解脲脲原体感染对精子功能影响的实验研究
作者：万长春 汪弘 商学军 黄宇烽 朱成鸿 汤玉琴
单位：万长春，汪弘，朱成鸿，汤玉琴 江苏金湖县人民医院，江苏金湖(211600)，商学军，黄宇烽 南京军区南京总医院全军医学检验中心(210002)
关键词：解脲脲原体；精子功能；实验研究
临床检验杂志990431 摘要 研究解脲脲原体感染对精子功能的影响。正常精液一式二份，一份用解脲脲原体Ⅳ型人工感染正常精子，一份作对照，于感染后4 h,8 h,16 h,24 h的不同时间观察精子的低渗肿胀试验、精子爬高试验、精子活力及活率。结果，正常精子受解脲脲原体Ⅳ型感染8 h，爬高高度低于对照组(48.1 mm±4.2 mm对69.5 mm±1.6 mm，P<0.05)；感染16 h g形精子百分率、活力、活率明显下降；感染24 h精子总肿胀率明显低于对照组(12.75%±8.98%对75.50%±4.88%，P<0.01)。解脲脲原体Ⅳ型对精子低渗肿胀率和毛细管中爬高力有明显影响，是解脲脲原体引起男性不育的病因之一。
, 百拇医药
Laboratory study on the function of spermatozoa with infection of Ureaplasma urealyticum
WAN Changchun,WAN Hong,SHANG Xuejun*,et al.
(Jinhu Hospital Jinhu Jiangsu 211600)
Abstract Study on the function of spermatozoa which were infected with type Ⅳ of Ureaplasma urealyticum (Uu).Normal semen were divided into two groups,one for factitious infection of Uu,the other for control.The sperm activity and motile ratio,hypoosmotic swelling test(HOS)and sperm penetration in capillary in 4 h,8 h,16 h, and 24 h after infection with Uu.The height of sperm crawling was conspicuously lower in the group which had been infected by Uu for 8 h than in the control group(48.1 mm±4.2 mm in the infected group,69.5 mm±1.6 mm in the control,P<0.05).The ratio of“g”type of sperm，sperm activity and motility ratio descended obviously after Uu infection in 16 hr.The total ratio of HOS was significantly lower in the group of Uu infection in 24 h than that in the control group(12.75%±8.98% against 75.50%±4.88%，P<0.01).The infection of Ⅳ type of Uu affected HOS ratio and activity of sperm penetration in capillary conspicuously and served as one of the reasons which caused male sterility.
, 百拇医药
Key words Ureaplasma urealyticum； sperm function； Laboratory study
1973年，Gnarpe从一组不明原因患者的精液中分离出解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,UU)，提出了UU的生殖道感染与男性不育有关，迄今为止，各国有关学者对脲原体与不育进行了广泛的研究，但结果又不尽相同。本研究通过建立人工感染UU精子模型，直观探讨解脲脲原体感染对人精子功能的影响，阐明UU引起不育的可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验对象 正常生育男性自愿者，禁欲48 h～72 h，以无菌生理盐水清洗阴茎，手淫法留取精液于消毒无菌的容器中待用。
1.2 器械 Olympus BH-2型相差显微镜，B5060EK型CO2培养箱，Olympus-CK型倒置显微镜；0.9～1.1 mm×120 mm玻璃毛细管；精液池等。
, http://www.100md.com
