胃粘膜损伤中EB病毒感染与P53抑癌基因突变的研究
作者：赵军理 糜克永 龙焱华 方向明
单位：赵军理 糜克永 中国科学院武汉病毒所，武汉 430071；龙焱华 方向明 武汉第三医院，武汉 430060
关键词：EB病毒；p53基因；聚合酶链反应；PCR-SSCP分析；胃粘膜损伤
中国病毒学990402 摘 要 为了探讨EB病毒(EBV)感染与胃癌发生的关系，应用PCR技术对166例胃粘膜损伤标本的EBV DNA进行检测，其中66例应用银染PCR-SSCP分析技术检测了p53 exon5～8突变情况，10例应用直接法原位PCR技术检测了EBV在组织中的感染情况。结果166例标本中EBV感染率为30.1%；EBV在细胞中感染大体呈弥散型，主要存在于细胞核。66例标本中p53基因突变率为54.5%。对比分析，EBV阳性标本中p53基因突变率为75%(21/28)，EBV阴性标本中p53基因突变率为39.5%(15/38)。结果表明，EBV对胃粘膜组织细胞具有易感性，p53基因突变在胃粘膜病变中是一个常发事件，EBV感染与p53基因突变之间存在着高度相关性，对癌症的发生具有重要作用。
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EB Virus Infection and Mutation of p53 Suppressor Gene
in Gastric Mucoma Damages
Zhao Junli Mi Keyong
(Wuhan Institute of Virology, Academia Sinica, Wuhan 430071)
Long Yanhua Fang Xiangming
(The Third Hospital of Wuhan, Wuhan 430060)
Abstract To investigate the relationship between EBV infection and genesis of gastric cancer, PCR, PCR-SSCP assay and direct in situ PCR technique were performed on samples of gastric mucoma damages; EBV infection rate was 30.1% in 166 samples; EBV was scattered in tissues and roughly in nucleuses. p53 gene mutation rate was 54.5% in 66 samples. In contrast, p53 gene mutation rate was 75% in EBV-positive samples (21/28), but 39.5% in EBV-negative ones (15/38). The results suggest that EBV is infectious for gastric mucoma cells, p53 gene mutation is common in gastric mucoma pathological changes, EBV infection has high correlation with p53 mutation, and is of importance during the genesis of cancer.
, 百拇医药
Key words EB virus, p53 gene, Polymerase chain reaction, PCR-SSCP assay, Gastric mucoma damage
EB病毒是一种DNA肿瘤病毒，感染十分普遍，与低分化鼻咽癌及多种淋巴瘤关系密切。近年来通过检测胃癌组织细胞中EBV基因组发现EBV感染与胃癌的发生有关[1]。然而目前的研究尚不足以明确揭示这种关系。
胃癌的发生是一个多因素、多阶段、多基因异常积累的结果。研究发现，p53抑癌基因异常在胃癌发生的早期即可出现，且呈渐进发展的趋势，是胃癌发生中一个重要的分子指标。因此，我们对胃粘膜损伤中EBV感染与p53基因突变进行检测，以探讨EBV在胃癌发生中可能的作用机制，为胃癌的病因和预防提供理论依据。
1 材料与方法
, http://www.100md.com 1.1 标本及来源 慢性浅表性胃炎(CSG)74例，为胃镜下钳取活检组织；病理证实的新鲜手术标本中，胃溃疡26例，慢性萎缩性胃炎(CAG)11例；39例胃癌中腺癌21例；淋巴上皮样癌6例，恶性淋巴瘤3例，鳞癌7例，残胃癌2例。其中16例胃癌分成癌旁组织和癌组织。男性101例，女性49例，平均年龄41.9岁。以上标本均来自于武汉第三医院、同济医院、湖北省肿瘤医院。
1.2 引物选择及PCR条件 见表1。
表1 EBV和p53基因引物序列、扩增产物长度及PCR退火温度
Table 1 Primesrs sequences, products length and PCR annealing temprature of EBV and p53 gene 引物
Primers
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位置
Position
序列
Sequence
片段大小(bp)
Length(bp)
退火温度
Annealing
temp.(℃)
EBV引物
EBV
primer
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gp220
(BamHI L region)
5′-GGCTGGTGTCACCGGTGTTA-3′
5′-CCTTAGGAGGAACAAGTCCC-3′
239
55
EBNAI
(BamHI K region)
5′-GTACTCATCACCGGGTCTC-3′
5′-TTCGGGTTGGAACCTCCTTG-3′
, 百拇医药
269
55
p53引物
p53
primer
Exon5-6
5′-TTCCTCTTCCTGCAGTACT-3′
5′-AGTTGCAAACCAGACCTCAG-3′
408
63
Exon7
5′-TGTTGTCTCCTAGGTTGGCT-3′
, 百拇医药
5′-CAAGTGGCTCCTGACCTGGA-3′
140
56
Exon8
5′-TCCTTATCCTGAGTAGTGGT-3′
5′-TCGCTTAGTGCTCCCTGTGG-3′
155
56
EBV DNA引物参照文献[2]，p53基因三组引物根据文献[3]报道序列设计，均由上海生工公司合成。
1.3 主要试剂 Taq DNA聚合酶、4×dNTPs购自洛阳华美生物工程公司。Bio-11-dUTP及碱性磷酸酯酶显色系统(AV-AP，BCIP/NBT)、APES、原位扩增载玻片；扩增盖帽及封口膜均购自德国Boehringer Mannhein公司。其它试剂多用分析纯。
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1.4 主要仪器 9801-D型基因扩增仪购自西安交通大学开元(集团)电子设备公司，原位基因扩增仪购自英国Techne公司，中压垂直电泳槽购自北京六一仪器厂。
1.5 主要方法及结果判定
1.5.1 核酸提取 取米粒大小的胃镜钳取活检组织或新鲜手术标本1～2块，在1.5 mL eppendorf管中用足量生理盐水漂洗3次后，用洁净的手术剪刀充分剪碎。加入100～200 μL裂解液(10 mmol/L Tris-HCl，pH7.6, 1% SDS，300 μg/mL蛋白酶K)，60 ℃孵育至组织块溶解变清(约需3～8 h)，按常规的酚/氯仿方法抽提蛋白，乙醇沉淀核酸，漂洗，晾干。50 μL TE缓冲液(pH8.0)溶解，取5 μL作模板。EBV阳性对照为B 95-8转化细胞，由本所病毒室王汉中老师提供。
1.5.2 PCR 在30 μL PCR反应液中，含1×PCR buffer，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L 4×dNTPs, 1 u Taq DNA聚合酶，上下游引物各为0.5 μmol/L，上覆30 μL灭菌液体石蜡。扩增程序为94 ℃预变性5 min，然后94 ℃ 50 s，退火(55、56或63 ℃)50 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环，最后72 ℃再延伸3 min。
