显增加。与假手术组比较，O+F组的矿化延迟时间(MLT)明显增加(P<0.05)，而O+F+D组无显著变化，O+F和O+F+D组均未见股骨干力学强度下降。结论 上述两种处理均有防止去卵巢所致的骨量丢失和加速骨吸收、保护小梁骨显微结构、刺激骨形成的作用，而联合用药作用更为显著，并且消除了单用氟钙剂所致的潜在的矿化缺陷。两种处理均未损害股骨干的力学强度。
, 百拇医药
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Effects of Combined Treatment with Flouride and 1,25-Dihydroxyvitamin
D3 on the Histomorphometry and Biomechanical Properties of Bone
in Ovariectomized Rats
D3 on the Histomorphometry and Biomechanical Properties of Bone
in Ovariectomized Rats
Jin Xiaolan Meng Xunwu# Zhou Xueying Liu Hongrui Yang Xinyu, et al
, 百拇医药
(Department of Endocrinology, PUMC Hospital, CAMS and PUMC Beijing, 100730)
Objective To evaluate the potential use of a combination of bone formation-promoting agents and a differentiation agent of osteoblast as a treatment for postmenopausal osteoporosis. Methods The effects of combined and separate administration of flouride-Ca (0.45 ng F-+13.56 mg Ca2+)/(kg.d) and 1,25-dihydroxyvitamin D (135 pmol/d s.c.) on the histomorphometric parameters in the secondary spongiosa of proximal tibia and biomechanical properties of femoral midshaft in ovariectomized (OVX) rats were examined. Results Compared with OVX group, OVX+fluoride-Ca group (O+F) and OVX+Fluoride-Ca+1,25-dihydroxyvitamin D(O+F+D) two kinds of treatment caused 42%, 91% more in %Tb Ar, 14%, 38% more in Tb Wi, 24%, 46% more in Tb N, 26%, 43% less in Tb Sp, 45%, 42% less in % E Pm, 30%, 60% more in Ob Pm respectively. W Wi in O+F treatment had no significant difference from OVX group but 15.2% in O+F+D treatment compared with sham group, MLT increased 16% in O+F group, had no difference from O+F+D. No significant alteration of mechanical strength at femoral midshaft in both O+F and O+F+D was found. There were significant difference in above changes of parameters except % Ob Pm. Conclusions Above two treatments could prevent the loss of cancellous bone, reduced the resorption caused by OVX, protected trabecular microarchitecture, and stimulated bone formation significantly. The combined treatment avoided potential mineralization defect caused by F-Ca treatment alone, and two treatments maintained mechanical strength at femoral midshaft.
