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编号:10241148
脂蛋白电泳结合酶显色测定血清各脂蛋白中甘油三酯及临床应用
http://www.100md.com 《临床检验杂志》 1999年第4期
     作者:孙翠平 汪俊军 庄一义

    单位:南京军区南京总医院全军医学检验中心,南京210002

    关键词:脂蛋白电泳;冠心病;甘油三酯

    脂蛋白电泳结合酶显色测定血清各脂蛋白中甘油三酯及临床应用 摘要 采用琼脂糖脂蛋白电泳分离脂蛋白结合甘油三酯(Tg)酶试剂呈色,扫描出各种脂蛋白区带中Tg所占比例,同血清总Tg浓度相乘计算各脂蛋白组份中Tg的含量。结果示本法与参考法比较相关系数:HDL-Tg、VLDL-Tg、LDL-Tg分别为0.873、0.955、0.912。方法的批内CV:HDL-Tg、VLDL-Tg、LDL-Tg分别为8.0%~10.2%、3.8%~6.5%、4.3%~7.0%;批间CV分别为9.5%~16.2%、6.8%~8.5%、4.8%~9.7%。平均回收率:HDL-Tg、VLDL-Tg和LDL-Tg分别为:88.8%、93.4%和91.7%。冠心病组同相应的对照组比较LDL-Tg(0.50±0.32 vs 0.28±0.09 mmol/L)及LDL-Tg/LDL-Ch比值(0.211±0.316 vs 0.095±0.033)均显著升高。该法简便易行,是精密准确定量各脂蛋白中Tg的理想方法。LDL-Tg及LDL-Tg/LDL-Ch比值为冠心病有价值的诊断指标。
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    Determination of triglyceride in lipoproteins separated by agarose gel electrophoresis and its clinical application

    SUN Cuiping,WANG Junjun,ZHUANG Yiyi

    (Department of Biochemistry,General Hospital of Nanjing Military Command.Nanjing 210002)

    Abstract A simple method was developed for measurement of triglyceride(Tg)in lipoproteins. Lipoproteins separated by agarose gel electrophoresis.The Tg of bands was stained by specific enzymatic method(GPO-Trinder)after electrophoresis.The relative amounts of Tg in lipoproteins were determined by densitometric scanning at 520 nm. Absolute triglyceride concentrations of the respective lipoprotein fractions were calculated from total Tg. Comparison of the electrophoresis method with a combined ultracentrifugation/precipitation method in 24 serum resulted in following correlation coefficients:HDL-Tg:γ=0.873;VLDL-Tg:γ=0.955;LDL-TG:γ=0.912.The intra-assay and inter-assay coefficients of variation were:8.0~10.2、3.8~6.5、4.3~7.0%;9.5~16.2、6.8~8.5、4.8~9.7%.The average recovery was 88.8%、93.4%、91.7% respectively.This method is easy to perform,and is a precise and accurate technique for the determination of lipoprotein Tg. The results of 116 control subjects and 60 coronary heart disease(CHD)patients were shown:Total TG、LDL-TG、LDL-TG/LDL-CH were valuable characleristics for CHD.
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    Key words lipoprotein electrophoresis; triglyceride; coronary heart disease

    脂质异常是动脉粥样硬化(AS)发生、发展的重要因素。近年来国外十分关注甘油三酯(Tg)在AS中的作用,认为血浆Tg与LDL的组成相关联,小而密的富含Tg的LDL易于被氧化和被巨噬细胞摄取,是独立的致AS的高危险因素,且同冠心病发生程度相关联[1-3]。各脂蛋白组分中的Tg需通过超速离心结合多价阴离子沉淀来测定,因其操作繁锁、费时,且须有超离装置,不易推广,在临床上得不到广泛应用。本文参考文献[4]建立琼脂糖脂蛋白电泳结合酶显色法测定各脂蛋白组分中Tg含量,并对不同年龄对照人群及冠心病患者血清脂质及各脂蛋白成分中的脂质组成进行分析。

    1 材料和方法

    1.1 仪器 DYY-Ⅲ8A稳流定时电泳仪(北京六一仪器厂),光密度扫描仪(Beckman Appraise),超速离心机(Beckman L8-80M)。
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    1.2 试剂 pH 8.6,μ=0.075 mol/L巴比妥-巴比妥钠缓冲液;5 g/L电泳用琼脂糖凝胶;8 g/L显色用琼脂糖凝胶;甘油三酯酶试剂盒(上海长征公司,GPO-Trinder法。使用时较说明书要求浓缩10倍)。