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1.5.3 EBV检测结果判断 15 μL PCR扩增物在2%琼脂糖凝胶上电泳，60 V 30 min，溴化乙锭染色，透射紫外仪上观察结果，与阳性对照处于同一位置的为阳性，否则为阴性，阴性对照无扩增带。
1.5.4 银染PCR-SSCP及结果判断 参照Orita[4]方法稍作改进。取15 μL p53扩增物与10 μL上样液(95%甲酰胺，20 mmol/L EDTA Na2，0.03%二甲苯青)混合，沸水浴10 min，立即置于冰浴10 min，8%聚丙烯酰胺(双体∶单体=39∶1，含10%的甘油)，1×TBE，室温，150 V电泳5 h，取下凝胶于10%乙醇溶液中固定10 min，0.2%硝酸银染15 min，5%硝酸溶液脱色10 min，蒸馏水漂洗三次，0.4%甲醛-15%氢氧化钠溶液中显色至单链带清晰，倾去显色液，蒸馏水漂洗，3%冰乙酸定影，照相。未发生突变的DNA除了未变性完全及部分恢复的dsDNA外，还有两条ssDNA，发生突变的DNA则多出异常泳动的ssDNA。
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1.5.5 原位PCR操作及结果观察 参照苏慧慈编著的《原位PCR》，自行设计方案。
1.5.5.1 组织切片预处理按常规病理学方法，先二甲苯脱蜡，梯度乙醇去二甲苯入水，0.2 mol/L HCl酸化，PBS漂洗，然后20 μg/mL蛋白酶K 37 ℃消化10～15 min，最后用4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗。
1.5.5.2 原位PCR在组织切片上贴上原位扩增帽，注入80～100 μL PCR反应液(1×PCR buffer，2 mmol/L MgCl2，300 μmol/L dATP、dCTP、dGTP,225 μmol/L dTTP，75 μmol/L Bio-11-dUTP，1 u Taq DNA聚合酶/10 μL PCR反应液，EBV DNA引物P1P2和P3P4均为1 μmol/L)，封口膜封口。在原位块上，设置94 ℃预变性10 min，然后94 ℃变性60 s，55 ℃退火75 s，72 ℃延伸90 s，最后72 ℃再延伸10 min。揭去原位帽，PBS漂洗5次，每次5 min。
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1.5.5.3 显色 以链霉亲和素-碱性磷酸酷酶(AV-AP)亲和扩增片段，TBS漂洗，再以BCIP/NBT显色20～40 min，核固红复染，中性树胶封片，显微镜下观察，照相。
1.5.5.4 以低分化鼻咽癌标本并经PCR检测核酸为EBV DNA阳性的切片作阳性对照，阴性对照为经PCR检测核酸为EBV DNA阴性的胃粘膜组织切片及无Taq DNA聚合酶或无引物的三种体系。
2 结果
2.1 EBV DNA检出率 见表2，PCR扩增产物电泳结果见图1和2。
图1 EBV P1P2 DNA引物(gp220, BamHI L region)扩增产物(239 bp)电泳结果
, 百拇医药
1.PCR Markers；2.阳性对照，为B95-8转化细胞；3.阴性对照，为TE缓冲液(pH8.0)；4，5，8.分别为EBV感染的胃炎、胃溃疡、胃癌标本；6，7.为未受EBV感染的标本。
Fig.1 Agarose electrophoresis of EBV P1P2 DNA primers (gp220, BamHI L region) amplyfying products (269 bp)
1.PCR Markers;2.Positive control, which was B95-8 transformed cells.; 3.Negative control, which was TE buffer (pH8.0); 4,5,8.EBV infection in gastritis,gastrohelcoma and gastric cancer, respectively; 6,7.Samples of non-EBV infection.
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图2 EBV P3P4 DNA引物(EBN A1,BamHI K region)扩增产物(269 bp)电泳结果
1.PCR Markers; 2.阳性对照，为B95-8转化细胞; 3.阴性对照，为TE缓冲液(pH8.0); 4，7，8.分别为EBV感染的胃炎、胃溃疡、胃癌标本; 5，6.为未受EBV感染的标本。
Fig.2 Agarose electrophoresis of EBV P3P4 DNA primers (EBN A1,BamHI K region)amplyfying products (269 bp)
1.PCR Markers; 2.Positive control, which was B95-8 transformed cells.; 3.Negative control, which was TE buffer (pH8.0); 4,5,8.EBV infection in gastritis,gastrohelcoma and gastric cancer, respectively; 6,7.Samples of non-EBV infection
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表2 六组标本中EBV DNA检测结果统计
Table 2 Statistics of detecting EBV DNA in six groups of samples 标本类型
Sample types
标本数
No.of tested samples
EBV(+)例数
No.of tested EBV(t)
EBV感染率
Positive rates
慢性浅表性胃炎
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Chronic surface gastritis
74
12
16.2%
胃溃疡
Gastrohelcosis
26
10
38.4%
慢性萎缩性胃炎
Chronic atrophy gastritis
11
, 百拇医药
3
27.3%
胃癌
Gastric cancer
23
11
47.8%
癌旁组织
Adjacent cancer tissue
16
7
43.8%
癌组织
, 百拇医药
Cancer tissue
16
7
43.8%
合计 Total
166
50
30.1%
EBV在CSG、胃溃疡中的感染率分别为16.2%和38.4%，与胃粘膜损伤程度成正相关。同样，癌前病变CAG中EBV感染率为27.3%，而胃癌中为43.8%～47.8%，呈渐进趋势。另外，检测发现，在癌旁组织阳性而癌组织阴性的3例，癌旁组织阴性而癌组织阳性的3例，两部位组织均为阳性的4例，均为阴性的6例。Shousha等[5]报道在11例胃癌中应用原位杂交法发现有7例癌旁组织分布EBV阳性信号，而相应的癌组织均阴性。
, 百拇医药
2.2 应用直接法原位PCR观察和分析EBV在胃组织标本中的感染情况
通过直接法原位PCR技术，我们对部分证实有EBV感染的胃组织标本进行检测发现，EBV呈弥散型分布，上皮细胞和腺体细胞均有阳性颗粒存在。部分标本中癌组织区域有淋巴细胞浸润。癌组织受染的情况较为复杂。检测结果见图3～5。
图3 ISPCR检测结果
图示上皮部分分布大量蓝紫色EBV阳性颗粒。主要存在于细胞核(↑所指)这是一个正常胃粘膜上皮，无淋巴细胞。
Fig.3 ISPCR result showed that a great of blue-EBV-positive particles were in epithelium region and roughly in nucleuses (↑shows).