1.3 UU血清型Ⅳ标准菌株及培养基 购自中国医学科学院皮肤病研究所。
1.4 UU体外培养 将UU标准菌株复苏后，在无菌条件下接种于UU培养基中，37°C孵育18 h～24 h后，观察结果，若培养基颜色由黄色刚转变为橙红色，再接种几次，直至接种后孵育16 h～18 h培养基出现橙红色变，此时UU处于对数生长期，繁殖速度最快，活力最强。
1.5 UU效价滴定 UU效价以颜色变化单位(CCU/ml)表示，将处于对数生长期的UU倍比稀释，接种于40孔培养板，37°C孵育48 h，观察结果，颜色变红的最高稀释孔的稀释度即为UU效价。本实验室所用UU效价为8.4×106 CCU/ml。
1.6 人工感染UU 取8名生育男性精液500 r/min离心15 min，弃去精浆，沉淀的精子用含10%人血清的Earle′s培养液洗涤后分装于5支5 ml Falcon管中，离心10 min，弃上清，用手指轻弹试管底数下，将沉淀打散，然后沿管壁缓慢加入含10%人血清的Earle′s液0.8 ml，37°C，5% CO2培养箱中上游40分钟，取上层液0.5 ml，经上泳法选取活率在90%以上的精子，并用Earle′s液调精子密度为10×106/ml，将处于对数生长期(in-log-phase)UU液体培养基5 ml，20 000 r/min离心(4°C)30 min，弃上清液，沉淀团用0.5 ml精子悬液悬浮，使最终浓度为20～40 CCU/精子，另分别取0.5 ml精子悬液作为对照，置37°C，5%CO2孵育。在4 h，8 h，16 h，24 h分别做精子低渗肿胀试验，精子爬高试验，活力及活率观察。
, http://www.100md.com
1.7 精子低渗肿胀试验 按文献操作[1]于Olympus BH-2型相差显微镜下观察精子总肿胀率，g形精子百分离。
1.8 精子爬高试验 规格为内径0.9～1.1 mm，长120 mm的玻璃管中注入Earle′s培养液，顶端用胶泥封口，下端重直插入含有精子悬液的精液池，37°C水浴箱内1 h，倒置显微镜下观察毛细管中精子>5/Hp到达的最高高度。
1.9 精子活力、活率分析 见参考文献[2]
2 结果
2.1 UU感染前后精子总肿胀率，g形精子百分率，精子爬高试验比较分析见表1。
精子受UU感染4 h对精子功能无明显影响；8 h精子爬高试验，感染组低于对照组(48.1±4.2 mm对69.5±1.6 mm，P<0.05)；感染16 h精子总肿胀率，g形精子百分率明显低于对照组(P<0.01)；感染24 h g形精子百分率为0。
, http://www.100md.com
表1 UU感染前后精子总肿胀率、g形精子百分率及精子爬高试验比较分析(
±s)
Table 1 The total ratio of HOS,the ratio of“g”type of sperm,the height of sperm crawling between the sperm for control and the sperm infected by UU(±s) Time
The total ratio of HOS of sperm
The ration of“g”type of sperm
The height of sperm crawling(mm)
, 百拇医药
Control group
Infection group
Control group
Infection group
Control group
Infection group
4h
79.75±5.56
76.25±8.48
23.50±3.11
21.02±5.28
, 百拇医药
70.2±1.8
63.0±2.7
8h
77.75±6.03
68.25±8.59
22.40±4.23
18.75±6.22
69.5±1.6
48.1±4.2△
16h
, http://www.100md.com 76.50±4.79
42.50±6.89*
21.50±3.65
9.75±3.09*
63.5±1.7
30.2±3.4*
24h
75.50±4.88
12.75±8.99*
19.78±2.94
, 百拇医药
0*
54.0±1.9
6.2±1.5*
△ The contrast of the control group and the group of UU infection P<0.05；* P<0.01
2.2 UU感染前后精子活率(中位数)及活力的比较见表2。表2 UU感染前后精子活率(中位数)及活力的比较
Table 2 The sperm motile ratio′s(the middle figure)and activity contrast of the sperm of control and the sperm infected by UU Time
, http://www.100md.com
Motile ratio(%)
Activity(level)
