恶性肿瘤基因治疗与放射治疗
作者：祝淑钗 万钧 周道安
单位：050011 石家庄，河北医科大学第四医院放射治疗科
关键词：
中华放射肿瘤学杂志990428 恶性肿瘤的发生是细胞内原癌基因活化和抑癌基因的异常表达，即“基因病变”(geneticesions)所致，当这种“病变”积累到一定程度，正常的体细胞即可突变为肿瘤细胞。肿瘤的基因治疗正是依此研究结果而设计的一种治疗方案，即将外源性DNA片段稳定地插入到靶细胞基因组中，使其在肿瘤部位表达高浓度的产物或在体外相关细胞内组后再导入体细胞中表达，从而抑制肿瘤恶性表型，控制肿瘤细胞生长和繁殖。现就目前肿瘤基因治疗的策略、实施方案及其与放射治疗的结合方式综述如下。
1 肿瘤基因治疗策略
肿瘤基因治疗主要集中在3个方面：基因突变的补救、分子化疗和基因免疫调节。
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1.1 基因突变的补救：补救目的是修正“基因病变”以达到恶性肿瘤细胞凋亡或向正常细胞转化，可通过抑制活化的癌基因、增强抑癌基因的表达或阻断肿瘤生长因子的异常分泌来实现。
(1)抑制活化癌基因的方法有：反义核酸、定向RNA核酸酶和单链抗体。①反义核酸的优点是直接抑制癌基因的表达，用反义核酸序列(反义RNA或DNA)特异地与互补的癌基因DNA和RNA结合，从而阻断癌基因转录或翻译。反义核酸序列的设计是针对恶性肿瘤细胞中突变的p53基因、H-Ras基因、cyclin D1基因或其它过度表达的基因。Skotzko等[1]报道用反转录病毒载体介导的反义cyclinD1表达载体转染人骨肉瘤细胞系MG-63，细胞增殖受抑制，被转染的细胞发生凋亡，提示细胞周期与细胞凋亡密切相关。反义核酸只能封闭一个转录或翻译产物，不能重复使用，所以不能完全阻断异常基因表达从而不能达到肿瘤生长的长期抑制。②定向RNA核酸酶结构中有一个反义RNA区域和一个RNA裂解酶区域，前者是特异性地与目的基因转录的mRNA结合，后者可将该RNA裂解。当一个mRNA被裂解后定向RNA核酸就可以游离出来与另外一个信使RNA分子结合并将其裂解，因此该技术使反义核酸抑制恶性肿瘤的效率明显提高。另一种抑制活化癌基因的手段是细胞内单链基因抗体的应用，Richardson等[2]报道白细胞介素-2(IL-2)受体α亚单位基因的单链抗体可以显著地降低人类恶性巴瘤细胞表面的受体数量，肿瘤细胞的恶性表型也受到抑制。
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(2)增强抑癌基因的表达：抑癌基因突变、失活也是肿瘤发生的原因之一。将正常抑癌基因导入肿瘤细胞中补偿或替代缺失的抑癌基因，以抑制肿瘤生长或逆转其表型，即所谓的基因替代疗法。p53基因突变是癌变时一系列基因突变中的关键步骤。1990年Baker等[3]首先将野生型及突变型p53基因导入p53基因突变和无p53mRNA表达的人大肠癌细胞，发现野生型p53基因转染的细胞形成的克隆数比突变型p53基因转染者少5～10倍。Runnebaum等[4]用反转录病毒载体把野生型p53基因转染入p53基因突变的人乳腺癌细胞，肿瘤生长明显受抑制。人类恶性胶质瘤中，p16基因突变发生率在50%左右，Fueyo等[5]用重组腺病毒载体将外源性p16基因导入恶性胶质瘤细胞系U87MG，U251MG和D54MG，肿瘤细胞分裂增殖受抑制，并滞留于G0和G1期。
1.2 分子化疗：分子化疗是药物化疗的改进形式，其目的是增强药物杀伤肿瘤细胞的导向性。基本原理是选择性地使恶性肿瘤细胞表达某种外源基因，通过外源基因的表达产物诱导肿瘤细胞的凋亡。这种外源基因称为自杀基因，其表达产物通常是一种酶，可以使无细胞毒作用或低细胞毒性药物前体(prodrug)转变成有细胞毒性或具强细胞毒作用的抗肿瘤药物后再杀伤肿瘤细胞，故又称为前药转换基因。常见基因表达产物有细胞色素酶P4502b1、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、胞嘧啶脱氨酶(CD)[6-8]。CD基因源于大肠杆菌，能使氟胞嘧啶通过脱氨基作用转换成氟尿嘧啶，后者可以抑制细胞合成而使细胞死亡；主要用于肝癌、大肠癌和胃癌细胞。
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自杀基因前药转换作用除直接作用于肿瘤细胞外，再加其强效“旁观者”效应，因而被认为是肿瘤基因治疗领域中最有希望获得突破的研究课题之一。