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This was a normal gastric mucoma epithelium
图4 ISPCR检测结果
图示腺体部位分布大量蓝紫色EBV阳性颗粒(↑所指)，核浆中均有，无淋巴细胞。
Fig.4 ISPCR result showed a great of EBV-positive particles were in the gland region (↑shows).
Both nucleues and cytoplasms had the particles, without lymphocytes.
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图5 ISPCR检测结果
FIg.5 ISPCR result showed EBV-positive particles were in cancer tissue, and roughly in nucleuses.
There were some lymphocytes, a small part of which were infected by EBV.
2.3 p53抑癌基因突变检测 结果统计见表3。PCR-SSCP电泳结果以exon5～6为例，见图6。p53基因exon 5～8设计在三个区域上，在同一标本的检测中有两三个区域可同时发生突变。图示癌组织部位分布EBV阳性颗粒，主要存在于细胞核，有淋巴细胞浸润，少量淋巴细胞感染EBV。
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图6 PCR-SSCP检测p53基因exon 5-6电泳结果
1,3,5,6.无异常泳动的ssDNA；2.空载；4.有两条异常泳动的ssDNA为一种点突变；7.非变性的dsDNA；8.PGEM-7ZF(+)/Hae Ⅲ Markers。
Fig.6 PCR-SSCP detection of p53 gene exon 5-6
1,3,5,6.Without mutated ssDNA；2.Nothing；4.Two mutated ssDNS, which is a point mutation；7.Undenatured dsDNA；
8.PGEM-7ZF(+)/Hae Ⅲ Markers.
表3 p53基因突变检测结果统计
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Table 3 Statistics of detecting p53 gene mutation 标本类型
Sample types
EBV(+)
例数
No. of EBV(+)
p53基因突变检测结果 Results of detecting p53 gene mutation
exon 5～6
突变例数
No.of exon
5-6 mutation
, 百拇医药
exon 7
突变例数
No.of exon 7
mutation
exon 8
突变例数
No.of exon 8
mutation
p53基因
突变例数
No.of p53
gene mutation
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突变率
Muation
rates
慢性萎缩性胃炎
Chronic atrophy gastritis
11
1
2
3
3
27.3%
胃癌
Gastric cancer
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23
4
8
12
13
56.5%
癌旁组织
Adjacent cancer tissue
16
4
9
8
11
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68.8%
癌组织
Cancer tissue
16
2
5
9
9
56.3%
合计 Total
66
11 16.1%
24 36.4%
, 百拇医药
32 48.5%
36
54.5%
应用银染PCR-SSCP分析检测p53基因exon 5～8发现，CAG中p53基因突变为27.3%，胃癌中为56.3%～56.5%，这说明在胃粘膜病变CAG异型增生胃癌的演进过程中，p53基因突变是一个相对早期事件，在CAG之前可能就已发生，在CAG至胃癌演进中经历了一个积累的过程，这已在相关研究中得到证实[6]。
癌旁组织相对于癌组织p53基因突变率略高，四个外显子中7、8外显子突变率较高，分别为36.4%和48.5%。
表4和表5统计结果显示，在EBV感染的胃组织标本中，p53基因点突变率达到75%，而在未受EBV感染的胃组织标本中，p53基因点突变率为39.5%，有显著差别(P<0.03)。表4 EBV阳性标本中p53基因突变统计结果
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Table 4 Statistics of p53 gene mutation in EBV-positive samples 标本类型
Sample types
EBV(+)
例数
No.of EBV(+)
p53基因突变检测结果 Results of detecting p53 gene mutation
exon 5～6
突变例数
No.of exon
5-6 mutation
, 百拇医药
exon 7
突变例数
No.of exon 7
mutation
exon 8
突变例数
No.of exon 8
mutation
p53基因
突变例数
No.of p53
gene mutation
, 百拇医药
突变率
Mutation
rates
慢性萎缩性胃炎
Chronic atrophy gastritis
3
1
1
2
2
胃癌
Gastric cancer
, 百拇医药 11
3
5
7
8
癌旁组织
Adjacent cancer tissue
7
3
5
4
6
癌组织 Cancer tissue
, 百拇医药
7
2
4
5
5
合计 Total
28
9 32.1%
13 46.4%
17 60.7%
21
75%
表5 EBV阴性标本中p53基因突变统计结果
, 百拇医药
Table 5 Statistics of p53 gene mutartion in EBV-negative samples 标本类型
Sample types
EBV(-)
例数
No.of EBV(-)
p53基因突变检测结果 Results of detecting p53 gene mutation
exon 5～6
突变例数
No.of exon
5-6 mutation
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exon 7
突变例数
No.of exon 7
mutation
exon 8
突变例数
No.of exon 8
mutation
p53基因
突变例数
No.of p53
gene mutation
, 百拇医药
突变率
Mutation
rates
慢性萎缩性胃炎
Chronic atrophy gastritis
8
0
0
1
1
胃癌
Gastric cancer
, http://www.100md.com 12