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Key words bone histomorphometry; bone biomechanics; fluoride; 1,25-dihydroxyvitamin D
近年来体外实验和骨计量学研究结果表明，氟主要刺激成骨前体细胞(osteoblast precursors)增殖，而对分化成熟的成骨细胞的作用较弱[1]。活性维生素D(VD)是一种分化诱导因子，可诱导成骨细胞的分化成熟[2]，且在低剂量时并不刺激破骨细胞的活性[3]，因此，将两种药物联用，有可能同时刺激成骨细胞的增殖和分化成熟两个环节，使骨形成明显增加。此外，活性VD还可促进肠钙的吸收，对维持体内钙稳态，预防氟诱导的矿化障碍和继发性甲状旁腺功能亢进有重要作用[4]。但在整体水平，该治疗方案对骨再建和骨矿化以及皮质骨生物力学的影响尚未见报道。
本研究比较成年去卵巢大鼠在单用氟钙剂及氟钙剂与活性VD联用时骨再建及骨力学性质的变化，试图为临床防治绝经后骨质疏松提供理论和实验依据。
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1 材料和方法
动物模型的建立和给药 选用24只4月龄未交配过的健康雌性Wistar大鼠(军事医学科学院动物中心提供，体重230～280 g)，随机分为4组(每组6只)：假手术组(sham)，去卵巢不处理组(OVX)，去卵巢应用氟钙剂组(O+F)，去卵巢用氟钙剂加活性VD组(O+F+D)。动物均饲予标准饲料(含1%钙、0.74%磷，中国医学科学院动物中心提供)，自由饮水，适应性饲养两周后行去卵巢手术，假手术组除不去卵巢外，手术方法同去卵巢组。氟钙剂(意大利罗达药厂生产)剂量：按(0.45 mg F+13.56 mg Ca2+)/(kg.d)灌胃，活性VD 1，25(OH)2D3(瑞士罗氏药厂产品)溶于丙二醇中，以135 pmol/d皮下注射，每周给药6 d。于去卵巢手术次日开始给药，疗程为7周。
标本的收集及处理 处死动物前第6天和第2天，分别用Calcein(20 mg/kg)一次性腹腔注射进行标记。处死前称量体重，右心室采血(离心后取血清，-70℃冻存备用)。处死后取左胫骨置于预冷的70%的乙醇中，于4℃冰箱固定，以备作骨计量学分析。取右股骨放入生理盐水中并置4℃冰箱以备作骨生物力学试验用。
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骨切片的制备[5] 胫骨标本经乙醇脱水，甲基丙烯酸甲酯包埋，切片(5、10 μm两种不脱钙骨切片)。薄片分别作Golder′s trichrome和Von kossa染色，用于计量学静态指标测定；厚片不染色，在荧光显微镜下作动态指标测定。以半自动图像数字化分析仪进行骨计量学分析(测量胫骨干骺端生长板下1～3 mm范围内次级松质骨)。采用标准的骨计量学术语命名各原始指标和派生参数[6]，各种测量指标及计算公式见表1。
表 1 胫骨近端干骺端网状骨的骨计量学指标推算方法[6]
Table 1 Calculation of proximal tibial metaphyseal cancellous bone Calculated parameters
Abbreviations
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Formulae
Units
Percent trabecular area
%Tb Ar
Tb.Ar/T Ar×100
%
Trabecular width
Tb Wi
(2000/1.199)×Tb Ar/Tb Pm
μm
Trabecular number
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Tb N
1.199/2×Tb Pm/T Ar
No./mm2
Trabecular separation
Tb Sp
(2000/1.199)×(T Ar-Tb Ar)/Tb Pm
μm
Percent eroded perimeter
%E Pm
E Pm/Tb Pm×100
, http://www.100md.com %
Percent labeled perimeter
%L Pm
(dL Pm+sL Pm/2)/Tb Pm×100
%
Mineral apposition rate
MAR
Ir L Wi/Interval
μm/d
Mineralization lag time
MLT
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O Wi/MAR
day
Percent osteoblast perimeter
%Ob Pm
Ob Pm/Tb Pm×100
%
Activation frequency
Act F
1/(Rm P+QP)×365
cycle/yr
骨生物力学测定 以QTS-25型肌理分析仪进行股骨中段的三点弯曲试验，加载速度为7 mm/min，跨距：26.3 mm。测定最大载荷(N)、弹性载荷(N)，最大桡度和弹性桡度(mm)，并直接从载荷-变形曲线上求得上述四项参数。按下列方法求出最大应力(stress):当标本被加载达到最大载荷而发生断裂时，测量断裂处最大外径(B)、最大内径(b)、最小外径(H)和最小内径(h)，按下面公式求出截面惯性矩(J)[7]。
