肾综合征出血热病毒R22株核蛋白基因的克隆、序列分析及其表达
作者：姚智慧 董关木 俞永新
单位：中国药品生物制品检定所，北京 100050
关键词：肾综合征出血热病毒；核蛋白；基因克隆；序列分析；表达
中国病毒学990406 摘 要 为研究肾综合征出血热病毒疫苗侯选株R22核蛋白的结构与特性，应用逆转录PCR扩增了R22编码区基因，并将扩增产物克隆于pET-3a表达质粒，测得R22株S片段编码区序列为1 290个核苷酸。比较分析表明与Seoul型同源性高达96.2%，而与Hantaan型同源性仅为71.0%，与用血清学分型的结果一致。将克隆的pET-R22NP 转化到BL21后，IPTG诱导得到较高效的表达，产物纯化后进行Western blot分析，结果表达的NP仅与NP蛋白特异的单克隆抗体A35和3D9反应，而与G2蛋白特异的3D8不反应。表达的产物为汉坦病毒的诊断提供了特异性抗原。
, 百拇医药
Cloning, Sequencing and Expressing of S Segment Coding
Gene of Seoul Virus R22 Strain
Yao Zhihui Dong Guanmu Yu Yongxin
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050)
Abstract For studing the structure and characteristic of nucleoprotein (NP) of Seoul virus R22 strain, which is the seed virus of HFRS candidate vaccine, the NP gene coding region of the R22 S segment was amplificated by RT-PCR and then cloned it into pET-3a expression plasmid. Sequence assay showed that the NP gene contains 1 290 nucleotides, which has homology of 96.2% with well known Seoul virus (SR-11) and 71.0% with Hantaan virus (76-118). These results coincide with previous serological testings. The cloned NP gene has been transformed into E.coli BL21 and it could give a high expression when induced by IPTG. Western blot and ELISA assay of the purified products showed that expressed NP only reacted with NP-specific MAbs A35 and 3D9, but not with G2-specific MAb 3D8. The expressed NP can be used as a specific antigen for clinical diagnosis.
, 百拇医药
Key words Seoul virus, Nucleoprotein(NP), Cloning, Sequencing, Expression
肾综合征出血热是由布尼亚病毒科汉坦病毒属引起的、临床上以发热、出血及肾损害为基本特征的一类疾病[1]。汉坦病毒具有单股负链RNA组，分L、M、S 3个片段，分别编码病毒的多聚酶，包膜蛋白和核蛋白[2～5]。研究表明，3个蛋白中以NP含量为高，免疫原性强[6～8]。为研究NP蛋白的结构与特性，应用带有T7噬菌体启动子的pET-3a表达质粒对我国疫苗侯选株R22株的S基因进行克隆、测序分析，并在大肠杆菌中获得较高效的表达。
1 材料和方法
1.1 菌种和质粒 pET-3a质粒和BL21宿主菌均为Stratagene公司产品。
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1.2 Vero-E6细胞 来自ATCC，由我室传代保存。病毒在Vero-E6细胞上感染7～10 d左右收获，滴度大于107PFU/mL。
1.3 R22毒株 从河南省新安县疫区褐家鼠组织分离[9]，Vero-E6细胞传代，-70 ℃保存。该毒株经交叉中和试验[10]和交叉保护力试验[11]表明具有较广谱的抗原特性。
1.4 RNA提取 应用热酚异硫氰酸胍法，参见文献[12]。
1.5 引物的设计与合成 参照肾综合征出血热标准株76-118的序列[3]，设计带有EcoRⅠ和BglⅡ酶切位点的引物3条，在ABI的DNA合成仪上合成，用异丁醇提取纯化。
P1： TAGTAGTAGACTCCCTA (1～17)
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P2： CCAGATCTATGGCAACTATGGAG (37～51)
P3： GGAATTCTTAGAGTTTCAAAGG (1 326～1 312)
1.6 cDNA合成及巢式PCR 将提取的总RNA加40 u的AMV逆转录酶和1 μL的随机引物，42 ℃逆转录2 h，然后以P1，P3为引物，92 ℃ 2 min，42 ℃ 2 min，72 ℃ 3 min，1个循环后，92 ℃ 30 s，42 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环，最后延伸7 min。扩增的产物再以P2，P3为引物进行巢式PCR，条件同上。
