血小板同种抗原P1A基因型检测及其与突发性耳聋的关系探讨
作者：黄铭亚 李振荣 朱叶 张捷
单位：北京医科大学第三附属医院，北京100083
关键词：聚合酶链反应；限制性内切酶；P1A抗原；突发性耳聋
临床检验杂志990425 摘要 建立一种简便，易行，适于一般分子生物学实验室操作的检测血小板同种抗原P1A基因型的方法并对P1A2基因型与突发性耳聋之间的相关性进行初步研究。设计一对引物，用PCR方法特异扩增血小板GPⅢa基因上包含造成P1A基因多态性的碱基在内的247 bp片段，PCR产物用MSPⅠ酶切。电泳后观察酶切位点的限制性片段长度多态性。用PCR-RFLP的方法检测了40例对照和40例突发性耳聋患者，结果均为P1A1/A1基因型。本方法特异，简便，尤其适于因血小板量少而无法用免疫ELISA方法检测的病例。检测结果未发现P1A2与突发性耳聋存在相关性。
, 百拇医药
Genotyping of platelet alloantigen P1A and study of relation between the P1A polymorphism and sudden deafness disease
HUANG Mingya,LI Zhenrong,ZHU Ye,ZHANG Jie
(The Third Clinical Hospital of Beijing Medical University,Beijing 100083)
Abstract To establish a simple,easily-performed method to test platelet alloantigens and to examine the relation between the P1A polymorphism and sudden deafness disease.A pair of primers were designed and sgnthesized to amplify the fragment of 247 bp.The fragment is located on the third exon of the gene encoding for glycoprotein Ⅲa and includes the base which forms P1A gene polymorphism.Production of PCR was digested by enzyme MSPⅠ and then was subjected to electrophoresis.Restrict enzyme fragment length polymorphism determine the genotype.Blood of 40 case patients with sudden deafness and 40 controls.were examined by PCR-RFLP.All samples are P1A1/A1 genotype.The method is specific,simple,practical especially for cases of which platelet count is low and can't be tested by ELASA method.The prevalence of P1A2 was the same among the sudden deafness patients and controls.
, 百拇医药
Key words polymerase chain reaction； restriction enzyme； P1A antigen； sudden deafness
血小板抗原系统有多种，如P1A、KO、BaK、Yuk、Br等。其中P1A系统是最常见的引起新生儿免疫性血小板减少症(NAITP)和血小板减少性紫癜(PIP)的抗原系统[1，2]。本文应用PCR-RFLP的方法检测了人群中P1A基因型的分布情况。最新研究发现P1A的等位基因之一的P1A2基因还与血栓形成有关[3]。血循环障碍和血管栓塞性病被公认为是突发性耳聋常见的病因，本文初步探讨了此基因型与突发性耳聋之间的关系，以求为疾病的病因学提供新的实验方法和理论根据。现将结果报告如下：
1 实验对象和材料
, 百拇医药
1.1 实验对象 本实验检查正常查体者40人，作为对照组。其中男25人，女15人，年龄最大67岁，最小16岁，平均44.5岁。突发性耳聋患者40例，其中男22人，女18人。年龄最大72岁，最小18岁，平均45.6岁。均取EDTA抗凝的静脉血。做为阳性对照的P1A1/A2和P1A2/A2型基因组DNA，由Bray实验室(Johns-Hopkins Medical School)提供。
1.2 引物 参照文献[4]设计，由赛百盛公司合成。上游引物：5CTG CAG GAG GTA GAG AGTCGC CAT AG3；下游引物：5GTG CAA TCC TCT GGG GAC TGA CTT G3。扩增产物长度247 bp。P1A2基因扩增产物能被限制性内切酶MSPⅠ切割成76 bp，171 bp两个片段。P1A1基因不存在此酶切位点[5]。
, 百拇医药
1.3 试剂 Tag DNA聚合酶(Biomic公司)，蛋白酶K(Merck公司)限制性内切酶(华美公司，中国)，dNTP(Promega公司)，PCR markers(Promega公司)，Tris,明胶，琼脂糖等常规化学试剂(北京化工)。
1.4 仪器 低温高速离心机(Beckman公司)，PCR合成仪(Perkin-Elmer公司)，电泳仪(中国)，紫外透射仪(中国)。
2 实验方法