1.3 基因免疫调节：其目的是增强体内免疫系统对恶性肿瘤的识别和杀伤作用，有两种方式：(1)直接方式：增加或增强肿瘤细胞内某种基因表达，使肿瘤相关抗原、粘附分子、组织相容性复合物分子(histocompatibility complex molecules)及细胞因子等表达水平提高，使机体免疫系统识别肿瘤的能力增强；(2)间接方式：激活机体的免疫潜能细胞，使它们识别和杀伤肿瘤细胞的能力提高。与肿瘤基因免疫调节关系比较密切的是干扰素家族和白细胞介素家族，现认为，经IL-2基因转染修饰的肿瘤细胞所诱导的抗肿瘤免疫反应主要是通过CD3+CD8的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)所介导[9]。
2 肿瘤基因治疗的具体实施方案
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包括两个关键问题：目的基因持续稳定地表达和基因靶向转移和表达。
2.1 目的基因持续稳定地表达：各种治疗基因的转移方法概括起来有两种：病毒方法和非病毒方法。病毒方法又分为RNA病毒载体法和DNA病毒载体法。RNA病毒载体法即反转录病毒载体法的优缺点：(1)反转录病毒载体转导基因是目前最为成熟的基因转移方法，它具有整合信号，可以持续稳定地表达，且优先感染分裂细胞，较适合于肿瘤的基因治疗；在体内重组产生野生型病毒的机会也很少，安全性较大，但也有非常棘手难题，即病毒滴度低，转染效率低。(2)腺病毒载体的病毒滴度高，转染效率可达100%，插入的外源基因片段长，这优于反转录病毒载体；但其进入细胞内不整合，不能持续稳定地表达，且免疫原性高，有一定治疗风险。(3)腺病毒相关载体可使所携带基因定点整合，且转染效率高，但其宿主范围窄，应用受限。非病毒方法包括：磷酸钙共沉淀法，电穿孔法，显微注射法及微粒子轰击法。脂质体包裹转染是目前应用较多的方法，它是将DNA包裹在脂质体膜内与细胞膜融合，细胞通过内吞作用来实现基因转移；此法转染效率高，能在活体内应用。
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2.2 基因靶向转移和表达：将治疗基因特异性地转移到肿瘤组织或在肿瘤细胞中特异地表达，从而使抗肿瘤作用主要集中在肿瘤原发或转移灶内，不仅避免了对正常组织影响，而且相对增加了转染效率，即靶向基因治疗。
3 基因与放射治疗结合应用
已有实验表明放射诱导启动子基因产生的蛋白质具有细胞毒性并增加了放射敏感性，促进了分子化疗和放射治疗的结合；通过对DNA损伤基因、单链转导基因、细胞周期控制基因的修饰，可提高放射敏感性和放射治疗效果；基因转染介导的放射免疫疗法对癌症治疗作用是通过诱导肿瘤细胞增加表达细胞表面抗原或受体水平，增加放射标记抗体和肽类物质的结合靶，从而增加治疗效果[10]。总之，基因治疗与放射治疗结合通过四种方式改变了放射治疗的效果：(1)外源基因转染诱导放射敏感性，从而增加射线对肿瘤细胞的杀伤作用；(2)基因诱导放射防护，降低正常组织放射损伤；(3)外源基因转染的肿瘤细胞发生细胞周期阻滞，出现瘤细胞同步化，增加放射治疗杀伤作用；(4)重金属粒子包裹外源基因，通过基因枪或粒子轰击法进行基因治疗。
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3.1 增加放射敏感性：1997年Pederson等[11]报道用含CD基因的重组腺病毒载体(AdCMVCD)转染人胆管癌细胞及肿瘤局部注射携带CD基因的腺病毒载体，并用5-Fc和60Co单次照射作用于肿瘤细胞，使离体培养的细胞系克隆形成能力明显受抑制，与单纯照射组比较有明显差异。用基因克隆检测分析法发现放射治疗后给予AdCMVCD转染和5-Fu处理的人胆管癌细胞系的细胞毒性明显增加，其放射生物学参数为α＝0.44，D0＝0.96。将AdCMVCD，5-Fc和放射治疗结合用于动物在体肿瘤，与未给予放射治疗组比较，动物生存期、肿瘤再生长时间和肿瘤倍增时间都显著地延长(P＝0.030，0.015，0.002)，并且观察到肿瘤体积明显缩小，疗终肿瘤与最初肿瘤体积比也明显变小，残留肿瘤也较对照组明显缩小(P＝0.02，0.03，0.03)，它提示对难治性胆管癌采用AdCMVCD转染肿瘤细胞，结合应用5-Fc和放射治疗可使细胞杀伤增加0.7倍，成为有前途的治疗方法之一。
