全自动加样扫描分析系统测定ABO血型
作者：夏卫 郭永芳 姚锦炎 祁国阳
单位：无锡市中心血站，无锡214021
关键词：BO血型；血型鉴定；自动化
临床检验杂志990427 ABO血型鉴定是常规检查项目之一。本文作者研究开发的全自动加样扫描分析系统测定ABO血型，实现了ABO血型鉴定的标准化和自动化。现将该法介绍如下。
1 材料与方法
1.1 材料 献血者血液标本(2.5 mg EDTA. Na2/ml全血)；Genesis RSP-100型全自动样本处理系统，SLT自动扫描酶标仪及支持软件Soft 2000均为瑞士TECAN公司产品；TS温控孵育振荡仪，奥地利Anthos公司产品；KUBOTA KS-5000平板式离心机，日本久保田公司生产；丹麦产96孔硬质U型板；单克隆抗A、抗B血型试剂，长春生物所生产；自制试剂红细胞。
, http://www.100md.com
1.2 方法 用96孔U型微量反应板，通过全自动加样器处理样品和试剂。正定型中，分别加入血型试剂30 μl和5%样品红细胞30 μl。反定型中，分别加入样品血浆50 μl和5%试剂红细胞30 μl。经孵育、离心、悬浮和静止，再使用自动酶标仪采用620 nm波长对反应板进行透光率扫描、判读，随后在电脑中进行正反定型结果自动复核。
依据Soft 2000支持软件结构，微凝板经扫描后每孔都可获得一最小透光率(Tn)和最大透光率(Tm)。非凝集孔Tm与Tn的差值(Tc)较小，凝集孔Tc值较大，当Tc值超过一特定值时，提示细胞凝集，反之，Tc值较小时表明细胞不凝集。
2 实验和结果
2.1 确定红细胞悬液的工作浓度 取10种不同浓度的红细胞悬液，每种浓度加6孔，然后加AB血浆使成非凝集试验；加O型血浆便成凝集试验。经孵育、离心、悬浮、扫描，得每种浓度的平均Tc值(见图1)。
, 百拇医药
图1 两试验中各种红细胞浓度与Tc值之间的关系
从图1中可见，两条曲线都从5%红细胞浓度以后开始走平，考虑到反定型中弱血型抗体的存在，故选择5%红细胞浓度为最适工作浓度。
2.2 最佳试验条件的确定
2.2.1 孵育条件 孵育条件由时间、振频、加速度三方面决定。将血型试剂稀释成凝集强度呈2+，然后通过三因素三水平的正交试验进行孵育，最终得出每个试验的Tc差值(见表1)。
表1 孵育条件优化正交试验结果 时间
(min)
振频
(r/min)
, http://www.100md.com 加速度
(Level)
透光率Tc值
抗A+A红细胞
抗B+B红细胞
3
400
1
55.43
71.66
3
500
2
, 百拇医药
60.77
74.05
3
600
3
54.51
63.61
4
400
2
56.04
66.01
4
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500
3
55.60
64.46
4
600
1
54.73
55.09
5
400
3
58.79
, 百拇医药
65.95
5
500
1
49.27
55.27
5
600
2
56.12
60.38
从表1中可见，最佳孵育条件为3 min，500 r/min，2 Level。
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2.2.2 离心转速 将96孔U型微量板分为二组(各48孔)，一组中加入B型血浆50 μl和5%A型红细胞悬液30 μl，另一组中加入单抗A血型试剂(经1∶64稀释)30 μl和5%A型红细胞悬液30 μl，经孵育、不同转速离心、悬浮、静置、扫描，分别测得两组的平均Tc差值(见表2)。表2 凝集试验中各种离心转速所对应的Tc值变化
不同离心转速(r/min)
800
1 000
1 200
1 500
1 800
2 000
B血浆+A红细胞
, http://www.100md.com
52.31
37.3
54.0
61.5
63.8
45.9
单抗A+A红细胞
5.33
9.13
5.39
22.8
8.90
16.7
, 百拇医药
从表2可见，最佳离心转速为400 g(1 500 r/min)。
2.2.3 悬浮条件 此条件在选择上首先将要考虑非凝集红细胞需充分悬浮，在此前提下，才能顾及弱凝集反应不至于振频过大时消失。对此，我们将用无凝集反应，经三因素三水平的正交试验对悬浮条件进行优化(见表3)。表3 悬浮条件优化正交试验结果 时间
(min)
振频
(r/min)
加速度
(Level)
透光率Tc值
肉眼观察孔底
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抗A
+A红细胞
抗B
+B红细胞
2
800
1
13.14
21.38
基本未悬浮
2
900
2
, 百拇医药
4.08
3.62
少量未悬浮
2
1000
3
3.68
3.64
完全悬浮
3
800
2
4.06
, 百拇医药
3.71
少量未悬浮
3
900
3
4.02
3.59
完全悬浮
3
1000
1
4.01
3.62
, 百拇医药
完全悬浮
4
800
3
3.56
3.58
少量未悬浮
4
900
1
3.75
3.31