2
5
6
5
癌旁组织
Adjacent cancer tissue
9
1
4
3
4
癌组织
, 百拇医药 Cancer tissue
9
1
4
3
4
合计 Total
38
4 10.5%
12 31.6%
14 36.9%
15
39.5%
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3 讨论
EBV与多种肿瘤的发生有关，如Burkitt's、淋巴瘤、鼻咽癌等。近年来通过检测胃癌中EBV基因组发现EBV与淋巴上皮样胃癌[7]有关，亦与普通腺癌[1]有关。对EBV感染的研究多采用原位杂交法，该法技术要求较高，敏感度低。在本实验中我们采用了文献中报道的两对引物，以B95-8转化细胞DNA为模板作预备实验，证明这两对引物敏感性高，符合率为100%。对同一标本用两对引物分别检测EBV DNA，以两者同时为阳性判断该标本为EBV DNA阳性，因此极大地降低了假阳性的出现。同时我们应用原位PCR对部分标本进行了检测。
原位PCR是九十年代以后发展起来的、将灵敏的PCR技术与原位杂交技术结合起来的一门新技术，是一种敏感度高、特异性强、能在组织细胞原位进行低拷贝核酸定位的形态学方法，它填补了形态学领域、尤其是病毒感染研究方面的空白，在病毒基因潜伏、感染及发病机理探讨的研究中发挥了重要作用。在本研究中我们采用直接法原位PCR，即在PCR反应液中，按一定比例用Bio-11-dUTP代替dTTP，在PCR反应中，Bio-11-dUTP掺入到扩增的目的片段中，然后用亲和素化的碱性磷酸酶显色系统显色观察。在实验中为增加阳性信号，采用两对引物混合扩增，结果重复性好，阳性信号强，背景清晰。同时，我们也观察了EBV在组织中的存在和分布状态，并推测了EBV可能的感染途径和致病机理。
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目前尚未见是否在胃炎、胃溃疡中存在EBV感染的报道，即使对于癌周部位正常粘膜以及异型增生中是否存在EBV的报道也不一[5，9，10]。在本研究中，我们采用新鲜的活检组织和手术标本，保证了DNA模板的完整性。应用PCR技术对EBV DNA检测发现，CSG、胃溃疡、CAG中的感染率分别16.2%、38.4%和27.3%，胃癌中为43.8%～47.8%，证明与胃粘膜损伤程度有关。因此不仅在胃炎和胃溃疡中检测到EBV DNA，而且通过原位PCR证实，EBV DNA可呈弥散型分布于粘膜组织的上皮、腺体和癌组织中。
在本研究中，通过原位PCR检测发现，上皮细胞、腺体细胞有大量阳性颗粒存在。我们对CSG、胃溃疡和CAG中EBV感染的检测结果说明，非癌变的粘层存在有EBV的感染。由于EBV在人群中感染较为普遍，特别对于许多部位的上皮细胞可以感染并在细胞中复制，资料报道血清抗体阳性或鼻咽部感染EBV的人，咽喉部位脱落细胞常有大量病毒排出[11]，因此推测在与EBV携带者的密切接触或自身口咽部受EBV感染者，EBV可通过唾液或饮食下行到胃。一方面，EBV可直接感染某些胃粘膜上皮细胞(根据图4中一正常上皮部位EBV感染推测)，另一方面，胃粘膜损伤部位易聚集淋巴细胞或者有淋巴系统经过，EBV首先感染淋巴细胞，进入淋巴系统[12]。这可能是EBV进一步感染和传播的重要步骤。
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Sixbey[13]的研究认为，VCA/sIgA可介导EBV感染人粘膜上皮细胞。EBV进入淋巴系统，其增殖过程中表达VCA、EA、EBNA等，人体免疫系统对EBV特异性地表达IgA，因此，胃粘膜上皮细胞被继发感染成为可能。目前的研究发现在淋巴上皮样胃癌或有淋巴浸润的胃癌中EBV感染率很高，癌组织中大量存在着EBV阳性颗粒，可能与这一感染机制有关。
研究表明，胃癌的发生是一个多基因变异积累的复杂过程，涉及到多种癌基因和抑癌基因的异常。研究较多的如K-ras、H-ras基因突变、CerbB-2、c-myc基因突变和缺失，met基因重排及扩增等。其中，p53基因的异常与胃粘膜细胞癌变过程密切相关，点突变是其主要形式，在相对保守的第5～8外显子上发生较为频繁，占80%以上，这些突变使p53核心区域结构发生改变，影响与DNA片段的结合，也可能影响了p53的磷酸化，使p53失去正常的转录活化功能，呈负显性作用，具有潜在的致癌性。
在本研究中发现，p53基因的癌前病变CAG中突变率为27.3%，胃癌中突变率为56.3%～56.5%。因此，p53抑癌基因突变在胃癌发生的早期(CAG)即可出现，而且呈渐进积累和发展的趋势。目前较一致的观点认为p53基因突变是胃癌发生中一个重要的分子生物学指标。
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本研究对p53基因exon 5～8突变检测，发现胃癌中突变主要集中在exon 7、exon 8处，而exon 5～6处相对较低，突变率分别为36.4%(24/66)、50%(33/66)和16.7%(11/66)。有报道认为多集中在exon 5和exon 7处，也有报道胃癌中p53基因突变不存在突变热区[14]。
我们对EBV感染的CAG、胃癌、癌旁组织以及相应的癌组织中p53基因突变进行统计，突变率达75%(21/28)，若排除癌前病变CAG，突变率也达到76%(19/25)，EBV阴性的组织标本中p53突变率为39.5%(15/38)，若排除癌前病变CAG，突变率为46.7%(14/30)。而GAG-GC过程中p53总突变率(无论EBV感染与否)仅有54.5%(36/66)，若排除癌前病变CAG也仅有60%。这说明，EBV感染可能促进了p53基因的突变和积累，EBV感染与p53基因突变之间存在着很高的相关性。
原位PCR检测结果发现，EBV主要存在于细胞核中，有整合到细胞染色体上的可能，在细胞基因组正常的转录和蛋白翻译过程中，EBV的某些抗原成分得到表达，对宿主细胞有恶性转化作用，如LMP、EBNAs影响宿主细胞的生长调节，抑制宿主细胞的终末分化；LMP主要作用于p53抑癌基因和bcl-2基因，对p53基因的调控位点有掩蔽作用；EBNA2、EBNA5可中和wtp53蛋白的功能。肿瘤细胞的生长优势使这些抗原成分得以大量表达并在癌发区域得到积累，使周围细胞被转化的可能性不断加大。另外，整合到染色体上的EBV基因组，也可能导致染色体的易位、畸型或某些基因的突变，推测p53基因可能是EBV感染期间较易受损的基因之一。
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参考文献
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单位：赵军理 糜克永 中国科学院武汉病毒所，武汉 430071；龙焱华 方向明 武汉第三医院，武汉 430060
关键词：EB病毒；p53基因；聚合酶链反应；PCR-SSCP分析；胃粘膜损伤
中国病毒学990402 摘 要 为了探讨EB病毒(EBV)感染与胃癌发生的关系，应用PCR技术对166例胃粘膜损伤标本的EBV DNA进行检测，其中66例应用银染PCR-SSCP分析技术检测了p53 exon5～8突变情况，10例应用直接法原位PCR技术检测了EBV在组织中的感染情况。结果166例标本中EBV感染率为30.1%；EBV在细胞中感染大体呈弥散型，主要存在于细胞核。66例标本中p53基因突变率为54.5%。对比分析，EBV阳性标本中p53基因突变率为75%(21/28)，EBV阴性标本中p53基因突变率为39.5%(15/38)。结果表明，EBV对胃粘膜组织细胞具有易感性，p53基因突变在胃粘膜病变中是一个常发事件，EBV感染与p53基因突变之间存在着高度相关性，对癌症的发生具有重要作用。