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Schackert等[12]认为将野生型p53肿瘤抑癌基因导入缺乏正常p53蛋白的肿瘤细胞内，不仅使其恶性表型逆转，而且通过常规放射治疗和化疗，诱发了DNA损伤的凋亡反应，增加了放射治疗和化疗敏感性，该结果已用于临床试验中。Sanchez等[13]用含有13S和12S的E1A区域的载体转染鼠和人类的几种细胞系，结果发现细胞系表达E1A者对顺铂和放射的敏感性增加4～10倍，也就是表达E1A的癌细胞经过顺铂或放射线照射后，其生存能力明显降低，生长明显受抑。1997年Mauceri等[14]将携带放射诱导DNA序列E1启动子连接到编码放射敏感细胞因子的cDNA上(如肿瘤坏死因子)，增加了放射有效性。在肿瘤微环境缺氧特异情况下，基因表达也是靶向性的，缺氧肿瘤组织具有放射抗拒性。然而，对肿瘤讲，严重缺氧也是肿瘤的一种生理状况，构成肿瘤治疗时可被利用的靶。离体实验和动物实验表明具有氧调节作用的磷酸甘油激酶基因在肿瘤组织中表达调节着氧合状态，从而增加放射敏感性和肿瘤杀伤性[15]。
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3.2 降低正常组织损伤：野生型p53活性丧失被认为是一个主要的预示放射治疗、化疗反应的因子。理论认为p53通过提高凋亡的发生而增加放射治疗化疗的敏感性。实验结果表明野生型p53基因导入肿瘤细胞通常诱导生长阻滞，这些转染细胞可能对放射治疗、化疗更抗拒，同时观察到p53在正常组织细胞即非肿瘤性细胞中，其功能丧失是增加而非降低敏感性[16]。因此将野生型p53基因导入肿瘤周围正常组织，既增加了放射治疗的抗拒性，又减少了正常组织的放射损伤。基于以上结果，在对人类癌症进行放射治疗、化疗相关的p53基因治疗之前，应进行详细的在体和离体实验研究。
腺病毒载体介导转染人类凝血酶蛋白cDNA基因，维持了血小板在放射诱导的骨髓抑制中水平，保证放射治疗顺利进行。用多药耐药(MDR)基因导入人骨髓细胞，使骨髓细胞能耐受多种化疗药物抑制作用，从而可加大化疗药物剂量，使放射治疗、化疗的结合得以顺利进行，实验表明MDR1基因可使骨髓对化疗的耐受性增加10倍。
, http://www.100md.com 1998年Greenberger等[17]报道新发现的抑癌基因即锰过氧化物岐化酶基因(MnSOD)转导后能避免放射诱导的正常组织损伤。Yoshio等[18]实验结果表明，MnSOD基因的导入对细胞放射敏感性没有明显改变，而显著地降低了其体内致瘤性，导致体内抗肿瘤效应的显著增加和常规空气状态下放射治疗增益的获得。
3.3 肿瘤细胞的细胞周期阻滞和同步化：1998年Badie等[19]报道，用重组腺病毒载体携带野生型p53基因(AdWp53)转染小鼠胶质肉瘤细胞系，24小时内凋亡发生，并出现G1期阻滞，而单纯X线照射后的肉瘤细胞仅有少量的G1期阻滞，且未见凋亡发生。将AdWp53注射到动物肿瘤内并给予60Co单次照射，可见肿瘤缩小0.85倍，生存期也较单纯照射组有明显延长，提示p53基因治疗和放射治疗结合有可能改善脑瘤预后。Zhou等[20]和Schrump等[21]报道利用反义cyclinD1封闭内源性靶基因表达，从而阻滞细胞周期进程，有效地抑制离体培养的食管癌及肺癌细胞的生长。许雅等[22]报道反义cyclinD1载体转染人胰腺癌细胞，下调了细胞周期调控中起重要作用的cyclinD1的表达，结果转染细胞系恶性表型部分逆转，细胞生长速度、DNA合成、细胞增殖和代谢指数均明显下降。
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3.4 生物“导弹”和粒子轰击基因治疗：新的生物“导弹”转染技术(生物“导弹”系统)如微粒子注射、基因枪、粒子轰击技术，其基本原理是DNA或其它生物物质包裹钨或金粒子轰击被转染细胞，在细胞核上打孔，将微粒子携带的基因射入靶细胞核内或动物体内[23]。用这种基因转染技术可以对小鼠进行疫苗接种，有两种方法可以使由保护性单克隆抗体识别的该基因蛋白直接进入小鼠皮肤或肌肉内：(1)用手持形式的生物“导弹”系统即可将包裹金粒子的2μg DNA通过微注射直接至小鼠皮肤上；(2)用传统的肌肉注射法将100μg DNA直接注入鼠股四头肌。这两种释放系统都诱导产生体液免疫和细胞免疫，用这种基因枪进行的基因治疗省时、省力且较经济，可作为普通基因疗法用于临床。