，将求出的截面惯性矩代入以下公式即可求出最大应力, http://www.100md.com
骨骼的刚度(stiffness,用曲线弹性区的斜率来表示)=
血生化指标的测定 (1) 血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)测定：按文献[8]方法进行(测定试剂购自美国Sigma公司)，批内变异系数为4%，所有标本的测定一批完成；(2) 血清钙、磷和碱性磷酸酶(AKP)的测定：以生化自动分析仪分别采用磷甲酚肽络合酮法、抗坏血酸还原法和对硝基酚磷酸盐法进行测定，一批完成。
统计学处理 实验结果以均值±标准差(
±s)表示，用Epistat统计程序作方差分析，并进行各组间比较。2 结果
治疗后骨计量学指标的变化
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骨计量学结构参数的变化：与Sham组比较，OVX组骨小梁面积百分比(%Tb Ar)下降39.4%(P<0.01)。其余各组的%Tb Ar、小梁宽度(Tb Wi)、小梁数量(Tb N)、小梁分离度(Tb SP)的变化见表2。
表 2 治疗后网质骨结构指标的变化
Table 2 Effect of treatments on structural parameters of cancellous bone
n
Tb Ar(%)
Tb Wi(μm)
Tb N(No./mm2)
Tb Sp(μm)
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Sham
6
27.21±5.96
48.59±6.87
5.66±0.88
129.50±34.93
OVX
6
16.48±2.80*
45.28±4.15
3.80±0.33*
233.63±36.41***
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O+F
6
23.37±3.47▲▲
51.59±5.13▲
4.73±0.46*▲▲
172.27±15.19*▲
O+F+D
6
31.55±7.33▲▲#
62.71±4.75*▲▲▲#
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5.56±0.85▲▲▲
133.52±32.69▲▲▲#
*P<0.05， ***P<0.001 vs sham; ▲P<0.05, ▲▲P<0.01, ▲▲▲P<0.001 vs OVX; # P<0.05 vs O+F
骨计量学反映细胞活性的参数的变化： 各组成骨细胞表面(%Ob Pm)、总标记表面(%L Pm)、平均骨壁宽度(W Wi)、矿化沉积率(MAR)、吸收侵蚀表面(%E Pm)等指标的变化见表3。
骨矿化的指标的变化：各组矿化延迟时间(MLT)的变化见表3，类骨质宽度(O Wi)各组间差异无显著性(P>0.05)。
表 3 治疗后骨细胞活性的变化
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Table 3 Effect of treatments on cellular activities
n
Ob Pm(%)
L Pm(%)
W Wi(μm)
MAR/(μm.d)
EPm(%)
MLT(d)
Sham
6
2.40±0.37
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12.91±4.19
15.86±1.02
1.93±0.15
3.06±0.67
2.92±0.32
OVX
6
4.96±1.84*
27.33±7.26*
20.32±1.30***
2.31±0.26*
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6.12±2.72*
2.91±0.33
O+F
6
6.44±0.71*
21.99±3.56*
20.35±1.25***
2.53±0.32*
3.34±1.15▲
3.38±0.50*
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O+F+D
6
7.94±2.99*
21.01±2.53*
23.40±2.99***▲▲▲#
2.56±0.32*
3.52±2.35▲
2.61±0.25###
*P<0.05， ***P<0.001 vs sham; ▲P<0.05, ▲▲▲P<0.001 vs OVX; # P<0.05，###P<0.001 vs O+F；d.days
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股骨生物力学性质的变化 各组股骨中段最大载荷(L-max)的变化见表4。但股骨刚度(stiffness)、股骨应力、弹性桡度(D-e)及最大桡度(D-max)等指标各组间差异均无显著性(P>0.05)。
血生化指标的变化 各组AKP、TRAP的变化见表4。血清钙、磷含量各组间差异无显著性(P>0.05)。