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EB Virus Infection and Mutation of p53 Suppressor Gene
in Gastric Mucoma Damages
Zhao Junli Mi Keyong
(Wuhan Institute of Virology, Academia Sinica, Wuhan 430071)
Long Yanhua Fang Xiangming
(The Third Hospital of Wuhan, Wuhan 430060)
Abstract To investigate the relationship between EBV infection and genesis of gastric cancer, PCR, PCR-SSCP assay and direct in situ PCR technique were performed on samples of gastric mucoma damages; EBV infection rate was 30.1% in 166 samples; EBV was scattered in tissues and roughly in nucleuses. p53 gene mutation rate was 54.5% in 66 samples. In contrast, p53 gene mutation rate was 75% in EBV-positive samples (21/28), but 39.5% in EBV-negative ones (15/38). The results suggest that EBV is infectious for gastric mucoma cells, p53 gene mutation is common in gastric mucoma pathological changes, EBV infection has high correlation with p53 mutation, and is of importance during the genesis of cancer.
, 百拇医药
Key words EB virus, p53 gene, Polymerase chain reaction, PCR-SSCP assay, Gastric mucoma damage
EB病毒是一种DNA肿瘤病毒，感染十分普遍，与低分化鼻咽癌及多种淋巴瘤关系密切。近年来通过检测胃癌组织细胞中EBV基因组发现EBV感染与胃癌的发生有关[1]。然而目前的研究尚不足以明确揭示这种关系。
胃癌的发生是一个多因素、多阶段、多基因异常积累的结果。研究发现，p53抑癌基因异常在胃癌发生的早期即可出现，且呈渐进发展的趋势，是胃癌发生中一个重要的分子指标。因此，我们对胃粘膜损伤中EBV感染与p53基因突变进行检测，以探讨EBV在胃癌发生中可能的作用机制，为胃癌的病因和预防提供理论依据。
1 材料与方法
, http://www.100md.com 1.1 标本及来源 慢性浅表性胃炎(CSG)74例，为胃镜下钳取活检组织；病理证实的新鲜手术标本中，胃溃疡26例，慢性萎缩性胃炎(CAG)11例；39例胃癌中腺癌21例；淋巴上皮样癌6例，恶性淋巴瘤3例，鳞癌7例，残胃癌2例。其中16例胃癌分成癌旁组织和癌组织。男性101例，女性49例，平均年龄41.9岁。以上标本均来自于武汉第三医院、同济医院、湖北省肿瘤医院。
1.2 引物选择及PCR条件 见表1。
表1 EBV和p53基因引物序列、扩增产物长度及PCR退火温度
Table 1 Primesrs sequences, products length and PCR annealing temprature of EBV and p53 gene 引物
Primers
, 百拇医药
位置
Position
序列
Sequence
片段大小(bp)
Length(bp)
退火温度
Annealing
temp.(℃)
EBV引物
EBV
primer
, 百拇医药
gp220
(BamHI L region)
5′-GGCTGGTGTCACCGGTGTTA-3′
5′-CCTTAGGAGGAACAAGTCCC-3′
239
55
EBNAI
(BamHI K region)
5′-GTACTCATCACCGGGTCTC-3′
5′-TTCGGGTTGGAACCTCCTTG-3′
, 百拇医药
269
55
p53引物
p53
primer
Exon5-6
5′-TTCCTCTTCCTGCAGTACT-3′
5′-AGTTGCAAACCAGACCTCAG-3′
408
63
Exon7
5′-TGTTGTCTCCTAGGTTGGCT-3′
, 百拇医药
5′-CAAGTGGCTCCTGACCTGGA-3′
140
56
Exon8
5′-TCCTTATCCTGAGTAGTGGT-3′
5′-TCGCTTAGTGCTCCCTGTGG-3′
155
56
EBV DNA引物参照文献[2]，p53基因三组引物根据文献[3]报道序列设计，均由上海生工公司合成。
1.3 主要试剂 Taq DNA聚合酶、4×dNTPs购自洛阳华美生物工程公司。Bio-11-dUTP及碱性磷酸酯酶显色系统(AV-AP，BCIP/NBT)、APES、原位扩增载玻片；扩增盖帽及封口膜均购自德国Boehringer Mannhein公司。其它试剂多用分析纯。
, 百拇医药
1.4 主要仪器 9801-D型基因扩增仪购自西安交通大学开元(集团)电子设备公司，原位基因扩增仪购自英国Techne公司，中压垂直电泳槽购自北京六一仪器厂。
1.5 主要方法及结果判定
1.5.1 核酸提取 取米粒大小的胃镜钳取活检组织或新鲜手术标本1～2块，在1.5 mL eppendorf管中用足量生理盐水漂洗3次后，用洁净的手术剪刀充分剪碎。加入100～200 μL裂解液(10 mmol/L Tris-HCl，pH7.6, 1% SDS，300 μg/mL蛋白酶K)，60 ℃孵育至组织块溶解变清(约需3～8 h)，按常规的酚/氯仿方法抽提蛋白，乙醇沉淀核酸，漂洗，晾干。50 μL TE缓冲液(pH8.0)溶解，取5 μL作模板。EBV阳性对照为B 95-8转化细胞，由本所病毒室王汉中老师提供。
1.5.2 PCR 在30 μL PCR反应液中，含1×PCR buffer，1.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L 4×dNTPs, 1 u Taq DNA聚合酶，上下游引物各为0.5 μmol/L，上覆30 μL灭菌液体石蜡。扩增程序为94 ℃预变性5 min，然后94 ℃ 50 s，退火(55、56或63 ℃)50 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环，最后72 ℃再延伸3 min。
, 百拇医药