2.1 基因组DNA制备 0.5 ml全血加入等体积PLB液。(0.32 mol/L蔗糖，10 mmol/L Tris pH 7.5，1% Triton X-100，5 mmol/L MgCl2)13 000 g离心20秒。取沉淀，重悬于1 ml PLB液，离心同上。重复此操作两次。将沉淀重悬于0.5 ml SIB液(50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris pH 8.3，2.5 mmol/L MgCl2，0.1 mg/ml明胶，0.45% NP-40，0.45% Tween 20)，加入4 mg/ml蛋白酶K，65°C孵育1 h。煮沸20 min灭活蛋白酶K，-20°C保存。
, 百拇医药
2.2 PCR反应 25 μl反应体系中加入Tag DNA聚合酶1.5 U，引物5 pmol，dNTP 200 nmol/μl，buffer适量(100 mmol/L Tris-HCl pH 8.3，500 mmol/L KCl，19 mmol/L MgCl2，0.01 g/dl gelatin)，模板约300 ng。经过预变性94°C，5 min；热变性94°C 45 s，退火62°C 60 s，引物延伸72°C 60 s，共30个循环；最后延伸72°C 10 min。取8 μl PCR产物在1.5 g/dl琼脂糖凝胶上，90 V电泳15 min，紫外灯下观察结果。
2.3 酶切反应 为得到便于观察的酶切结果，我们先将PCR产物进行了浓缩。PCR产物加2.5倍体积冷无水乙醇和1/10体积醋酸钠，-20°C过夜。12 000 r/min离心30 min沉淀DNA，用70%冷乙醇洗涤两遍，风干。最后加入无菌去离子水10 μl重新溶解DNA。酶切时，于25 μl反应体系加入中buffer 2.5 μl，浓缩后的PCR产物10 μl，MSPⅠ内切酶1 μl(8 U/μl)，37°C水浴3 h。反应结束后，取10 μl酶切后产物在2 g/dl琼脂糖凝胶上电泳后，紫外灯下观察结果。
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3 结果
3.1 标本PCR产物 我们通过对实验条件的反复摸索，找到了比较适宜的条件。尤其是通过对PCR产物的再次PCR，得到了较强的扩增产物。电泳后，在紫外灯下可见清晰的条带，同DNA markers对比，大小与设计相符。见图1。
Figure 1 Electrophoresis results of PCR products
图1 首次PCR产物的电泳结果
3.2 标本及阳性对照的PCR-RFLP分析
酶切原理示意图：
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阳性对照及标本酶切结果见图2，图中可见P1A1/A2杂合子对照呈现76，171，247 bp三条带；P1A1/A2纯合子对照呈现76，171 bp两条带；而标本则均可见一条带，分子量大小与PCR产物一致，仍为247 bp。表明40例正常人对照组和30例突发性耳聋患者均为P1A1/A1基因型。
1.Marker 2.Control:P1A1/A2genotype
3.control:P1A2/A2 genotype 4.sample
Fiugre 2 Results of controls and sample by PCR-RELP
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图2 阳性对照及标本酶切结果
4 讨论
血小板糖蛋白Ⅲa(glycoprotein Ⅲa)(GPⅢa)是血小板表面含量丰富的糖蛋白，与血小板糖蛋白Ⅱb(glycoprotein Ⅱb)(GPⅡb)以复合物形式存在，介导血小板聚集，在止血和血栓形成过程中发挥重要作用。P1A抗原系统是GPⅢa携带的同种抗原中比较重要的一个，由一对等位基因控制[6～7]。每个等位基因都能控制合成一种抗原，其表达互不影响，为双等位基因共显性模式。包含三种基因型P1A1/A1，P1A1/A2，P1A2/A2。绝大多数人都有P1A1抗原，少数人表现为P1A2/A2纯合型。后者因体内带有抗P1A1的抗体，而容易因输血或怀孕患输血后紫癜或引起新生儿免疫性血小板减少症等免疫介导的血小板缺陷类疾病。
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从已知的P1A抗原的cDNA序列中可以看出在第196位碱基处，P1A1基因是胸腺嘧啶(T)，而P1A2在此位置上是胞嘧啶(C)。正是此碱基的替换，在P1A2上造成了限制性内切酶MSPⅠ的酶切位点，而P1A1无此酶切位点。这就是我们选择PCR-RFLP方法的分子生物学基础[8]。白细胞的GPⅢa和血小板的GPⅢa被证实是相同基因的产物[9]。因而本方法取材于血液中的白细胞，克服了血清学方法因血小板量少而无法检测的弱点。我们应用的基因组DNA提取方法[10]，不需进行进一步的抽提纯化。但一般情况下，对基因组中的单拷贝基因进行PCR，效果不是很理想，我们经过对PCR反应条件的摸索和对PCR产物的再次PCR得到了较强的PCR产物。在实验过程中，我们设立了阳性对照，从而有效控制实验的可靠性。而且血清学方法由于P1A2抗血清稀有，因而成本昂贵，难以广泛应用。探针杂交的方法可以特异检测PCR产物单个核苷酸的不同，但对杂交和洗膜的条件要求都很严格，较难操作。本方法简便，成本低，条件易控制，无放射性，易于推广。