Nicolet等[24]报道的加速粒子介导的基因转染技术，是释放该基因编码的单链IL-2抗体合成蛋白，被鼠肿瘤的相关抗原TAG-IL-2识别，并能够有效地结合到TAG-IL-2阳性细胞上，刺激IL-2效应细胞发挥免疫杀伤作用。此基因转染体内肿瘤细胞24小时后，肿瘤原发部位蛋白水平明显提高，并且血清中的水平也相应提高，提示该基因释放技术有可能对远隔部位的转移瘤发挥治疗作用。
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有关基因治疗的研究，目前主要处于实验研究阶段，已经开始的临床试验也观察到一些苗头，非常令人鼓舞，但是要开展普遍应用，尚有许多具体的技术问题和社会问题，对此我们应有清醒的认识。
参考文献
1 Skotzko M,Wu L,Anderson F,et al. Retroviral vector-mediated gene transfer of antisense cyclin G1(CYCG) inhibits proliferation of human osteogenic sarcoma cells. Cancer Res, 1995,55(23):5493-5498.
2 Richardson JH, Sodroski JG, Waldman TA, et al. Phenotypic knockout of the high-affinity human interleukin 2 receptor by intracellular single-chain antibodies against the alpha subunit of the receptor . Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92(8):3137-3141.
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3 Baker SJ, Markowitz S, Fearon E,et al. Suppression of human colorectal carcinoma cell growth by wild-type p53. Science, 1990,249(4971):912-915.
4 Runnebaum IB, Kreienberg R. p53 trans-dominantly suppresses tumor formation of human breast cancer cells mediated by retroviral bulk infection without marker gene selection: an expeditious in vitro protocol with implications towards gene therapy. Hybridoma, 1995,14(2):153-157.
5 Fueyo J, Gomez MC, Yung WK, et al. Adenovirus-mediated p16/CDKN2 gene transfer induces growth arrest and modifies the transformed phenotype of glioma cells. Oncogene, 1996,12(1):103-110.
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10 Buchsbaum DJ, Raben D, Stackhouse MA,et al. Approaches to enhance cancer radiotherapy employing gene transfer methods. Gene Ther, 1996, 3(12):1042-1068.
11 Pederson LC, Buchsbaum DJ, Vickers SM,et al. Molecular chemotherapy combined with radiation therapy enhances killing of cholangiocarcinoma cells in vitro and in vivo. Cancer Res, 1997,57(19):4325-4332.