1.5.3 EBV检测结果判断 15 μL PCR扩增物在2%琼脂糖凝胶上电泳，60 V 30 min，溴化乙锭染色，透射紫外仪上观察结果，与阳性对照处于同一位置的为阳性，否则为阴性，阴性对照无扩增带。
1.5.4 银染PCR-SSCP及结果判断 参照Orita[4]方法稍作改进。取15 μL p53扩增物与10 μL上样液(95%甲酰胺，20 mmol/L EDTA Na2，0.03%二甲苯青)混合，沸水浴10 min，立即置于冰浴10 min，8%聚丙烯酰胺(双体∶单体=39∶1，含10%的甘油)，1×TBE，室温，150 V电泳5 h，取下凝胶于10%乙醇溶液中固定10 min，0.2%硝酸银染15 min，5%硝酸溶液脱色10 min，蒸馏水漂洗三次，0.4%甲醛-15%氢氧化钠溶液中显色至单链带清晰，倾去显色液，蒸馏水漂洗，3%冰乙酸定影，照相。未发生突变的DNA除了未变性完全及部分恢复的dsDNA外，还有两条ssDNA，发生突变的DNA则多出异常泳动的ssDNA。
, 百拇医药
1.5.5 原位PCR操作及结果观察 参照苏慧慈编著的《原位PCR》，自行设计方案。
1.5.5.1 组织切片预处理按常规病理学方法，先二甲苯脱蜡，梯度乙醇去二甲苯入水，0.2 mol/L HCl酸化，PBS漂洗，然后20 μg/mL蛋白酶K 37 ℃消化10～15 min，最后用4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗。
1.5.5.2 原位PCR在组织切片上贴上原位扩增帽，注入80～100 μL PCR反应液(1×PCR buffer，2 mmol/L MgCl2，300 μmol/L dATP、dCTP、dGTP,225 μmol/L dTTP，75 μmol/L Bio-11-dUTP，1 u Taq DNA聚合酶/10 μL PCR反应液，EBV DNA引物P1P2和P3P4均为1 μmol/L)，封口膜封口。在原位块上，设置94 ℃预变性10 min，然后94 ℃变性60 s，55 ℃退火75 s，72 ℃延伸90 s，最后72 ℃再延伸10 min。揭去原位帽，PBS漂洗5次，每次5 min。
, 百拇医药
1.5.5.3 显色 以链霉亲和素-碱性磷酸酷酶(AV-AP)亲和扩增片段，TBS漂洗，再以BCIP/NBT显色20～40 min，核固红复染，中性树胶封片，显微镜下观察，照相。
1.5.5.4 以低分化鼻咽癌标本并经PCR检测核酸为EBV DNA阳性的切片作阳性对照，阴性对照为经PCR检测核酸为EBV DNA阴性的胃粘膜组织切片及无Taq DNA聚合酶或无引物的三种体系。
2 结果
2.1 EBV DNA检出率 见表2，PCR扩增产物电泳结果见图1和2。
图1 EBV P1P2 DNA引物(gp220, BamHI L region)扩增产物(239 bp)电泳结果
, 百拇医药
1.PCR Markers；2.阳性对照，为B95-8转化细胞；3.阴性对照，为TE缓冲液(pH8.0)；4，5，8.分别为EBV感染的胃炎、胃溃疡、胃癌标本；6，7.为未受EBV感染的标本。
Fig.1 Agarose electrophoresis of EBV P1P2 DNA primers (gp220, BamHI L region) amplyfying products (269 bp)
1.PCR Markers;2.Positive control, which was B95-8 transformed cells.; 3.Negative control, which was TE buffer (pH8.0); 4,5,8.EBV infection in gastritis,gastrohelcoma and gastric cancer, respectively; 6,7.Samples of non-EBV infection.
, 百拇医药
图2 EBV P3P4 DNA引物(EBN A1,BamHI K region)扩增产物(269 bp)电泳结果
1.PCR Markers; 2.阳性对照，为B95-8转化细胞; 3.阴性对照，为TE缓冲液(pH8.0); 4，7，8.分别为EBV感染的胃炎、胃溃疡、胃癌标本; 5，6.为未受EBV感染的标本。
Fig.2 Agarose electrophoresis of EBV P3P4 DNA primers (EBN A1,BamHI K region)amplyfying products (269 bp)
1.PCR Markers; 2.Positive control, which was B95-8 transformed cells.; 3.Negative control, which was TE buffer (pH8.0); 4,5,8.EBV infection in gastritis,gastrohelcoma and gastric cancer, respectively; 6,7.Samples of non-EBV infection
, http://www.100md.com
表2 六组标本中EBV DNA检测结果统计
Table 2 Statistics of detecting EBV DNA in six groups of samples 标本类型
Sample types
标本数
No.of tested samples
EBV(+)例数
No.of tested EBV(t)
EBV感染率
Positive rates
慢性浅表性胃炎
, http://www.100md.com
Chronic surface gastritis
74
12
16.2%
胃溃疡
Gastrohelcosis
26
10
38.4%
慢性萎缩性胃炎
Chronic atrophy gastritis
11
, 百拇医药
3
27.3%
胃癌
Gastric cancer
23
11
47.8%
癌旁组织
Adjacent cancer tissue
16
7
43.8%
癌组织
, 百拇医药
Cancer tissue
16
7
43.8%
合计 Total
166
50
30.1%
EBV在CSG、胃溃疡中的感染率分别为16.2%和38.4%，与胃粘膜损伤程度成正相关。同样，癌前病变CAG中EBV感染率为27.3%，而胃癌中为43.8%～47.8%，呈渐进趋势。另外，检测发现，在癌旁组织阳性而癌组织阴性的3例，癌旁组织阴性而癌组织阳性的3例，两部位组织均为阳性的4例，均为阴性的6例。Shousha等[5]报道在11例胃癌中应用原位杂交法发现有7例癌旁组织分布EBV阳性信号，而相应的癌组织均阴性。
, 百拇医药
2.2 应用直接法原位PCR观察和分析EBV在胃组织标本中的感染情况
通过直接法原位PCR技术，我们对部分证实有EBV感染的胃组织标本进行检测发现，EBV呈弥散型分布，上皮细胞和腺体细胞均有阳性颗粒存在。部分标本中癌组织区域有淋巴细胞浸润。癌组织受染的情况较为复杂。检测结果见图3～5。
图3 ISPCR检测结果
图示上皮部分分布大量蓝紫色EBV阳性颗粒。主要存在于细胞核(↑所指)这是一个正常胃粘膜上皮，无淋巴细胞。
Fig.3 ISPCR result showed that a great of blue-EBV-positive particles were in epithelium region and roughly in nucleuses (↑shows).