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本文40例对照及40例突发性耳聋患者均为P1A1/A1基因型，P1A2基因的检出率为0%，未发现P1A2基因与突聋有关，此结果同时表明此基因在我国人群中的频率是很低的。据有关资料[11]，在白人中，P1A1与P1A2的阳性率之比为97.86%∶28.64%。韩国人中为100%∶1%。即100名韩国人仅一人为P1A1/A2杂合子，无P1A2/A2纯合子。关于此基因在我国的分布尚未见报道。本实验结果支持此基因分布存在东西方差异的假说。但是要了解P1A基因在我国人群中的确切频率还需要进行大样本的流行病学调查。
参考文献
1 Shulman N R,Aster R H,Pearson H A,et al.Immunoreactions involving platelets.V1.Reactions of maternal isoantibodies responsible for neonatal purpura.Differentiation of a second platelet antigen system.J Clin Invest,1962，41：1 059
, http://www.100md.com
2 Zeigler Z,Murphy J,Gardner F Ⅱ.Post-transfusion purpura:a heterogeneous syndrome.Blood,1975,45:529～536
3 Weiss E J,Bray P F,Tayback M,et al.A polymorphism of a platelet glycoprotein receptor as an inherited risk factor for coronary thrombosis.N Eng J Med,1996,334:1 090～1 094
4 McFarland J G,Aster R H,Bussel J B,et al.Prenatal Diagnosis of neonatal alloimmune thrombocytopenia using allele-specific oligonucleotide probes.Blood,1991,78:2 276～2 282
, 百拇医药
5 Simsek S,Faber N M,Bleeker P M,et al.Determination of human platelet antigen frequencies in the Dutch population by immunophenotyping and DNA(allele-specific restriction enzyme)analysis.Blood,1993,81:835～840
6 Shulman N R,Aster R H,Leitner A,et al.Immunoreactions involving platelets V.post-transfusion purpura due to a complement-fixing antibody posed mechanism for thrombocytopenia and its relevance in autoimmunity,J Clin Invest,1961,40:1 597～1 620
, http://www.100md.com
7 Kunicki T J and Aster R H.Isolation and immunologic characte-rization of the human platelet alloantigen,P1A1. Mol Immun,1978,16:353～360
8 Newman P J,Derbes R S and Aster R H.The human platelet alloantigens,P1A1 and P1A2,are associated with a Lcucine33/Proline33 amino acid.Polymorphism in membrane glycoprotein Ⅲa,and are distinguishable by DNA typing.J Clin Invest,1989，83：1 778～1 781
, 百拇医药
9 Zimrin A B,Eisman R,Vilaire G,et al.Structure of platelet glycoprotein Ⅲa.A common subunit for two different membrane receptors.J Clin Invest 1988,81:1 470～1 475
10 Bray P F,Jin Y,Kickler T.Rapid genotyping of the five major platelet alloantigens by reverse dot-blot hybridization.Blood,1994,84:4 361～4 367
11 Kim H O,Jin Y,Kickler T S,et al.Gene frequencies of the five major human platelet antigens in African American,white and Korean populations.Transfusion,1995,35:863～867
(1998-12-22收稿,1999-06-08修回), http://www.100md.com
单位：北京医科大学第三附属医院，北京100083
关键词：聚合酶链反应；限制性内切酶；P1A抗原；突发性耳聋