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17 Greenberger JS, Bahri S, Jett J, et al. Considerations in optimizing radiation therapy for non-small cell lung cancer. Chest, 1998,113 Suppl 1:46-52.
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19 Badie B, Kramar MH, Lar R,et al. Adenovirus-mediated p53 gene delivery potentiates the radiation-induced growth inhibition of experimental brain tumors. J Neurooncol, 1998,37(3):217-222.
20 Zhou P, Jiang W, Zhang YJ, et al. Antisense to cyclin D1 inhibits growth and reverses the transformed phenotype of human esophageal cancer cells. Oncogene, 1995,11(3):571-580.
21 Schrump DS, Chen A, Consoli U. Inhibition of lung cancer proliferation by antisense cyclin D. Cancer Gene Ther, 1996,3(2):119-135.
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22 许雅，刘彤华，高洁.表达反义细胞周期蛋白cyclin D1载体对胰细胞生长和凋亡的影响.中华病理学杂志，1998，27(5)：348-351.
23 Lai WC,Bennett M, Johnston SA, et al. Protection against mycoplasma pulmonis infection by genetic vaccination. DAN Cell Biol,1995,14(7):643-651.
24 Nicolet CM, Burkholder JK, Gan J, et al. Delivery of an antibody-IL2 fusion protein gene utilizing Accel particle mediated gene delivery (Meeting abstract). Proc Annu Meet Am Soc Clin Oncol,1995,14(2):584.
收稿：1999-01-20 修回：1999-03-10, 百拇医药
单位：050011 石家庄，河北医科大学第四医院放射治疗科
关键词：
中华放射肿瘤学杂志990428 恶性肿瘤的发生是细胞内原癌基因活化和抑癌基因的异常表达，即“基因病变”(geneticesions)所致，当这种“病变”积累到一定程度，正常的体细胞即可突变为肿瘤细胞。肿瘤的基因治疗正是依此研究结果而设计的一种治疗方案，即将外源性DNA片段稳定地插入到靶细胞基因组中，使其在肿瘤部位表达高浓度的产物或在体外相关细胞内组后再导入体细胞中表达，从而抑制肿瘤恶性表型，控制肿瘤细胞生长和繁殖。现就目前肿瘤基因治疗的策略、实施方案及其与放射治疗的结合方式综述如下。
1 肿瘤基因治疗策略
肿瘤基因治疗主要集中在3个方面：基因突变的补救、分子化疗和基因免疫调节。
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1.1 基因突变的补救：补救目的是修正“基因病变”以达到恶性肿瘤细胞凋亡或向正常细胞转化，可通过抑制活化的癌基因、增强抑癌基因的表达或阻断肿瘤生长因子的异常分泌来实现。