, 百拇医药
This was a normal gastric mucoma epithelium
图4 ISPCR检测结果
图示腺体部位分布大量蓝紫色EBV阳性颗粒(↑所指)，核浆中均有，无淋巴细胞。
Fig.4 ISPCR result showed a great of EBV-positive particles were in the gland region (↑shows).
Both nucleues and cytoplasms had the particles, without lymphocytes.
, 百拇医药
图5 ISPCR检测结果
FIg.5 ISPCR result showed EBV-positive particles were in cancer tissue, and roughly in nucleuses.
There were some lymphocytes, a small part of which were infected by EBV.
2.3 p53抑癌基因突变检测 结果统计见表3。PCR-SSCP电泳结果以exon5～6为例，见图6。p53基因exon 5～8设计在三个区域上，在同一标本的检测中有两三个区域可同时发生突变。图示癌组织部位分布EBV阳性颗粒，主要存在于细胞核，有淋巴细胞浸润，少量淋巴细胞感染EBV。
, 百拇医药
图6 PCR-SSCP检测p53基因exon 5-6电泳结果
1,3,5,6.无异常泳动的ssDNA；2.空载；4.有两条异常泳动的ssDNA为一种点突变；7.非变性的dsDNA；8.PGEM-7ZF(+)/Hae Ⅲ Markers。
Fig.6 PCR-SSCP detection of p53 gene exon 5-6
1,3,5,6.Without mutated ssDNA；2.Nothing；4.Two mutated ssDNS, which is a point mutation；7.Undenatured dsDNA；
8.PGEM-7ZF(+)/Hae Ⅲ Markers.
表3 p53基因突变检测结果统计
, 百拇医药
Table 3 Statistics of detecting p53 gene mutation 标本类型
Sample types
EBV(+)
例数
No. of EBV(+)
p53基因突变检测结果 Results of detecting p53 gene mutation
exon 5～6
突变例数
No.of exon
5-6 mutation
, 百拇医药
exon 7
突变例数
No.of exon 7
mutation
exon 8
突变例数
No.of exon 8
mutation
p53基因
突变例数
No.of p53
gene mutation
, http://www.100md.com
突变率
Muation
rates
慢性萎缩性胃炎
Chronic atrophy gastritis
11
1
2
3
3
27.3%
胃癌
Gastric cancer
, http://www.100md.com
23
4
8
12
13
56.5%
癌旁组织
Adjacent cancer tissue
16
4
9
8
11
, http://www.100md.com
68.8%
癌组织
Cancer tissue
16
2
5
9
9
56.3%
合计 Total
66
11 16.1%
24 36.4%
, 百拇医药
32 48.5%
36
54.5%
应用银染PCR-SSCP分析检测p53基因exon 5～8发现，CAG中p53基因突变为27.3%，胃癌中为56.3%～56.5%，这说明在胃粘膜病变CAG异型增生胃癌的演进过程中，p53基因突变是一个相对早期事件，在CAG之前可能就已发生，在CAG至胃癌演进中经历了一个积累的过程，这已在相关研究中得到证实[6]。
癌旁组织相对于癌组织p53基因突变率略高，四个外显子中7、8外显子突变率较高，分别为36.4%和48.5%。
表4和表5统计结果显示，在EBV感染的胃组织标本中，p53基因点突变率达到75%，而在未受EBV感染的胃组织标本中，p53基因点突变率为39.5%，有显著差别(P<0.03)。表4 EBV阳性标本中p53基因突变统计结果
, http://www.100md.com
Table 4 Statistics of p53 gene mutation in EBV-positive samples 标本类型
Sample types
EBV(+)
例数
No.of EBV(+)
p53基因突变检测结果 Results of detecting p53 gene mutation
exon 5～6
突变例数
No.of exon
5-6 mutation
, 百拇医药
exon 7
突变例数
No.of exon 7
mutation
exon 8
突变例数
No.of exon 8
mutation
p53基因
突变例数
No.of p53
gene mutation
, 百拇医药
突变率
Mutation
rates
慢性萎缩性胃炎
Chronic atrophy gastritis
3
1
1
2
2
胃癌
Gastric cancer
, 百拇医药 11
3
5
7
8
癌旁组织
Adjacent cancer tissue
7
3
5
4
6
癌组织 Cancer tissue
, 百拇医药
7
2
4
5
5
合计 Total
28
9 32.1%
13 46.4%
17 60.7%
21
75%
表5 EBV阴性标本中p53基因突变统计结果
, 百拇医药
Table 5 Statistics of p53 gene mutartion in EBV-negative samples 标本类型
Sample types
EBV(-)
例数
No.of EBV(-)
p53基因突变检测结果 Results of detecting p53 gene mutation
exon 5～6
突变例数
No.of exon
5-6 mutation
, http://www.100md.com
exon 7
突变例数
No.of exon 7
mutation
exon 8
突变例数
No.of exon 8
mutation
p53基因
突变例数
No.of p53
gene mutation
, 百拇医药
突变率
Mutation
rates
慢性萎缩性胃炎
Chronic atrophy gastritis
8
0
0
1
1