临床检验杂志990425 摘要 建立一种简便，易行，适于一般分子生物学实验室操作的检测血小板同种抗原P1A基因型的方法并对P1A2基因型与突发性耳聋之间的相关性进行初步研究。设计一对引物，用PCR方法特异扩增血小板GPⅢa基因上包含造成P1A基因多态性的碱基在内的247 bp片段，PCR产物用MSPⅠ酶切。电泳后观察酶切位点的限制性片段长度多态性。用PCR-RFLP的方法检测了40例对照和40例突发性耳聋患者，结果均为P1A1/A1基因型。本方法特异，简便，尤其适于因血小板量少而无法用免疫ELISA方法检测的病例。检测结果未发现P1A2与突发性耳聋存在相关性。
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Genotyping of platelet alloantigen P1A and study of relation between the P1A polymorphism and sudden deafness disease
HUANG Mingya,LI Zhenrong,ZHU Ye,ZHANG Jie
(The Third Clinical Hospital of Beijing Medical University,Beijing 100083)
Abstract To establish a simple,easily-performed method to test platelet alloantigens and to examine the relation between the P1A polymorphism and sudden deafness disease.A pair of primers were designed and sgnthesized to amplify the fragment of 247 bp.The fragment is located on the third exon of the gene encoding for glycoprotein Ⅲa and includes the base which forms P1A gene polymorphism.Production of PCR was digested by enzyme MSPⅠ and then was subjected to electrophoresis.Restrict enzyme fragment length polymorphism determine the genotype.Blood of 40 case patients with sudden deafness and 40 controls.were examined by PCR-RFLP.All samples are P1A1/A1 genotype.The method is specific,simple,practical especially for cases of which platelet count is low and can't be tested by ELASA method.The prevalence of P1A2 was the same among the sudden deafness patients and controls.
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Key words polymerase chain reaction； restriction enzyme； P1A antigen； sudden deafness
血小板抗原系统有多种，如P1A、KO、BaK、Yuk、Br等。其中P1A系统是最常见的引起新生儿免疫性血小板减少症(NAITP)和血小板减少性紫癜(PIP)的抗原系统[1，2]。本文应用PCR-RFLP的方法检测了人群中P1A基因型的分布情况。最新研究发现P1A的等位基因之一的P1A2基因还与血栓形成有关[3]。血循环障碍和血管栓塞性病被公认为是突发性耳聋常见的病因，本文初步探讨了此基因型与突发性耳聋之间的关系，以求为疾病的病因学提供新的实验方法和理论根据。现将结果报告如下：
1 实验对象和材料
, 百拇医药
1.1 实验对象 本实验检查正常查体者40人，作为对照组。其中男25人，女15人，年龄最大67岁，最小16岁，平均44.5岁。突发性耳聋患者40例，其中男22人，女18人。年龄最大72岁，最小18岁，平均45.6岁。均取EDTA抗凝的静脉血。做为阳性对照的P1A1/A2和P1A2/A2型基因组DNA，由Bray实验室(Johns-Hopkins Medical School)提供。
1.2 引物 参照文献[4]设计，由赛百盛公司合成。上游引物：5CTG CAG GAG GTA GAG AGTCGC CAT AG3；下游引物：5GTG CAA TCC TCT GGG GAC TGA CTT G3。扩增产物长度247 bp。P1A2基因扩增产物能被限制性内切酶MSPⅠ切割成76 bp，171 bp两个片段。P1A1基因不存在此酶切位点[5]。
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1.3 试剂 Tag DNA聚合酶(Biomic公司)，蛋白酶K(Merck公司)限制性内切酶(华美公司，中国)，dNTP(Promega公司)，PCR markers(Promega公司)，Tris,明胶，琼脂糖等常规化学试剂(北京化工)。
1.4 仪器 低温高速离心机(Beckman公司)，PCR合成仪(Perkin-Elmer公司)，电泳仪(中国)，紫外透射仪(中国)。
2 实验方法