    1.3 实验对象 冠心病患者(经冠状动脉造影证实或心肌梗死存活者)60例,其中男性34例,女性26例,年龄均>50岁。对照组为无心脑血管等疾病的体健者116例,按年龄不同分为三组。血液标本采自禁食12 h以上者。

    1.4 方法

    1.4.1 脂蛋白分离提取 序列超速离心提取密度为<1.006、1.019~1.063和1.063~1.210 kg/L脂蛋白组分,分别为极低密度蛋白(VLDL)、LDL和高密度脂蛋白(HDL)。

    1.4.2 电泳法分离测定各脂蛋白中Tg[4] 用5 g/L琼脂糖凝胶制一厚度为1.5 mm的凝胶板;距阴极端15 mm处挖槽,加样;在100~120 V电压下电泳40 min左右;将显色剂(8 g/L琼脂糖凝胶与TG酶试剂以2∶1比例混和)立即铺于脂蛋白区带上,置37°C 15 min,于520 nm波长处用光密度仪扫描;各脂蛋白区带中Tg的相对浓度同血清总Tg浓度相乘即得各脂蛋白组分中Tg浓度。酶法测定血清胆固醇和甘油三酯。HDL-Ch磷钨酸-镁沉淀后再行测定。LDL胆固醇采用Friedwaid公式计算(血清总Tg<4.5 mmol/L)。
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    1.4.3 参考方法[4] 超速离心结合沉淀法,先超速离心除去VLDL(密度为<1.006 kg/L),再用磷钨酸/MgCl2沉淀出LDL,得到HDL。通过测定总TG及沉淀前后Tg量,而计算出VLDL-Tg、LDL-Tg和HDL-Tg。

    2 结果

    2.1 各脂蛋白组分中甘油三酯的检测 图1为各脂蛋白组份中甘油三酯区带,从阳极起依次为HDL-Tg,VLDL-Tg和LDL-Tg。标本中若存在乳糜微粒,可在原点处检出,如图中3号标本。204.gif (6554 bytes)

    Figure 1 Electrophoresis patterns of Tg in various lipoprotein fractions
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    图1 各脂蛋白组份中甘油三酯的电泳图谱

    2.1.1 实验条件选择 TG酶试剂浓度较总Tg测定用浓10倍最佳,过稀反应不彻底;过浓则浪费酶试剂。酶显色时间为15 min,过短反应不彻底,过长则区带边缘模糊。

    2.1.2 精密度 取0.5、2.7、5.7 mmol/L Tg浓度的3份血清分别作批内及批间不精密度分析,HDL-Tg、VLDL-Tg、LDL-Tg批内CV分别为8.0%~10.2%、3.8%~6.5%、4.3%~7.0%;批间CV分别为9.5%~16.2%、6.8%~8.5%、4.8%~9.7%。

    2.1.3 准确度 向低Tg血清中分别加入一定量的3种脂蛋白纯品,作回收分析。HDL-Tg、VLDL-Tg和LDL-Tg的平均回收率分别为88.8%、93.4%和91.7%。

    2.1.4 对照试验 24份新鲜血清用电泳法(Y)和参考法(X)分别测定各脂蛋白组份中甘油三酯,结果经相关分析处理,相关系数及回归方程分别为HDL-Tg:r=0.873,Y=1.23X-0.03;VLDL-Tg:r=0.955,Y=0.9X+0.05;LDL-Tg:r=0.912,Y=1.08X+0.04。P值均<0.01。
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    2.2 临床应用 116例不同年龄组的对照人群及60例冠心病患者血脂及各脂蛋白中Tg、Ch水平见表1。

    表1 对照组、冠心病组血脂、脂蛋白中Tg水平(xx1.gif (881 bytes)±s)

    Table 1 Serum lipids and Tg,Ch level in LDL,VLDL and HDL in CHD patients and controls

    Control

    CHD

    <30ya

, 百拇医药     31~50yb

    >50yc

    >50yd

    Total Tg(mmol/L)

    0.73±0.30

    1.06±0.38Δ

    1.16±0.41Δ

    1.72±1.22ΔΔ

    HDL-Tg(mmol/L)

    0.112±0.06
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    0.17±0.05**

    0.17±0.07**

    0.23±0.13*

    VLDL-Tg(mmol/L)

    0.43±0.22

    0.64±0.31**

    0.70±0.32**

    1.00±0.75*

    LDL-Tg(mmol/L)

    0.19±0.07
, 百拇医药
    0.25±0.086**

    0.28±0.09Δ

    0.50±0.32ΔΔ

    Total Ch(mmol/L)