完全悬浮
, 百拇医药
4
1000
2
3.46
3.43
完全悬浮
从表3可见，同时满足完全悬浮及透光率Tc值较低的有五种条件，我们选取振频最小的即3 min，900 r/min，3 Level为悬浮最佳条件。
2.2.4 静置时间 将一块微量板分为两组，一组加B型血浆50 μl和5%B型红细胞悬液30 μl，另一组加单抗A血型试剂30 μl和5%B型红细胞悬液30 μl，经孵育、离心、悬浮，在各种静置时间中扫描，分别得二组的平均Tc值(见表4)。表4 非凝集试验中各种静置时间所对应的Tc值变化
, 百拇医药
静置时间(min)
0
1.5
3
4.5
6
7.5
9
10.5
12
13.5
B血浆+B红细胞
5.15
, http://www.100md.com
4.63
4.74
4.48
4.53
4.48
4.72
4.88
5.20
5.58
单抗A+B红细胞
2.40
1.82
1.92
, http://www.100md.com
1.80
2.59
3.77
5.10
6.52
8.10
9.78
从表4可见，反定型时的最佳静置时间为6 min左右，而正定型中为1.5 min左右。
2.2.5 扫描点数 将96孔U型微量板分为两组(各48孔)，一组加入A型血浆50 μl和5%B型红细胞悬液30 μl，另一组加入单抗B血型试剂30 μl和5%B型红细胞悬液30 μl，经孵育、离心、悬浮，最后在各种扫描点数中判读(见表5)。表5 凝集试验中各种扫描点数对Tc值的影响情况
, 百拇医药
扫描点数
40
32
24
16
8
A血浆+B红细胞
60.70
60.73
53.61
21.74
2.72
单抗B+B红细胞
, 百拇医药
82.63
82.66
80.81
43.14
9.29
从表5可见，确定40点为最佳扫描点数。
2.2.6 Cut off值 该方法建立后，我们对2 857份献血员样品进行了正反定型，然后分别对阴、阳性Tc值的分布情况进行数理统计(见表6)。表6 11 428个阴、阳性Tc值的分布情况 阴性的分布情况
阳性的分布情况
Tc值范围(%)
n
, 百拇医药
Tc值范围(%)
n
0～5
5 606
0～5
—
5.1～9.9
108
5.1～9.9
3
10～15
—
10～15
, 百拇医药
5
15.1～25
—
15.1～25
24
25.1～35
—
25.1～35
49
35.1～45
—
35.1～45
193
, 百拇医药
45.1～
—
45.1～
5 440
从表6可见，将Cut off值确定为：阴性Tc值<10%，10%≤可疑区域Tc值≤15%，阳性Tc值>15%时，可疑区域和误判孔数为万分之七，即该Cut off值具有99.83%的可靠性。可疑区域和误判的标本需进一步试验。
2.3 方法的可靠性
2.3.1 重复性 取8份样品，连续进行20次反定型，对其Tc值进行统计，得阳性和阴性变异系数CV为2.90%、8.03%，均<10%。
2.3.2 稳定性 取48份样品，每隔11天测1次，连续测3次，所得Tc值经统计，得t值为0.387，n＝62，t(0.05)＝2.000，P>0.05，无显著性差别。
, 百拇医药
2.3.3 准确率 通过2 857份献血员样品的正反定型，得出正反定型试验1次判读正确率为99.83%。异常主要出现在反定型中，其中3份为严重脂血，2份为血型抗体极弱。
3 讨论
3.1 单克隆抗A血型试剂呈兰色，对620 nm波长的光谱有一定干扰，但影响程度不大，只要保证单克隆抗体的效价在1∶128以上即可。
3.2 脂血、溶血，以及弱的血型抗体会影响该方法反定型结果的判读，故在工作中要尽量避免脂血和溶血样品的发生。另外，还要保证5%的试剂红细胞悬液的新鲜(7天内使用)。
3.3 如果碰到ABO正反定型不符时，应该由经典方法确认，以考虑是否有亚型、弱抗体和假凝集等存在。
参考文献
1 杨春森，等.ABO反向定型微凝自动扫描法的研究.中国输血杂志，1997，10(1)：11
(1999-01-15收稿，1999-05-10修回), 百拇医药
单位：无锡市中心血站，无锡214021
关键词：BO血型；血型鉴定；自动化
临床检验杂志990427 ABO血型鉴定是常规检查项目之一。本文作者研究开发的全自动加样扫描分析系统测定ABO血型，实现了ABO血型鉴定的标准化和自动化。现将该法介绍如下。
1 材料与方法
1.1 材料 献血者血液标本(2.5 mg EDTA. Na2/ml全血)；Genesis RSP-100型全自动样本处理系统，SLT自动扫描酶标仪及支持软件Soft 2000均为瑞士TECAN公司产品；TS温控孵育振荡仪，奥地利Anthos公司产品；KUBOTA KS-5000平板式离心机，日本久保田公司生产；丹麦产96孔硬质U型板；单克隆抗A、抗B血型试剂，长春生物所生产；自制试剂红细胞。
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1.2 方法 用96孔U型微量反应板，通过全自动加样器处理样品和试剂。正定型中，分别加入血型试剂30 μl和5%样品红细胞30 μl。反定型中，分别加入样品血浆50 μl和5%试剂红细胞30 μl。经孵育、离心、悬浮和静止，再使用自动酶标仪采用620 nm波长对反应板进行透光率扫描、判读，随后在电脑中进行正反定型结果自动复核。