2.1 基因组DNA制备 0.5 ml全血加入等体积PLB液。(0.32 mol/L蔗糖，10 mmol/L Tris pH 7.5，1% Triton X-100，5 mmol/L MgCl2)13 000 g离心20秒。取沉淀，重悬于1 ml PLB液，离心同上。重复此操作两次。将沉淀重悬于0.5 ml SIB液(50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris pH 8.3，2.5 mmol/L MgCl2，0.1 mg/ml明胶，0.45% NP-40，0.45% Tween 20)，加入4 mg/ml蛋白酶K，65°C孵育1 h。煮沸20 min灭活蛋白酶K，-20°C保存。
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2.2 PCR反应 25 μl反应体系中加入Tag DNA聚合酶1.5 U，引物5 pmol，dNTP 200 nmol/μl，buffer适量(100 mmol/L Tris-HCl pH 8.3，500 mmol/L KCl，19 mmol/L MgCl2，0.01 g/dl gelatin)，模板约300 ng。经过预变性94°C，5 min；热变性94°C 45 s，退火62°C 60 s，引物延伸72°C 60 s，共30个循环；最后延伸72°C 10 min。取8 μl PCR产物在1.5 g/dl琼脂糖凝胶上，90 V电泳15 min，紫外灯下观察结果。
2.3 酶切反应 为得到便于观察的酶切结果，我们先将PCR产物进行了浓缩。PCR产物加2.5倍体积冷无水乙醇和1/10体积醋酸钠，-20°C过夜。12 000 r/min离心30 min沉淀DNA，用70%冷乙醇洗涤两遍，风干。最后加入无菌去离子水10 μl重新溶解DNA。酶切时，于25 μl反应体系加入中buffer 2.5 μl，浓缩后的PCR产物10 μl，MSPⅠ内切酶1 μl(8 U/μl)，37°C水浴3 h。反应结束后，取10 μl酶切后产物在2 g/dl琼脂糖凝胶上电泳后，紫外灯下观察结果。
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3 结果
3.1 标本PCR产物 我们通过对实验条件的反复摸索，找到了比较适宜的条件。尤其是通过对PCR产物的再次PCR，得到了较强的扩增产物。电泳后，在紫外灯下可见清晰的条带，同DNA markers对比，大小与设计相符。见图1。
Figure 1 Electrophoresis results of PCR products
图1 首次PCR产物的电泳结果
3.2 标本及阳性对照的PCR-RFLP分析
酶切原理示意图：
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阳性对照及标本酶切结果见图2，图中可见P1A1/A2杂合子对照呈现76，171，247 bp三条带；P1A1/A2纯合子对照呈现76，171 bp两条带；而标本则均可见一条带，分子量大小与PCR产物一致，仍为247 bp。表明40例正常人对照组和30例突发性耳聋患者均为P1A1/A1基因型。
1.Marker 2.Control:P1A1/A2genotype
3.control:P1A2/A2 genotype 4.sample
Fiugre 2 Results of controls and sample by PCR-RELP
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图2 阳性对照及标本酶切结果
4 讨论
血小板糖蛋白Ⅲa(glycoprotein Ⅲa)(GPⅢa)是血小板表面含量丰富的糖蛋白，与血小板糖蛋白Ⅱb(glycoprotein Ⅱb)(GPⅡb)以复合物形式存在，介导血小板聚集，在止血和血栓形成过程中发挥重要作用。P1A抗原系统是GPⅢa携带的同种抗原中比较重要的一个，由一对等位基因控制[6～7]。每个等位基因都能控制合成一种抗原，其表达互不影响，为双等位基因共显性模式。包含三种基因型P1A1/A1，P1A1/A2，P1A2/A2。绝大多数人都有P1A1抗原，少数人表现为P1A2/A2纯合型。后者因体内带有抗P1A1的抗体，而容易因输血或怀孕患输血后紫癜或引起新生儿免疫性血小板减少症等免疫介导的血小板缺陷类疾病。
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从已知的P1A抗原的cDNA序列中可以看出在第196位碱基处，P1A1基因是胸腺嘧啶(T)，而P1A2在此位置上是胞嘧啶(C)。正是此碱基的替换，在P1A2上造成了限制性内切酶MSPⅠ的酶切位点，而P1A1无此酶切位点。这就是我们选择PCR-RFLP方法的分子生物学基础[8]。白细胞的GPⅢa和血小板的GPⅢa被证实是相同基因的产物[9]。因而本方法取材于血液中的白细胞，克服了血清学方法因血小板量少而无法检测的弱点。我们应用的基因组DNA提取方法[10]，不需进行进一步的抽提纯化。但一般情况下，对基因组中的单拷贝基因进行PCR，效果不是很理想，我们经过对PCR反应条件的摸索和对PCR产物的再次PCR得到了较强的PCR产物。在实验过程中，我们设立了阳性对照，从而有效控制实验的可靠性。而且血清学方法由于P1A2抗血清稀有，因而成本昂贵，难以广泛应用。探针杂交的方法可以特异检测PCR产物单个核苷酸的不同，但对杂交和洗膜的条件要求都很严格，较难操作。本方法简便，成本低，条件易控制，无放射性，易于推广。