Control
group
Infection
group
Control
group
Infection
group
4h
78.0
, 百拇医药
74.0
b-a
b-a
8h
76.0
69.2
b-a
c-a
16h
73.0
34.2
b-a
c-b
, http://www.100md.com
24h
67.0
16.0
b-a
d-c
受UU感染的精子在16 h时，活率(34.2%)明显低于对照组(73.0%)；24 h感染精子活率为16.0%(经伊红Y精子活体染色证实)，活力以d-c级明显低于对照组b-a级。
3 讨论
3.1 UU感染对精子功能的影响 在精子功能检测中，精子质膜功能试验引起了人们的广泛关注，质膜的功能与精子获能、顶体反应、精卵融合有关[3]。反映精子质膜生理功能完整性试验采用低渗肿胀试验较精液常规分析，更能准确地、有效地预测精子受精能力[4]。UU造成精子膜功能破损，是由于精子表面具有散在UU结合的位点，而UU通过这些位点与精子发生特异性的结合[5]。UU结合在精子表面后，在精子局部膜上立即摄取精子内的营养物进行代谢和蓄积毒性产物，其所产生的H2O2能够直接破坏精子膜[6]。此外，Desil VA等[7]人证实，UU膜上具有磷脂酶A和磷脂酶C，是UU产生病理作用的因素之一，原因是UU膜上磷脂酶A1、A2水解精子膜上的磷脂，产生溶血磷脂和游离脂肪酸，而磷脂酶C可水解膜上的磷脂，产生1、2-甘油二酯及磷酸酯，所有这些作用造成精子膜破坏，膜功能受损，从而影响精子的受精能力；同时由于UU吸附在精子表面，可造成精子运动阻力增大，精子尾部绒毛状附着物[8]，使部分精子由流线型变得“臃肿”，必然使其运动功能减弱。本研究也发现，感染8 h精子爬高试验与对照组比较明显低于对照组；UU感染24 h以后，精子爬高试验证明几乎处于原地摆动，而对照组仍有54 mm±1.9 mm(见表1)。g型精子百分率在UU感染16 h后开始与对照组有非常显著的差异，提示精子膜破损；而感染16 h的精子爬高(30.2 mm)与正常对照(63.5 mm)具有非常显著的差异。精子感染后16 h有活力的精子中原地摆动精子占75%，感染24 h，原地摆动精子占88%以上。
, 百拇医药
3.2 解脲脲原体感染对精子活率的影响 UU引起精子活率下降的原因之一，可能是UU产生的有害代谢产物(如NH3和H2O2)，干扰精子正常代谢，从而造成精子死亡率增高[8]，另外由于支原体无细胞壁，只有原生质膜与外界相隔，UU吸附在精子表面时，支原体质膜上的类脂能掺入精子膜结构内，导致精子与原生质融合，这必然使支原体胞浆内有毒性的蛋白质和类脂成分直接融入精子膜内，而引起精子破坏，活率降低。
综上所述，UU感染精子后，使精子功能受损，活率下降，是导致男性不育的重要因素。同时，本项研究也发现精子受UU感染后，在4 h内精子功能及活力，活率未见显著改变，这提示人类精子与卵子识别结合受精过程中，女性受UU感染，有可能在4 h内对精子功能及活率无明显影响。
参考文献
1 黄宇烽.男性病实验诊断手册.第二版.南京：东南大学出版社，1993.51
, http://www.100md.com
2 WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervial mucus interaction,3rd edition.London:Cambridge University.1992
3 袁玉英，石其贤.精子功能的评价.生殖与避孕，1998，18(1)：58
4 Fuse H,Kazama T,katayama T.Relationship between hypoo-
smotic swelling test,Semen analysis and zona-free hamster ovum test.Arch Androl，1991，27：737
5 查金智，钱宪明，王益鑫，等.男性生殖解脲脲原体感染对精液的影响.男性学杂志，1997，11(1)：15
, http://www.100md.com
6 商学军，黄宇烽，王鹤楼，等.解脲支原体感染与男性不育.解放军医学杂志，1995，20(2)：118
7 Desil VA,Patricia A Q.Localization of endogenous activity of
phospholipases A and C in ureaplasma urealyticum.J Clin
Microbiol，1991，29：1 498
8 徐晨，徐胜，王一飞，等.解脲支原体引起男性不育的机理研究.男性学杂志，1992，6(4)：197
(1998-11-10收稿), http://www.100md.com
单位：万长春，汪弘，朱成鸿，汤玉琴 江苏金湖县人民医院，江苏金湖(211600)，商学军，黄宇烽 南京军区南京总医院全军医学检验中心(210002)
关键词：解脲脲原体；精子功能；实验研究