依据Soft 2000支持软件结构，微凝板经扫描后每孔都可获得一最小透光率(Tn)和最大透光率(Tm)。非凝集孔Tm与Tn的差值(Tc)较小，凝集孔Tc值较大，当Tc值超过一特定值时，提示细胞凝集，反之，Tc值较小时表明细胞不凝集。
2 实验和结果
2.1 确定红细胞悬液的工作浓度 取10种不同浓度的红细胞悬液，每种浓度加6孔，然后加AB血浆使成非凝集试验；加O型血浆便成凝集试验。经孵育、离心、悬浮、扫描，得每种浓度的平均Tc值(见图1)。
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图1 两试验中各种红细胞浓度与Tc值之间的关系
从图1中可见，两条曲线都从5%红细胞浓度以后开始走平，考虑到反定型中弱血型抗体的存在，故选择5%红细胞浓度为最适工作浓度。
2.2 最佳试验条件的确定
2.2.1 孵育条件 孵育条件由时间、振频、加速度三方面决定。将血型试剂稀释成凝集强度呈2+，然后通过三因素三水平的正交试验进行孵育，最终得出每个试验的Tc差值(见表1)。
表1 孵育条件优化正交试验结果 时间
(min)
振频
(r/min)
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(Level)
透光率Tc值
抗A+A红细胞
抗B+B红细胞
3
400
1
55.43
71.66
3
500
2
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60.77
74.05
3
600
3
54.51
63.61
4
400
2
56.04
66.01
4
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500
3
55.60
64.46
4
600
1
54.73
55.09
5
400
3
58.79
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65.95
5
500
1
49.27
55.27
5
600
2
56.12
60.38
从表1中可见，最佳孵育条件为3 min，500 r/min，2 Level。
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2.2.2 离心转速 将96孔U型微量板分为二组(各48孔)，一组中加入B型血浆50 μl和5%A型红细胞悬液30 μl，另一组中加入单抗A血型试剂(经1∶64稀释)30 μl和5%A型红细胞悬液30 μl，经孵育、不同转速离心、悬浮、静置、扫描，分别测得两组的平均Tc差值(见表2)。表2 凝集试验中各种离心转速所对应的Tc值变化
不同离心转速(r/min)
800
1 000
1 200
1 500
1 800
2 000
B血浆+A红细胞
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52.31
37.3
54.0
61.5
63.8
45.9
单抗A+A红细胞
5.33
9.13
5.39
22.8
8.90
16.7
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从表2可见，最佳离心转速为400 g(1 500 r/min)。
2.2.3 悬浮条件 此条件在选择上首先将要考虑非凝集红细胞需充分悬浮，在此前提下，才能顾及弱凝集反应不至于振频过大时消失。对此，我们将用无凝集反应，经三因素三水平的正交试验对悬浮条件进行优化(见表3)。表3 悬浮条件优化正交试验结果 时间
(min)
振频
(r/min)
加速度
(Level)
透光率Tc值
肉眼观察孔底
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抗A
+A红细胞
抗B
+B红细胞
2
800
1
13.14
21.38
基本未悬浮
2
900
2
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4.08
3.62
少量未悬浮
2
1000
3
3.68
3.64
完全悬浮
3
800
2
4.06
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3.71
少量未悬浮
3
900
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4.02
3.59
完全悬浮
3
1000
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4.01
3.62
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完全悬浮
4
800