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本文40例对照及40例突发性耳聋患者均为P1A1/A1基因型，P1A2基因的检出率为0%，未发现P1A2基因与突聋有关，此结果同时表明此基因在我国人群中的频率是很低的。据有关资料[11]，在白人中，P1A1与P1A2的阳性率之比为97.86%∶28.64%。韩国人中为100%∶1%。即100名韩国人仅一人为P1A1/A2杂合子，无P1A2/A2纯合子。关于此基因在我国的分布尚未见报道。本实验结果支持此基因分布存在东西方差异的假说。但是要了解P1A基因在我国人群中的确切频率还需要进行大样本的流行病学调查。
参考文献
1 Shulman N R,Aster R H,Pearson H A,et al.Immunoreactions involving platelets.V1.Reactions of maternal isoantibodies responsible for neonatal purpura.Differentiation of a second platelet antigen system.J Clin Invest,1962，41：1 059
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2 Zeigler Z,Murphy J,Gardner F Ⅱ.Post-transfusion purpura:a heterogeneous syndrome.Blood,1975,45:529～536
3 Weiss E J,Bray P F,Tayback M,et al.A polymorphism of a platelet glycoprotein receptor as an inherited risk factor for coronary thrombosis.N Eng J Med,1996,334:1 090～1 094
4 McFarland J G,Aster R H,Bussel J B,et al.Prenatal Diagnosis of neonatal alloimmune thrombocytopenia using allele-specific oligonucleotide probes.Blood,1991,78:2 276～2 282
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5 Simsek S,Faber N M,Bleeker P M,et al.Determination of human platelet antigen frequencies in the Dutch population by immunophenotyping and DNA(allele-specific restriction enzyme)analysis.Blood,1993,81:835～840
6 Shulman N R,Aster R H,Leitner A,et al.Immunoreactions involving platelets V.post-transfusion purpura due to a complement-fixing antibody posed mechanism for thrombocytopenia and its relevance in autoimmunity,J Clin Invest,1961,40:1 597～1 620
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7 Kunicki T J and Aster R H.Isolation and immunologic characte-rization of the human platelet alloantigen,P1A1. Mol Immun,1978,16:353～360
8 Newman P J,Derbes R S and Aster R H.The human platelet alloantigens,P1A1 and P1A2,are associated with a Lcucine33/Proline33 amino acid.Polymorphism in membrane glycoprotein Ⅲa,and are distinguishable by DNA typing.J Clin Invest,1989，83：1 778～1 781
, 百拇医药
9 Zimrin A B,Eisman R,Vilaire G,et al.Structure of platelet glycoprotein Ⅲa.A common subunit for two different membrane receptors.J Clin Invest 1988,81:1 470～1 475
10 Bray P F,Jin Y,Kickler T.Rapid genotyping of the five major platelet alloantigens by reverse dot-blot hybridization.Blood,1994,84:4 361～4 367
11 Kim H O,Jin Y,Kickler T S,et al.Gene frequencies of the five major human platelet antigens in African American,white and Korean populations.Transfusion,1995,35:863～867
(1998-12-22收稿,1999-06-08修回), http://www.100md.com