表 4 治疗后股骨生物力学和血清AKP和TRAP的变化
Table 4 Changes of femoral biomechanical and serum biochemical parameters
n
L-max
Stiffness
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D-e
D-max
AKP
TRAP
Sham
6
83.80±8.00
130.00±26.00
0.48±0.11
1.09±0.20
78.60±9.70
19.60±2.40
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OVX
6
84.90±12.80
110.10±11.80
0.57±0.08
1.11±0.17
139.80±24.20*
45.60±15.20***
O+F
6
93.24±4.60*
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127.10±6.20
0.59±0.10
1.08±0.15
93.50±10.40*▲▲▲
26.50±3.90***▲▲▲
O+F+D
6
78.80±10.90#
139.00±25.70
0.44±0.19
0.78±0.18
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150.60±15.20*###
28.50±7.40***▲▲▲
*P<0.05， ***P<0.001 vs sham; ▲▲▲P<0.001 vs OVX; # P<0.05，###P<0.001 vs O+F L-max: maximal load; D-e: elastic deformation; D-max: maximal deformation
3 讨论
本实验模型大鼠在去卵巢7周后，其胫骨干骺端次级小梁骨骨量比假手术组减少39.4%(P<0.01)(表2)，与Wronski[9]的研究结果一致，表明动物模型的建立是成功的。此外，去卵巢后骨转换加速，小梁分离度明显增大，小梁数显著减少，而小梁宽度则无明显改变。这表明去卵巢所致的雌激素缺乏早期，骨量丢失的主要机制是破骨细胞活性增强，导致小梁骨“穿孔”吸收，结构破坏；而小梁骨水平的骨再建负平衡所致的骨量减少则居于次要地位。对于去卵巢大鼠分别以单用氟钙剂和氟钙剂+活性VD进行预防性治疗，结果显示，两种处理均可明显增加成骨细胞的表面及平均骨壁宽度，而后一种处理刺激成骨的效应更强。有报道指出，活性VD能增加人成骨细胞样细胞胰岛素样生长因子-Ⅰ的产生[10]和刺激转化生长因子-β样活性[11]，而氟刺激成骨细胞增殖，主要是提高成骨细胞对生长因子的敏感性[12]；因此，两者合用可通过刺激成骨细胞的增殖与分化两个环节，更大限度地增加骨量。尽管本实验两种处理均使成骨细胞表面增加，但单用氟钙剂处理组血清硷性磷酸酶未见明显增高，而在氟钙剂与活性VD合用组却显著升高。提示单用氟处理主要刺激成骨前体细胞的增殖，而加用活性VD则除了刺激成骨细胞增殖外，还诱导其分化成熟。
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虽然，上述两种处理均显著刺激成骨过程，但是吸收表面并未见明显增加，表明氟在刺激成骨的同时，并没有明显增加骨吸收；从而防止去卵巢鼠骨量的丢失。本实验用低剂量的氟钙剂处理去卵巢大鼠，虽然未见类骨质明显增厚，但矿化延迟时间延长，表明仍有潜在的抑制矿化的作用；而加用活性VD使矿化延迟时间接近Sham组水平，消除了矿化缺陷。
骨的生物力学性质是全面评价骨的质量的一项可靠指标，它是骨量、骨结构连续性、骨皮质厚度及骨的材料特性的综合反映；因此，是一种防治措施的最终疗效的评价指标。氟刺激松质骨的成骨作用基本上得到公认，但关于它对皮质骨代谢的影响，目前研究得不多，尤其是对皮质骨生物力学的影响报道更少，结论也不一致。美国Mayo Clinic的研究结果表明，氟虽能明显增加治疗组椎骨骨密度，但使皮质骨的骨密度反而下降，骨折率也明显高于对照组，尽管在试验中给予补充钙[13]。这些结果提示氟治疗可引起骨矿从皮质骨向松质骨再分布。他们对上述患者的骨计量学研究结果表明，用氟治疗的患者有明显的骨软化和继发性甲状旁腺功能亢进的迹象[14]，提示在氟的强烈刺激成骨作用下，可使机体发生钙缺乏。本实验采用的大鼠股骨中段的三点弯曲力学试验，主要反映皮质骨的力学性质。结果发现，单用氟钙剂组与假手术组比较，前者最大载荷明显增加；而氟钙剂与活性VD联用组与假手术组比较，两组间无明显差别。表明用低剂量氟钙剂和活性VD，在增加小梁骨骨量的同时并不引起发生皮质骨矿盐“偷劫”现象，皮质骨强度并无明显下降。
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△国家自然科学基金(3937074)，中国医学科学院基金(91006)资助；
参考文献
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(1997-09-10收稿), 百拇医药