1.7 扩增DNA的纯化、酶切及克隆 将扩增的产物在0.8% Agarose凝胶上电泳回收，用BIO 101公司的Geneclean Ⅱ kit纯化后，再用EcoRⅠ和Bg1Ⅱ酶切消化并纯化；同时将载体pET-3a用EcoRⅠ和BamHI切割并纯化。用连接酶在16 ℃连接4 h后转化到BL21(DE3)中，在LB培养板上筛选克隆。
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1.8 序列分析 将克隆正确的质粒纯化后，应用Pharmacia Biotech的全自动序列分析仪进行测序，并应用DNASIS软件进行辅助计算机分析。
1.9 核蛋白的表达和纯化 将克隆成功的pET-R22 NP转化到BL21后，用IPTG进行诱导表达，菌体用超声波处理后以硫酸铵沉淀，并经Phenyl Sepharose CL-4B柱纯化，最后用50 mmol/L Tris-EDTA透析，而后进行SDS-PAGE和Western-blot分析。
1.10 ELISA 用每孔100 ng纯化的重组核蛋白包被ELISA板，常规ELISA方法检测单克隆抗体的抗体水平，同时用抗原夹心ELISA法对照比较。
2 结果
2.1 质粒的构建
表达载体的构建见图1。
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图1 pET-NP表达载体的构建图
Fig.1 Construction of pET-NP expression vector
pET-sNP经EcoR Ⅰ酶切鉴定证明插入的为正确的约1.3 kb的R22 NP基因，见图2。
图2 PCR扩增、克隆和酶切分析
Fig.2 PCR amplification, cloning and restriction enzymes analysis
M. Molecular markers, 1 kb DNA ladder
A. PCR amplified 1.3 kb S segment cDNA
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B. DNAs from pET-R22-NP digested with EcoR Ⅰ and Bg1Ⅱ, the upper band is the plasmid DNA, the lower band is inserted PCR amplified S segment cDNA
2.2 序列分析
克隆的R22株S片段编码区共测得1 290个核苷酸，并由此得到推断的氨基酸序列(1～430)，见图3、4。
图3 R22株S片段编码区序列
Fig.3 Nucleotide sequences of S segment code gene of R22 virus
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图4 依据核苷酸序列推导的R22 S片段氨基酸序列
Fig.4 The deduced amino acid sequences of R22 S segment depended upon nucleotide sequences
将测得的核苷酸序列与汉坦病毒HTN型标准株76-118比较，仅71.0%同源，而与SEO型SR-11株同源率高达96.2%。
2.3 表达和纯化
以不同浓度的IPTG和不同温度进行诱导表达，结果表明，0.5 mmol/L IPTG、30 ℃培养表达效果较好。应用硫酸铵沉淀和Phenyl Sephrose CL-4B柱层析并用磷酸盐缓冲液洗柱，可从每升菌液中纯化到9 mg的NP蛋白。
2.4 表达的结构蛋白SDS-PAGE和Western blot分析
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将不同纯化步骤的NP蛋白和培养的R22裂解蛋白进行SDS-PAGE分析，并应用NP蛋白特异的单克隆抗体A35、3D9和G2蛋白特异的单抗3D8进行免疫印迹分析，结果表达的NP仅与A35和3D9反应而不与3D8反应，而且大小与天然的NP相一致，见图5。
图5 SDS-PAGE和Western blot电泳图
Fig.5 Electrophoresis of SDS-PAGE and Western blot
M. Molecular weight, SeeBlueTM Pre-Stained Standards A. Expression products, after sonication
B. Expression products, after (NH4)2SO4 deposited C. Expression products, after pleny1 Sepharose CL-4B
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D. Hantavirus 76-118 on Vero cells lysis by 1% NP-40
2.5 ELISA检测的结果
对20株核蛋白和1株G2单克隆抗体检测表明，直接包被纯化重组核蛋白ELISA与传统的抗原夹心ELISA相比结果一致，但敏感性高，抗体水平平均高2～4倍。
3 讨论
本研究将我国正在研究的侯选疫苗株R22的结构蛋白基因进行了序列分析，阐明了该株核蛋白编码区的1 290个核苷酸cDNA的一级结构，和已知标准毒株的序列分析比较表明，与同型的Seoul型SR-11株同源性高达96.2%，而与Hantaan型76-118株同源仅为71.0%。并由核苷酸序列得到了推断的氨基酸序列1～429及其等电点为7.728。