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3.56
3.58
少量未悬浮
4
900
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3.75
3.31
完全悬浮
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4
1000
2
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3.43
完全悬浮
从表3可见，同时满足完全悬浮及透光率Tc值较低的有五种条件，我们选取振频最小的即3 min，900 r/min，3 Level为悬浮最佳条件。
2.2.4 静置时间 将一块微量板分为两组，一组加B型血浆50 μl和5%B型红细胞悬液30 μl，另一组加单抗A血型试剂30 μl和5%B型红细胞悬液30 μl，经孵育、离心、悬浮，在各种静置时间中扫描，分别得二组的平均Tc值(见表4)。表4 非凝集试验中各种静置时间所对应的Tc值变化
, 百拇医药
静置时间(min)
0
1.5
3
4.5
6
7.5
9
10.5
12
13.5
B血浆+B红细胞
5.15
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4.63
4.74
4.48
4.53
4.48
4.72
4.88
5.20
5.58
单抗A+B红细胞
2.40
1.82
1.92
, http://www.100md.com
1.80
2.59
3.77
5.10
6.52
8.10
9.78
从表4可见，反定型时的最佳静置时间为6 min左右，而正定型中为1.5 min左右。
2.2.5 扫描点数 将96孔U型微量板分为两组(各48孔)，一组加入A型血浆50 μl和5%B型红细胞悬液30 μl，另一组加入单抗B血型试剂30 μl和5%B型红细胞悬液30 μl，经孵育、离心、悬浮，最后在各种扫描点数中判读(见表5)。表5 凝集试验中各种扫描点数对Tc值的影响情况
, 百拇医药
扫描点数
40
32
24
16
8
A血浆+B红细胞
60.70
60.73
53.61
21.74
2.72
单抗B+B红细胞
, 百拇医药
82.63
82.66
80.81
43.14
9.29
从表5可见，确定40点为最佳扫描点数。
2.2.6 Cut off值 该方法建立后，我们对2 857份献血员样品进行了正反定型，然后分别对阴、阳性Tc值的分布情况进行数理统计(见表6)。表6 11 428个阴、阳性Tc值的分布情况 阴性的分布情况
阳性的分布情况
Tc值范围(%)
n
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Tc值范围(%)
n
0～5
5 606
0～5
—
5.1～9.9
108
5.1～9.9
3
10～15
—
10～15
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5
15.1～25
—
15.1～25
24
25.1～35
—
25.1～35
49
35.1～45
—
35.1～45
193
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45.1～
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45.1～
5 440
从表6可见，将Cut off值确定为：阴性Tc值<10%，10%≤可疑区域Tc值≤15%，阳性Tc值>15%时，可疑区域和误判孔数为万分之七，即该Cut off值具有99.83%的可靠性。可疑区域和误判的标本需进一步试验。
2.3 方法的可靠性
2.3.1 重复性 取8份样品，连续进行20次反定型，对其Tc值进行统计，得阳性和阴性变异系数CV为2.90%、8.03%，均<10%。
2.3.2 稳定性 取48份样品，每隔11天测1次，连续测3次，所得Tc值经统计，得t值为0.387，n＝62，t(0.05)＝2.000，P>0.05，无显著性差别。
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2.3.3 准确率 通过2 857份献血员样品的正反定型，得出正反定型试验1次判读正确率为99.83%。异常主要出现在反定型中，其中3份为严重脂血，2份为血型抗体极弱。
3 讨论
3.1 单克隆抗A血型试剂呈兰色，对620 nm波长的光谱有一定干扰，但影响程度不大，只要保证单克隆抗体的效价在1∶128以上即可。
3.2 脂血、溶血，以及弱的血型抗体会影响该方法反定型结果的判读，故在工作中要尽量避免脂血和溶血样品的发生。另外，还要保证5%的试剂红细胞悬液的新鲜(7天内使用)。
3.3 如果碰到ABO正反定型不符时，应该由经典方法确认，以考虑是否有亚型、弱抗体和假凝集等存在。
参考文献
1 杨春森，等.ABO反向定型微凝自动扫描法的研究.中国输血杂志，1997，10(1)：11
(1999-01-15收稿，1999-05-10修回), 百拇医药