(1)抑制活化癌基因的方法有：反义核酸、定向RNA核酸酶和单链抗体。①反义核酸的优点是直接抑制癌基因的表达，用反义核酸序列(反义RNA或DNA)特异地与互补的癌基因DNA和RNA结合，从而阻断癌基因转录或翻译。反义核酸序列的设计是针对恶性肿瘤细胞中突变的p53基因、H-Ras基因、cyclin D1基因或其它过度表达的基因。Skotzko等[1]报道用反转录病毒载体介导的反义cyclinD1表达载体转染人骨肉瘤细胞系MG-63，细胞增殖受抑制，被转染的细胞发生凋亡，提示细胞周期与细胞凋亡密切相关。反义核酸只能封闭一个转录或翻译产物，不能重复使用，所以不能完全阻断异常基因表达从而不能达到肿瘤生长的长期抑制。②定向RNA核酸酶结构中有一个反义RNA区域和一个RNA裂解酶区域，前者是特异性地与目的基因转录的mRNA结合，后者可将该RNA裂解。当一个mRNA被裂解后定向RNA核酸就可以游离出来与另外一个信使RNA分子结合并将其裂解，因此该技术使反义核酸抑制恶性肿瘤的效率明显提高。另一种抑制活化癌基因的手段是细胞内单链基因抗体的应用，Richardson等[2]报道白细胞介素-2(IL-2)受体α亚单位基因的单链抗体可以显著地降低人类恶性巴瘤细胞表面的受体数量，肿瘤细胞的恶性表型也受到抑制。
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(2)增强抑癌基因的表达：抑癌基因突变、失活也是肿瘤发生的原因之一。将正常抑癌基因导入肿瘤细胞中补偿或替代缺失的抑癌基因，以抑制肿瘤生长或逆转其表型，即所谓的基因替代疗法。p53基因突变是癌变时一系列基因突变中的关键步骤。1990年Baker等[3]首先将野生型及突变型p53基因导入p53基因突变和无p53mRNA表达的人大肠癌细胞，发现野生型p53基因转染的细胞形成的克隆数比突变型p53基因转染者少5～10倍。Runnebaum等[4]用反转录病毒载体把野生型p53基因转染入p53基因突变的人乳腺癌细胞，肿瘤生长明显受抑制。人类恶性胶质瘤中，p16基因突变发生率在50%左右，Fueyo等[5]用重组腺病毒载体将外源性p16基因导入恶性胶质瘤细胞系U87MG，U251MG和D54MG，肿瘤细胞分裂增殖受抑制，并滞留于G0和G1期。
1.2 分子化疗：分子化疗是药物化疗的改进形式，其目的是增强药物杀伤肿瘤细胞的导向性。基本原理是选择性地使恶性肿瘤细胞表达某种外源基因，通过外源基因的表达产物诱导肿瘤细胞的凋亡。这种外源基因称为自杀基因，其表达产物通常是一种酶，可以使无细胞毒作用或低细胞毒性药物前体(prodrug)转变成有细胞毒性或具强细胞毒作用的抗肿瘤药物后再杀伤肿瘤细胞，故又称为前药转换基因。常见基因表达产物有细胞色素酶P4502b1、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、胞嘧啶脱氨酶(CD)[6-8]。CD基因源于大肠杆菌，能使氟胞嘧啶通过脱氨基作用转换成氟尿嘧啶，后者可以抑制细胞合成而使细胞死亡；主要用于肝癌、大肠癌和胃癌细胞。
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自杀基因前药转换作用除直接作用于肿瘤细胞外，再加其强效“旁观者”效应，因而被认为是肿瘤基因治疗领域中最有希望获得突破的研究课题之一。
1.3 基因免疫调节：其目的是增强体内免疫系统对恶性肿瘤的识别和杀伤作用，有两种方式：(1)直接方式：增加或增强肿瘤细胞内某种基因表达，使肿瘤相关抗原、粘附分子、组织相容性复合物分子(histocompatibility complex molecules)及细胞因子等表达水平提高，使机体免疫系统识别肿瘤的能力增强；(2)间接方式：激活机体的免疫潜能细胞，使它们识别和杀伤肿瘤细胞的能力提高。与肿瘤基因免疫调节关系比较密切的是干扰素家族和白细胞介素家族，现认为，经IL-2基因转染修饰的肿瘤细胞所诱导的抗肿瘤免疫反应主要是通过CD3+CD8的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)所介导[9]。
2 肿瘤基因治疗的具体实施方案
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包括两个关键问题：目的基因持续稳定地表达和基因靶向转移和表达。