将pET-3a载体克隆的R22结构蛋白基因插入大肠杆菌中，并有效表达了R22的NP蛋白，且能与特异性的单抗反应，其分子量与天然的NP一致，为我们研究病毒结构蛋白的功能提供了可能。虽然NP蛋白上没有中和位点，抗NP的单抗亦不具备中和活性，但Schmal john等报道用重组昆虫表达的NP免疫田鼠后，可部分抵御汉坦病毒的攻击，认为其免疫保护力由细胞免疫所介导[13]。Yoshimatsu用乳小鼠类似的研究也证明了这一点[14]。因此认为NP在基因工程疫苗中占有重要地位，我们所表达的NP将有可能作为基因工程疫苗的一种重要成分。同时用所表达的产物对不同位点的20株单抗良好的检测结果表明，我们所表达的核蛋白可以作为对该病毒的诊断的一种优质价廉的特异性抗原。
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参考文献
1 Lee HW, Lee PW, Johnson KM. Isolation of the etiologic agent of Korea hemorrhagic fever, J Infec Dis, 1978,137:298
2 Schmaljohn CS, Drlrymple JM. Analysis of a new genus of Bunyaviridae, Virology, 1983,131:482～491
3 Schmaljohn CS, Jennings GB, Hay J et al. Coding strategy of the S genome segment of Hantaan Virus, Virology, 1986,155:633～643
4 Schmaljohn CS, Schmaljohn AL. Drlrymple JM. Hantaan virus M RNA: Coding strategy, nucleotide sequence and gene order, Virology, 1987,151:31～39
, 百拇医药
5 Schmaljohn CS. Nucleotide sequence of the Hantaan virus L RNA segment. Nucleic Acid Research, 1990,18:6278
6 Schmaljohn CS, Hasty SE, Harrison SA et al. Characterization of Hantaan virions, the prototype of hemorrhagic fever with renal syndrome, The Journal of Infectious Disease, 1983,148:1005～1012
7 Schmaljohn CS, Hasty SE, Rosmussen L et al. Hantaan virus replication: Effects of monensin, tanicamycin and endoghycosidases on the structural glycoproteins, Journal of General Virology, 1986,67:707～717
, 百拇医药
8 Zòller L, Scholz J, Stohwasser R et al. Immunoblot analysis of the serological response in Hantavirus infectious, Journal of Medical Virology, 1989,27:231～237
9 Song G, Hang CS, Liao HX et al. Antigenic difference between viral strains causing classical and mild types of epidemic hemorrhagic fever with renal syndrome in China, J Infec Dis, 1984,150:889～894
10 俞永新，安祺，姚智慧等.用空斑减少中和试验比较肾综合征出血热不同毒株的抗原性.中华微生物和免疫学杂志，1991，11(3)：162～164
, 百拇医药
11 何浩，陈云华，李永珍等.肾综合征出血热病毒在金黄地鼠体内的交叉保护研究.中华实验和临床病毒学杂志，1990，4(4)：447～450
12 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.7:6～25
13 Schmaljohn CS, Yong kyu Chu, Schmaljohn Al et al. Antigenic subunits of hantaan virus expressed by baculovirus and vaccinia virus recombinants. J Virol, 1990, 64(7):3162～3170
14 Yoshimatsu K, Y-C Yoo, Yoshida R. Protective immunity of Hantaan virus nuclecapsid and envelope protein studies using baculovirus-expressed proteins, Arch Virol, 1993,130:365～376
*收稿日期：1998-11-13，修回日期：1999-04-16, http://www.100md.com
单位：中国药品生物制品检定所，北京 100050
关键词：肾综合征出血热病毒；核蛋白；基因克隆；序列分析；表达