临床检验杂志990431 摘要 研究解脲脲原体感染对精子功能的影响。正常精液一式二份，一份用解脲脲原体Ⅳ型人工感染正常精子，一份作对照，于感染后4 h,8 h,16 h,24 h的不同时间观察精子的低渗肿胀试验、精子爬高试验、精子活力及活率。结果，正常精子受解脲脲原体Ⅳ型感染8 h，爬高高度低于对照组(48.1 mm±4.2 mm对69.5 mm±1.6 mm，P<0.05)；感染16 h g形精子百分率、活力、活率明显下降；感染24 h精子总肿胀率明显低于对照组(12.75%±8.98%对75.50%±4.88%，P<0.01)。解脲脲原体Ⅳ型对精子低渗肿胀率和毛细管中爬高力有明显影响，是解脲脲原体引起男性不育的病因之一。
, 百拇医药
Laboratory study on the function of spermatozoa with infection of Ureaplasma urealyticum
WAN Changchun,WAN Hong,SHANG Xuejun*,et al.
(Jinhu Hospital Jinhu Jiangsu 211600)
Abstract Study on the function of spermatozoa which were infected with type Ⅳ of Ureaplasma urealyticum (Uu).Normal semen were divided into two groups,one for factitious infection of Uu,the other for control.The sperm activity and motile ratio,hypoosmotic swelling test(HOS)and sperm penetration in capillary in 4 h,8 h,16 h, and 24 h after infection with Uu.The height of sperm crawling was conspicuously lower in the group which had been infected by Uu for 8 h than in the control group(48.1 mm±4.2 mm in the infected group,69.5 mm±1.6 mm in the control,P<0.05).The ratio of“g”type of sperm，sperm activity and motility ratio descended obviously after Uu infection in 16 hr.The total ratio of HOS was significantly lower in the group of Uu infection in 24 h than that in the control group(12.75%±8.98% against 75.50%±4.88%，P<0.01).The infection of Ⅳ type of Uu affected HOS ratio and activity of sperm penetration in capillary conspicuously and served as one of the reasons which caused male sterility.
, 百拇医药
Key words Ureaplasma urealyticum； sperm function； Laboratory study
1973年，Gnarpe从一组不明原因患者的精液中分离出解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,UU)，提出了UU的生殖道感染与男性不育有关，迄今为止，各国有关学者对脲原体与不育进行了广泛的研究，但结果又不尽相同。本研究通过建立人工感染UU精子模型，直观探讨解脲脲原体感染对人精子功能的影响，阐明UU引起不育的可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验对象 正常生育男性自愿者，禁欲48 h～72 h，以无菌生理盐水清洗阴茎，手淫法留取精液于消毒无菌的容器中待用。
1.2 器械 Olympus BH-2型相差显微镜，B5060EK型CO2培养箱，Olympus-CK型倒置显微镜；0.9～1.1 mm×120 mm玻璃毛细管；精液池等。
, http://www.100md.com
1.3 UU血清型Ⅳ标准菌株及培养基 购自中国医学科学院皮肤病研究所。
1.4 UU体外培养 将UU标准菌株复苏后，在无菌条件下接种于UU培养基中，37°C孵育18 h～24 h后，观察结果，若培养基颜色由黄色刚转变为橙红色，再接种几次，直至接种后孵育16 h～18 h培养基出现橙红色变，此时UU处于对数生长期，繁殖速度最快，活力最强。