2.1 目的基因持续稳定地表达：各种治疗基因的转移方法概括起来有两种：病毒方法和非病毒方法。病毒方法又分为RNA病毒载体法和DNA病毒载体法。RNA病毒载体法即反转录病毒载体法的优缺点：(1)反转录病毒载体转导基因是目前最为成熟的基因转移方法，它具有整合信号，可以持续稳定地表达，且优先感染分裂细胞，较适合于肿瘤的基因治疗；在体内重组产生野生型病毒的机会也很少，安全性较大，但也有非常棘手难题，即病毒滴度低，转染效率低。(2)腺病毒载体的病毒滴度高，转染效率可达100%，插入的外源基因片段长，这优于反转录病毒载体；但其进入细胞内不整合，不能持续稳定地表达，且免疫原性高，有一定治疗风险。(3)腺病毒相关载体可使所携带基因定点整合，且转染效率高，但其宿主范围窄，应用受限。非病毒方法包括：磷酸钙共沉淀法，电穿孔法，显微注射法及微粒子轰击法。脂质体包裹转染是目前应用较多的方法，它是将DNA包裹在脂质体膜内与细胞膜融合，细胞通过内吞作用来实现基因转移；此法转染效率高，能在活体内应用。
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2.2 基因靶向转移和表达：将治疗基因特异性地转移到肿瘤组织或在肿瘤细胞中特异地表达，从而使抗肿瘤作用主要集中在肿瘤原发或转移灶内，不仅避免了对正常组织影响，而且相对增加了转染效率，即靶向基因治疗。
3 基因与放射治疗结合应用
已有实验表明放射诱导启动子基因产生的蛋白质具有细胞毒性并增加了放射敏感性，促进了分子化疗和放射治疗的结合；通过对DNA损伤基因、单链转导基因、细胞周期控制基因的修饰，可提高放射敏感性和放射治疗效果；基因转染介导的放射免疫疗法对癌症治疗作用是通过诱导肿瘤细胞增加表达细胞表面抗原或受体水平，增加放射标记抗体和肽类物质的结合靶，从而增加治疗效果[10]。总之，基因治疗与放射治疗结合通过四种方式改变了放射治疗的效果：(1)外源基因转染诱导放射敏感性，从而增加射线对肿瘤细胞的杀伤作用；(2)基因诱导放射防护，降低正常组织放射损伤；(3)外源基因转染的肿瘤细胞发生细胞周期阻滞，出现瘤细胞同步化，增加放射治疗杀伤作用；(4)重金属粒子包裹外源基因，通过基因枪或粒子轰击法进行基因治疗。
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3.1 增加放射敏感性：1997年Pederson等[11]报道用含CD基因的重组腺病毒载体(AdCMVCD)转染人胆管癌细胞及肿瘤局部注射携带CD基因的腺病毒载体，并用5-Fc和60Co单次照射作用于肿瘤细胞，使离体培养的细胞系克隆形成能力明显受抑制，与单纯照射组比较有明显差异。用基因克隆检测分析法发现放射治疗后给予AdCMVCD转染和5-Fu处理的人胆管癌细胞系的细胞毒性明显增加，其放射生物学参数为α＝0.44，D0＝0.96。将AdCMVCD，5-Fc和放射治疗结合用于动物在体肿瘤，与未给予放射治疗组比较，动物生存期、肿瘤再生长时间和肿瘤倍增时间都显著地延长(P＝0.030，0.015，0.002)，并且观察到肿瘤体积明显缩小，疗终肿瘤与最初肿瘤体积比也明显变小，残留肿瘤也较对照组明显缩小(P＝0.02，0.03，0.03)，它提示对难治性胆管癌采用AdCMVCD转染肿瘤细胞，结合应用5-Fc和放射治疗可使细胞杀伤增加0.7倍，成为有前途的治疗方法之一。
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Schackert等[12]认为将野生型p53肿瘤抑癌基因导入缺乏正常p53蛋白的肿瘤细胞内，不仅使其恶性表型逆转，而且通过常规放射治疗和化疗，诱发了DNA损伤的凋亡反应，增加了放射治疗和化疗敏感性，该结果已用于临床试验中。Sanchez等[13]用含有13S和12S的E1A区域的载体转染鼠和人类的几种细胞系，结果发现细胞系表达E1A者对顺铂和放射的敏感性增加4～10倍，也就是表达E1A的癌细胞经过顺铂或放射线照射后，其生存能力明显降低，生长明显受抑。1997年Mauceri等[14]将携带放射诱导DNA序列E1启动子连接到编码放射敏感细胞因子的cDNA上(如肿瘤坏死因子)，增加了放射有效性。在肿瘤微环境缺氧特异情况下，基因表达也是靶向性的，缺氧肿瘤组织具有放射抗拒性。然而，对肿瘤讲，严重缺氧也是肿瘤的一种生理状况，构成肿瘤治疗时可被利用的靶。离体实验和动物实验表明具有氧调节作用的磷酸甘油激酶基因在肿瘤组织中表达调节着氧合状态，从而增加放射敏感性和肿瘤杀伤性[15]。