中国病毒学990406 摘 要 为研究肾综合征出血热病毒疫苗侯选株R22核蛋白的结构与特性，应用逆转录PCR扩增了R22编码区基因，并将扩增产物克隆于pET-3a表达质粒，测得R22株S片段编码区序列为1 290个核苷酸。比较分析表明与Seoul型同源性高达96.2%，而与Hantaan型同源性仅为71.0%，与用血清学分型的结果一致。将克隆的pET-R22NP 转化到BL21后，IPTG诱导得到较高效的表达，产物纯化后进行Western blot分析，结果表达的NP仅与NP蛋白特异的单克隆抗体A35和3D9反应，而与G2蛋白特异的3D8不反应。表达的产物为汉坦病毒的诊断提供了特异性抗原。
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Cloning, Sequencing and Expressing of S Segment Coding
Gene of Seoul Virus R22 Strain
Yao Zhihui Dong Guanmu Yu Yongxin
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050)
Abstract For studing the structure and characteristic of nucleoprotein (NP) of Seoul virus R22 strain, which is the seed virus of HFRS candidate vaccine, the NP gene coding region of the R22 S segment was amplificated by RT-PCR and then cloned it into pET-3a expression plasmid. Sequence assay showed that the NP gene contains 1 290 nucleotides, which has homology of 96.2% with well known Seoul virus (SR-11) and 71.0% with Hantaan virus (76-118). These results coincide with previous serological testings. The cloned NP gene has been transformed into E.coli BL21 and it could give a high expression when induced by IPTG. Western blot and ELISA assay of the purified products showed that expressed NP only reacted with NP-specific MAbs A35 and 3D9, but not with G2-specific MAb 3D8. The expressed NP can be used as a specific antigen for clinical diagnosis.
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Key words Seoul virus, Nucleoprotein(NP), Cloning, Sequencing, Expression
肾综合征出血热是由布尼亚病毒科汉坦病毒属引起的、临床上以发热、出血及肾损害为基本特征的一类疾病[1]。汉坦病毒具有单股负链RNA组，分L、M、S 3个片段，分别编码病毒的多聚酶，包膜蛋白和核蛋白[2～5]。研究表明，3个蛋白中以NP含量为高，免疫原性强[6～8]。为研究NP蛋白的结构与特性，应用带有T7噬菌体启动子的pET-3a表达质粒对我国疫苗侯选株R22株的S基因进行克隆、测序分析，并在大肠杆菌中获得较高效的表达。
1 材料和方法
1.1 菌种和质粒 pET-3a质粒和BL21宿主菌均为Stratagene公司产品。
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1.2 Vero-E6细胞 来自ATCC，由我室传代保存。病毒在Vero-E6细胞上感染7～10 d左右收获，滴度大于107PFU/mL。
1.3 R22毒株 从河南省新安县疫区褐家鼠组织分离[9]，Vero-E6细胞传代，-70 ℃保存。该毒株经交叉中和试验[10]和交叉保护力试验[11]表明具有较广谱的抗原特性。
1.4 RNA提取 应用热酚异硫氰酸胍法，参见文献[12]。
1.5 引物的设计与合成 参照肾综合征出血热标准株76-118的序列[3]，设计带有EcoRⅠ和BglⅡ酶切位点的引物3条，在ABI的DNA合成仪上合成，用异丁醇提取纯化。
P1： TAGTAGTAGACTCCCTA (1～17)
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P2： CCAGATCTATGGCAACTATGGAG (37～51)
P3： GGAATTCTTAGAGTTTCAAAGG (1 326～1 312)
1.6 cDNA合成及巢式PCR 将提取的总RNA加40 u的AMV逆转录酶和1 μL的随机引物，42 ℃逆转录2 h，然后以P1，P3为引物，92 ℃ 2 min，42 ℃ 2 min，72 ℃ 3 min，1个循环后，92 ℃ 30 s，42 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环，最后延伸7 min。扩增的产物再以P2，P3为引物进行巢式PCR，条件同上。