    4.15±0.75

    4.56±0.63*

    4.96±0.89**

    5.08±1.03

    HDL-Ch(mmol/L)

    1.46±0.31
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    1.40±0.32

    1.29±0.31*

    1.20±0.32

    LDL-Ch(mmol/L)

    2.36±0.65

    2.66±0.64*

    3.12±0.77**

    3.09±1.02

    LDL-Tg/LDL-Ch

    0.084±0.034

    0.097±0.036
, 百拇医药
    0.095±0.033

    0.211±0.316ΔΔ

    n

    32

    42

    42

    80

    b,c compared with a;d compared with c,*P<0.05,**P<0.01,ΔP<0.005,ΔΔP<0.001 2.2.1 对照组随着年龄的增长,总Ch、Tg浓度及在各脂蛋白组分中含量均明显升高;而LDL-Tg/LDL-Ch比值无变化。

    2.2.2 冠心病组同相对应的对照组相比,总Tg及各脂蛋白组分中Tg含量明显升高;Ch无变化。LDL-Tg/LDL-Ch比值高度显著升高。
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    3 讨论

    血清中少量游离甘油迁移到负极,可忽略不计,亦可测定实际Tg量(排除甘油)再行计算。VLDL区带中还含有不等量的Lp(a),因Lp(a)中TG含量极低对结果无干扰[5]。Winkler等[4]利用磷酸甘油脱氢酶法,最终生成不溶性产物甲月 替而显色。我们考虑到酶试剂来源,采用GPO-Trinder法,为了防止酶试剂和产物的流动以及区带间的扩散,将酶试剂加入8 g/L凝胶中予以固定,获得了较为满意的效果。

    本文测定的116例不同年龄组正常人群Ch、Tg水平与国内以前报道的结果相符[5]。各脂蛋白组分中Tg含量随着年龄的增长而增加。CHD患者Ch、LDL-Ch和HDL-Ch水平,同<30岁对照组相比呈显著变化,但同>50岁同年龄组相比无变化。LDL-Ch升高和HDL-Ch降低是公认的致CHD的危险因素,随着年龄升高,Ch和CHD相关性降低,可能原因为大多数CHD患者已较早死于脂质异常疾病,或其他因素可能起主要作用。本文资料示Tg、LDL-Tg和LDL-Tg/LDL-Ch比值升高是CHD患者最为显著的脂质异常特征。
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    小而密LDL的是CHD的强危险因素,该种LDL亚组分与Tg水平相关,由高Tg引起[6,7]。LDL组成与AS相关,LDL中的Tg水平同CHD的发展速度,严重程度(经冠状动脉造影确定)高度正相关[8];我们的研究认为LDL-Tg、LDL-Tg/LDL-Ch比值为CHD患者一组有价值的危险指标。

    *江苏省应用基础研究课题(BJ97111)

    作者简介:孙翠平(进修人员)

    参考文献

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    4 Winkler K,Nauck M,et al. Determination of triglycerides in lipoproteins separated by agarose gel electrophoresis. J Lipid Res,1995,36:1 839

    5 Li Jian-Zhai,Li Pei-Ying,Niu Qing-Tian,et al. Serum lipid and lipoprotein patterns of Beijing populations from birth to senecence.Chinese Medical Joumal,1988:101:659
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    6 Miller B D,Alderman E L,Haskell W L,et al. Predominance of dense low density lipoprotein particles predicts angiographic benefit therapy in Stanford coronary risk intervention project.Circuration,1996,24:2 146

    7 Lamarche B,Tchemof A,Moorjani S,et al. Small,dense low-density lipoprotein particles as a predictor of the risk of ischemic heart disease in man-prospective results from the Quebec cardiovascular study.Circulation,1997,95:69
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    8 Tornvall P,Karpe F,Carlson L A,et al. Relatioships of low density lipoprotein subfractions to angiographically defined coronary artery diseasein young survivors of myocardial infaction.Atherosclerosis,1991,90:67~80

    9 Tilly-Kiesi M,Syvanne M,Lahdenpera T K,et al. Abnormalitics of LDL in normolipidemic type Ⅱdiabetic and nondiabetic patients with coronary artery disease.J Lipid Res 1992,33:33

    10 Kinoshita M,Krul E S,Schonfeld G.Modification of the core lipids of low density lipoproteins produces selective alterations in the expression of apoB-100 epitopes.J Lipid Res,1990,31:701

    (1998-09-28收稿,1999-02-12修回), 百拇医药