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3.2 降低正常组织损伤：野生型p53活性丧失被认为是一个主要的预示放射治疗、化疗反应的因子。理论认为p53通过提高凋亡的发生而增加放射治疗化疗的敏感性。实验结果表明野生型p53基因导入肿瘤细胞通常诱导生长阻滞，这些转染细胞可能对放射治疗、化疗更抗拒，同时观察到p53在正常组织细胞即非肿瘤性细胞中，其功能丧失是增加而非降低敏感性[16]。因此将野生型p53基因导入肿瘤周围正常组织，既增加了放射治疗的抗拒性，又减少了正常组织的放射损伤。基于以上结果，在对人类癌症进行放射治疗、化疗相关的p53基因治疗之前，应进行详细的在体和离体实验研究。
腺病毒载体介导转染人类凝血酶蛋白cDNA基因，维持了血小板在放射诱导的骨髓抑制中水平，保证放射治疗顺利进行。用多药耐药(MDR)基因导入人骨髓细胞，使骨髓细胞能耐受多种化疗药物抑制作用，从而可加大化疗药物剂量，使放射治疗、化疗的结合得以顺利进行，实验表明MDR1基因可使骨髓对化疗的耐受性增加10倍。
, http://www.100md.com 1998年Greenberger等[17]报道新发现的抑癌基因即锰过氧化物岐化酶基因(MnSOD)转导后能避免放射诱导的正常组织损伤。Yoshio等[18]实验结果表明，MnSOD基因的导入对细胞放射敏感性没有明显改变，而显著地降低了其体内致瘤性，导致体内抗肿瘤效应的显著增加和常规空气状态下放射治疗增益的获得。
3.3 肿瘤细胞的细胞周期阻滞和同步化：1998年Badie等[19]报道，用重组腺病毒载体携带野生型p53基因(AdWp53)转染小鼠胶质肉瘤细胞系，24小时内凋亡发生，并出现G1期阻滞，而单纯X线照射后的肉瘤细胞仅有少量的G1期阻滞，且未见凋亡发生。将AdWp53注射到动物肿瘤内并给予60Co单次照射，可见肿瘤缩小0.85倍，生存期也较单纯照射组有明显延长，提示p53基因治疗和放射治疗结合有可能改善脑瘤预后。Zhou等[20]和Schrump等[21]报道利用反义cyclinD1封闭内源性靶基因表达，从而阻滞细胞周期进程，有效地抑制离体培养的食管癌及肺癌细胞的生长。许雅等[22]报道反义cyclinD1载体转染人胰腺癌细胞，下调了细胞周期调控中起重要作用的cyclinD1的表达，结果转染细胞系恶性表型部分逆转，细胞生长速度、DNA合成、细胞增殖和代谢指数均明显下降。
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3.4 生物“导弹”和粒子轰击基因治疗：新的生物“导弹”转染技术(生物“导弹”系统)如微粒子注射、基因枪、粒子轰击技术，其基本原理是DNA或其它生物物质包裹钨或金粒子轰击被转染细胞，在细胞核上打孔，将微粒子携带的基因射入靶细胞核内或动物体内[23]。用这种基因转染技术可以对小鼠进行疫苗接种，有两种方法可以使由保护性单克隆抗体识别的该基因蛋白直接进入小鼠皮肤或肌肉内：(1)用手持形式的生物“导弹”系统即可将包裹金粒子的2μg DNA通过微注射直接至小鼠皮肤上；(2)用传统的肌肉注射法将100μg DNA直接注入鼠股四头肌。这两种释放系统都诱导产生体液免疫和细胞免疫，用这种基因枪进行的基因治疗省时、省力且较经济，可作为普通基因疗法用于临床。
Nicolet等[24]报道的加速粒子介导的基因转染技术，是释放该基因编码的单链IL-2抗体合成蛋白，被鼠肿瘤的相关抗原TAG-IL-2识别，并能够有效地结合到TAG-IL-2阳性细胞上，刺激IL-2效应细胞发挥免疫杀伤作用。此基因转染体内肿瘤细胞24小时后，肿瘤原发部位蛋白水平明显提高，并且血清中的水平也相应提高，提示该基因释放技术有可能对远隔部位的转移瘤发挥治疗作用。
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有关基因治疗的研究，目前主要处于实验研究阶段，已经开始的临床试验也观察到一些苗头，非常令人鼓舞，但是要开展普遍应用，尚有许多具体的技术问题和社会问题，对此我们应有清醒的认识。
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收稿：1999-01-20 修回：1999-03-10, 百拇医药