1.7 扩增DNA的纯化、酶切及克隆 将扩增的产物在0.8% Agarose凝胶上电泳回收，用BIO 101公司的Geneclean Ⅱ kit纯化后，再用EcoRⅠ和Bg1Ⅱ酶切消化并纯化；同时将载体pET-3a用EcoRⅠ和BamHI切割并纯化。用连接酶在16 ℃连接4 h后转化到BL21(DE3)中，在LB培养板上筛选克隆。
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1.8 序列分析 将克隆正确的质粒纯化后，应用Pharmacia Biotech的全自动序列分析仪进行测序，并应用DNASIS软件进行辅助计算机分析。
1.9 核蛋白的表达和纯化 将克隆成功的pET-R22 NP转化到BL21后，用IPTG进行诱导表达，菌体用超声波处理后以硫酸铵沉淀，并经Phenyl Sepharose CL-4B柱纯化，最后用50 mmol/L Tris-EDTA透析，而后进行SDS-PAGE和Western-blot分析。
1.10 ELISA 用每孔100 ng纯化的重组核蛋白包被ELISA板，常规ELISA方法检测单克隆抗体的抗体水平，同时用抗原夹心ELISA法对照比较。
2 结果
2.1 质粒的构建
表达载体的构建见图1。
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图1 pET-NP表达载体的构建图
Fig.1 Construction of pET-NP expression vector
pET-sNP经EcoR Ⅰ酶切鉴定证明插入的为正确的约1.3 kb的R22 NP基因，见图2。
图2 PCR扩增、克隆和酶切分析
Fig.2 PCR amplification, cloning and restriction enzymes analysis
M. Molecular markers, 1 kb DNA ladder
A. PCR amplified 1.3 kb S segment cDNA
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B. DNAs from pET-R22-NP digested with EcoR Ⅰ and Bg1Ⅱ, the upper band is the plasmid DNA, the lower band is inserted PCR amplified S segment cDNA
2.2 序列分析
克隆的R22株S片段编码区共测得1 290个核苷酸，并由此得到推断的氨基酸序列(1～430)，见图3、4。
图3 R22株S片段编码区序列
Fig.3 Nucleotide sequences of S segment code gene of R22 virus
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图4 依据核苷酸序列推导的R22 S片段氨基酸序列
Fig.4 The deduced amino acid sequences of R22 S segment depended upon nucleotide sequences
将测得的核苷酸序列与汉坦病毒HTN型标准株76-118比较，仅71.0%同源，而与SEO型SR-11株同源率高达96.2%。
2.3 表达和纯化
以不同浓度的IPTG和不同温度进行诱导表达，结果表明，0.5 mmol/L IPTG、30 ℃培养表达效果较好。应用硫酸铵沉淀和Phenyl Sephrose CL-4B柱层析并用磷酸盐缓冲液洗柱，可从每升菌液中纯化到9 mg的NP蛋白。
2.4 表达的结构蛋白SDS-PAGE和Western blot分析
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将不同纯化步骤的NP蛋白和培养的R22裂解蛋白进行SDS-PAGE分析，并应用NP蛋白特异的单克隆抗体A35、3D9和G2蛋白特异的单抗3D8进行免疫印迹分析，结果表达的NP仅与A35和3D9反应而不与3D8反应，而且大小与天然的NP相一致，见图5。
图5 SDS-PAGE和Western blot电泳图
Fig.5 Electrophoresis of SDS-PAGE and Western blot
M. Molecular weight, SeeBlueTM Pre-Stained Standards A. Expression products, after sonication
B. Expression products, after (NH4)2SO4 deposited C. Expression products, after pleny1 Sepharose CL-4B
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D. Hantavirus 76-118 on Vero cells lysis by 1% NP-40
2.5 ELISA检测的结果
对20株核蛋白和1株G2单克隆抗体检测表明，直接包被纯化重组核蛋白ELISA与传统的抗原夹心ELISA相比结果一致，但敏感性高，抗体水平平均高2～4倍。
3 讨论
本研究将我国正在研究的侯选疫苗株R22的结构蛋白基因进行了序列分析，阐明了该株核蛋白编码区的1 290个核苷酸cDNA的一级结构，和已知标准毒株的序列分析比较表明，与同型的Seoul型SR-11株同源性高达96.2%，而与Hantaan型76-118株同源仅为71.0%。并由核苷酸序列得到了推断的氨基酸序列1～429及其等电点为7.728。