1.5 UU效价滴定 UU效价以颜色变化单位(CCU/ml)表示，将处于对数生长期的UU倍比稀释，接种于40孔培养板，37°C孵育48 h，观察结果，颜色变红的最高稀释孔的稀释度即为UU效价。本实验室所用UU效价为8.4×106 CCU/ml。
1.6 人工感染UU 取8名生育男性精液500 r/min离心15 min，弃去精浆，沉淀的精子用含10%人血清的Earle′s培养液洗涤后分装于5支5 ml Falcon管中，离心10 min，弃上清，用手指轻弹试管底数下，将沉淀打散，然后沿管壁缓慢加入含10%人血清的Earle′s液0.8 ml，37°C，5% CO2培养箱中上游40分钟，取上层液0.5 ml，经上泳法选取活率在90%以上的精子，并用Earle′s液调精子密度为10×106/ml，将处于对数生长期(in-log-phase)UU液体培养基5 ml，20 000 r/min离心(4°C)30 min，弃上清液，沉淀团用0.5 ml精子悬液悬浮，使最终浓度为20～40 CCU/精子，另分别取0.5 ml精子悬液作为对照，置37°C，5%CO2孵育。在4 h，8 h，16 h，24 h分别做精子低渗肿胀试验，精子爬高试验，活力及活率观察。
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1.7 精子低渗肿胀试验 按文献操作[1]于Olympus BH-2型相差显微镜下观察精子总肿胀率，g形精子百分离。
1.8 精子爬高试验 规格为内径0.9～1.1 mm，长120 mm的玻璃管中注入Earle′s培养液，顶端用胶泥封口，下端重直插入含有精子悬液的精液池，37°C水浴箱内1 h，倒置显微镜下观察毛细管中精子>5/Hp到达的最高高度。
1.9 精子活力、活率分析 见参考文献[2]
2 结果
2.1 UU感染前后精子总肿胀率，g形精子百分率，精子爬高试验比较分析见表1。
精子受UU感染4 h对精子功能无明显影响；8 h精子爬高试验，感染组低于对照组(48.1±4.2 mm对69.5±1.6 mm，P<0.05)；感染16 h精子总肿胀率，g形精子百分率明显低于对照组(P<0.01)；感染24 h g形精子百分率为0。
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表1 UU感染前后精子总肿胀率、g形精子百分率及精子爬高试验比较分析(
±s)Table 1 The total ratio of HOS,the ratio of“g”type of sperm,the height of sperm crawling between the sperm for control and the sperm infected by UU(
±s) TimeThe total ratio of HOS of sperm
The ration of“g”type of sperm
The height of sperm crawling(mm)
, 百拇医药
Control group
Infection group
Control group
Infection group
Control group
Infection group
4h
79.75±5.56
76.25±8.48
23.50±3.11
21.02±5.28
, 百拇医药
70.2±1.8
63.0±2.7
8h
77.75±6.03
68.25±8.59
22.40±4.23
18.75±6.22
69.5±1.6
48.1±4.2△
16h
, http://www.100md.com 76.50±4.79
42.50±6.89*
21.50±3.65
9.75±3.09*
63.5±1.7
30.2±3.4*
24h
75.50±4.88
12.75±8.99*
19.78±2.94
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0*
54.0±1.9
6.2±1.5*
△ The contrast of the control group and the group of UU infection P<0.05；* P<0.01
2.2 UU感染前后精子活率(中位数)及活力的比较见表2。表2 UU感染前后精子活率(中位数)及活力的比较
Table 2 The sperm motile ratio′s(the middle figure)and activity contrast of the sperm of control and the sperm infected by UU Time
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Motile ratio(%)
Activity(level)
Control
group