胃癌
Gastric cancer
, http://www.100md.com 12
2
5
6
5
癌旁组织
Adjacent cancer tissue
9
1
4
3
4
癌组织
, 百拇医药 Cancer tissue
9
1
4
3
4
合计 Total
38
4 10.5%
12 31.6%
14 36.9%
15
39.5%
, 百拇医药
3 讨论
EBV与多种肿瘤的发生有关，如Burkitt's、淋巴瘤、鼻咽癌等。近年来通过检测胃癌中EBV基因组发现EBV与淋巴上皮样胃癌[7]有关，亦与普通腺癌[1]有关。对EBV感染的研究多采用原位杂交法，该法技术要求较高，敏感度低。在本实验中我们采用了文献中报道的两对引物，以B95-8转化细胞DNA为模板作预备实验，证明这两对引物敏感性高，符合率为100%。对同一标本用两对引物分别检测EBV DNA，以两者同时为阳性判断该标本为EBV DNA阳性，因此极大地降低了假阳性的出现。同时我们应用原位PCR对部分标本进行了检测。
原位PCR是九十年代以后发展起来的、将灵敏的PCR技术与原位杂交技术结合起来的一门新技术，是一种敏感度高、特异性强、能在组织细胞原位进行低拷贝核酸定位的形态学方法，它填补了形态学领域、尤其是病毒感染研究方面的空白，在病毒基因潜伏、感染及发病机理探讨的研究中发挥了重要作用。在本研究中我们采用直接法原位PCR，即在PCR反应液中，按一定比例用Bio-11-dUTP代替dTTP，在PCR反应中，Bio-11-dUTP掺入到扩增的目的片段中，然后用亲和素化的碱性磷酸酶显色系统显色观察。在实验中为增加阳性信号，采用两对引物混合扩增，结果重复性好，阳性信号强，背景清晰。同时，我们也观察了EBV在组织中的存在和分布状态，并推测了EBV可能的感染途径和致病机理。
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目前尚未见是否在胃炎、胃溃疡中存在EBV感染的报道，即使对于癌周部位正常粘膜以及异型增生中是否存在EBV的报道也不一[5，9，10]。在本研究中，我们采用新鲜的活检组织和手术标本，保证了DNA模板的完整性。应用PCR技术对EBV DNA检测发现，CSG、胃溃疡、CAG中的感染率分别16.2%、38.4%和27.3%，胃癌中为43.8%～47.8%，证明与胃粘膜损伤程度有关。因此不仅在胃炎和胃溃疡中检测到EBV DNA，而且通过原位PCR证实，EBV DNA可呈弥散型分布于粘膜组织的上皮、腺体和癌组织中。
在本研究中，通过原位PCR检测发现，上皮细胞、腺体细胞有大量阳性颗粒存在。我们对CSG、胃溃疡和CAG中EBV感染的检测结果说明，非癌变的粘层存在有EBV的感染。由于EBV在人群中感染较为普遍，特别对于许多部位的上皮细胞可以感染并在细胞中复制，资料报道血清抗体阳性或鼻咽部感染EBV的人，咽喉部位脱落细胞常有大量病毒排出[11]，因此推测在与EBV携带者的密切接触或自身口咽部受EBV感染者，EBV可通过唾液或饮食下行到胃。一方面，EBV可直接感染某些胃粘膜上皮细胞(根据图4中一正常上皮部位EBV感染推测)，另一方面，胃粘膜损伤部位易聚集淋巴细胞或者有淋巴系统经过，EBV首先感染淋巴细胞，进入淋巴系统[12]。这可能是EBV进一步感染和传播的重要步骤。
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Sixbey[13]的研究认为，VCA/sIgA可介导EBV感染人粘膜上皮细胞。EBV进入淋巴系统，其增殖过程中表达VCA、EA、EBNA等，人体免疫系统对EBV特异性地表达IgA，因此，胃粘膜上皮细胞被继发感染成为可能。目前的研究发现在淋巴上皮样胃癌或有淋巴浸润的胃癌中EBV感染率很高，癌组织中大量存在着EBV阳性颗粒，可能与这一感染机制有关。
研究表明，胃癌的发生是一个多基因变异积累的复杂过程，涉及到多种癌基因和抑癌基因的异常。研究较多的如K-ras、H-ras基因突变、CerbB-2、c-myc基因突变和缺失，met基因重排及扩增等。其中，p53基因的异常与胃粘膜细胞癌变过程密切相关，点突变是其主要形式，在相对保守的第5～8外显子上发生较为频繁，占80%以上，这些突变使p53核心区域结构发生改变，影响与DNA片段的结合，也可能影响了p53的磷酸化，使p53失去正常的转录活化功能，呈负显性作用，具有潜在的致癌性。
在本研究中发现，p53基因的癌前病变CAG中突变率为27.3%，胃癌中突变率为56.3%～56.5%。因此，p53抑癌基因突变在胃癌发生的早期(CAG)即可出现，而且呈渐进积累和发展的趋势。目前较一致的观点认为p53基因突变是胃癌发生中一个重要的分子生物学指标。
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本研究对p53基因exon 5～8突变检测，发现胃癌中突变主要集中在exon 7、exon 8处，而exon 5～6处相对较低，突变率分别为36.4%(24/66)、50%(33/66)和16.7%(11/66)。有报道认为多集中在exon 5和exon 7处，也有报道胃癌中p53基因突变不存在突变热区[14]。
我们对EBV感染的CAG、胃癌、癌旁组织以及相应的癌组织中p53基因突变进行统计，突变率达75%(21/28)，若排除癌前病变CAG，突变率也达到76%(19/25)，EBV阴性的组织标本中p53突变率为39.5%(15/38)，若排除癌前病变CAG，突变率为46.7%(14/30)。而GAG-GC过程中p53总突变率(无论EBV感染与否)仅有54.5%(36/66)，若排除癌前病变CAG也仅有60%。这说明，EBV感染可能促进了p53基因的突变和积累，EBV感染与p53基因突变之间存在着很高的相关性。
原位PCR检测结果发现，EBV主要存在于细胞核中，有整合到细胞染色体上的可能，在细胞基因组正常的转录和蛋白翻译过程中，EBV的某些抗原成分得到表达，对宿主细胞有恶性转化作用，如LMP、EBNAs影响宿主细胞的生长调节，抑制宿主细胞的终末分化；LMP主要作用于p53抑癌基因和bcl-2基因，对p53基因的调控位点有掩蔽作用；EBNA2、EBNA5可中和wtp53蛋白的功能。肿瘤细胞的生长优势使这些抗原成分得以大量表达并在癌发区域得到积累，使周围细胞被转化的可能性不断加大。另外，整合到染色体上的EBV基因组，也可能导致染色体的易位、畸型或某些基因的突变，推测p53基因可能是EBV感染期间较易受损的基因之一。
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