将pET-3a载体克隆的R22结构蛋白基因插入大肠杆菌中，并有效表达了R22的NP蛋白，且能与特异性的单抗反应，其分子量与天然的NP一致，为我们研究病毒结构蛋白的功能提供了可能。虽然NP蛋白上没有中和位点，抗NP的单抗亦不具备中和活性，但Schmal john等报道用重组昆虫表达的NP免疫田鼠后，可部分抵御汉坦病毒的攻击，认为其免疫保护力由细胞免疫所介导[13]。Yoshimatsu用乳小鼠类似的研究也证明了这一点[14]。因此认为NP在基因工程疫苗中占有重要地位，我们所表达的NP将有可能作为基因工程疫苗的一种重要成分。同时用所表达的产物对不同位点的20株单抗良好的检测结果表明，我们所表达的核蛋白可以作为对该病毒的诊断的一种优质价廉的特异性抗原。
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参考文献
1 Lee HW, Lee PW, Johnson KM. Isolation of the etiologic agent of Korea hemorrhagic fever, J Infec Dis, 1978,137:298
2 Schmaljohn CS, Drlrymple JM. Analysis of a new genus of Bunyaviridae, Virology, 1983,131:482～491
3 Schmaljohn CS, Jennings GB, Hay J et al. Coding strategy of the S genome segment of Hantaan Virus, Virology, 1986,155:633～643
4 Schmaljohn CS, Schmaljohn AL. Drlrymple JM. Hantaan virus M RNA: Coding strategy, nucleotide sequence and gene order, Virology, 1987,151:31～39
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5 Schmaljohn CS. Nucleotide sequence of the Hantaan virus L RNA segment. Nucleic Acid Research, 1990,18:6278
6 Schmaljohn CS, Hasty SE, Harrison SA et al. Characterization of Hantaan virions, the prototype of hemorrhagic fever with renal syndrome, The Journal of Infectious Disease, 1983,148:1005～1012
7 Schmaljohn CS, Hasty SE, Rosmussen L et al. Hantaan virus replication: Effects of monensin, tanicamycin and endoghycosidases on the structural glycoproteins, Journal of General Virology, 1986,67:707～717
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8 Zòller L, Scholz J, Stohwasser R et al. Immunoblot analysis of the serological response in Hantavirus infectious, Journal of Medical Virology, 1989,27:231～237
9 Song G, Hang CS, Liao HX et al. Antigenic difference between viral strains causing classical and mild types of epidemic hemorrhagic fever with renal syndrome in China, J Infec Dis, 1984,150:889～894
10 俞永新，安祺，姚智慧等.用空斑减少中和试验比较肾综合征出血热不同毒株的抗原性.中华微生物和免疫学杂志，1991，11(3)：162～164
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11 何浩，陈云华，李永珍等.肾综合征出血热病毒在金黄地鼠体内的交叉保护研究.中华实验和临床病毒学杂志，1990，4(4)：447～450
12 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.7:6～25
13 Schmaljohn CS, Yong kyu Chu, Schmaljohn Al et al. Antigenic subunits of hantaan virus expressed by baculovirus and vaccinia virus recombinants. J Virol, 1990, 64(7):3162～3170
14 Yoshimatsu K, Y-C Yoo, Yoshida R. Protective immunity of Hantaan virus nuclecapsid and envelope protein studies using baculovirus-expressed proteins, Arch Virol, 1993,130:365～376
*收稿日期：1998-11-13，修回日期：1999-04-16, http://www.100md.com