Infection
group
Control
group
Infection
group
4h
78.0
, 百拇医药
74.0
b-a
b-a
8h
76.0
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b-a
c-a
16h
73.0
34.2
b-a
c-b
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24h
67.0
16.0
b-a
d-c
受UU感染的精子在16 h时，活率(34.2%)明显低于对照组(73.0%)；24 h感染精子活率为16.0%(经伊红Y精子活体染色证实)，活力以d-c级明显低于对照组b-a级。
3 讨论
3.1 UU感染对精子功能的影响 在精子功能检测中，精子质膜功能试验引起了人们的广泛关注，质膜的功能与精子获能、顶体反应、精卵融合有关[3]。反映精子质膜生理功能完整性试验采用低渗肿胀试验较精液常规分析，更能准确地、有效地预测精子受精能力[4]。UU造成精子膜功能破损，是由于精子表面具有散在UU结合的位点，而UU通过这些位点与精子发生特异性的结合[5]。UU结合在精子表面后，在精子局部膜上立即摄取精子内的营养物进行代谢和蓄积毒性产物，其所产生的H2O2能够直接破坏精子膜[6]。此外，Desil VA等[7]人证实，UU膜上具有磷脂酶A和磷脂酶C，是UU产生病理作用的因素之一，原因是UU膜上磷脂酶A1、A2水解精子膜上的磷脂，产生溶血磷脂和游离脂肪酸，而磷脂酶C可水解膜上的磷脂，产生1、2-甘油二酯及磷酸酯，所有这些作用造成精子膜破坏，膜功能受损，从而影响精子的受精能力；同时由于UU吸附在精子表面，可造成精子运动阻力增大，精子尾部绒毛状附着物[8]，使部分精子由流线型变得“臃肿”，必然使其运动功能减弱。本研究也发现，感染8 h精子爬高试验与对照组比较明显低于对照组；UU感染24 h以后，精子爬高试验证明几乎处于原地摆动，而对照组仍有54 mm±1.9 mm(见表1)。g型精子百分率在UU感染16 h后开始与对照组有非常显著的差异，提示精子膜破损；而感染16 h的精子爬高(30.2 mm)与正常对照(63.5 mm)具有非常显著的差异。精子感染后16 h有活力的精子中原地摆动精子占75%，感染24 h，原地摆动精子占88%以上。
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3.2 解脲脲原体感染对精子活率的影响 UU引起精子活率下降的原因之一，可能是UU产生的有害代谢产物(如NH3和H2O2)，干扰精子正常代谢，从而造成精子死亡率增高[8]，另外由于支原体无细胞壁，只有原生质膜与外界相隔，UU吸附在精子表面时，支原体质膜上的类脂能掺入精子膜结构内，导致精子与原生质融合，这必然使支原体胞浆内有毒性的蛋白质和类脂成分直接融入精子膜内，而引起精子破坏，活率降低。
综上所述，UU感染精子后，使精子功能受损，活率下降，是导致男性不育的重要因素。同时，本项研究也发现精子受UU感染后，在4 h内精子功能及活力，活率未见显著改变，这提示人类精子与卵子识别结合受精过程中，女性受UU感染，有可能在4 h内对精子功能及活率无明显影响。
参考文献
1 黄宇烽.男性病实验诊断手册.第二版.南京：东南大学出版社，1993.51
, http://www.100md.com
2 WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervial mucus interaction,3rd edition.London:Cambridge University.1992
3 袁玉英，石其贤.精子功能的评价.生殖与避孕，1998，18(1)：58
4 Fuse H,Kazama T,katayama T.Relationship between hypoo-
smotic swelling test,Semen analysis and zona-free hamster ovum test.Arch Androl，1991，27：737
5 查金智，钱宪明，王益鑫，等.男性生殖解脲脲原体感染对精液的影响.男性学杂志，1997，11(1)：15
, http://www.100md.com
6 商学军，黄宇烽，王鹤楼，等.解脲支原体感染与男性不育.解放军医学杂志，1995，20(2)：118
7 Desil VA,Patricia A Q.Localization of endogenous activity of
phospholipases A and C in ureaplasma urealyticum.J Clin
Microbiol，1991，29：1 498
8 徐晨，徐胜，王一飞，等.解脲支原体引起男性不育的机理研究.男性学杂志，1992，6(4)：197
(1998-11-10收稿), http://www.100md.com