HBV变异株与野毒株特异免疫应答的差异
作者：王延军 王晓燕 玄恩余 曲春枫 郭少愚 李在连
单位：王延军、王晓燕、曲春枫、李在连 261042 山东省潍坊医学院免疫室；玄恩余 维坊市人民医院；郭少愚 东营市胜利油田中心医院；第一作者现在山东省立医院；
关键词：
中华传染病杂志990415
乙型肝炎病毒HBeAg阴性变异株的出现及演变涉及病毒突变和选择条件两个方面[1]，目前造成HBV突变的免疫因素尚未阐明。抗-HBe特异免疫应答主要由分泌不同细胞因子的CD4+T辅助细胞(TH)亚群调节[2，3]，为分析不同亚群在HBV突变中的作用，对不同乙型肝炎(乙肝)患者的TH1、TH2亚群进行了研究，现报告如下。
材料与方法
, http://www.100md.com
一、病例来源
为山东省潍坊市人民医院和东营市胜利油田中心医院1995年9月至1996年6月间住院或门诊随访的乙肝患者，年龄20～60岁;其中HBeAg阳性、抗-HBe阴性患者13例，HBeAg阴性、抗-HBe阳性患者60例。
二、HBeAg阴性变异株的检测
采用斑点杂交，方法详见文献[4]。聚合酶链反应(PCR)引物序列为：P24：5′-CCTAAGCTTGACATAG-CTGACTACTAATTC-3′，P32：5′-CA-GGAATTCTGTAGGACTAAATTGG-TCTGTTC-3′。探针分别为：野毒株序列M0(1887-1908)：5′-TGGGTGGCTTTGGGGCATGGAC-3′；常见的HBeAg阴性变异株序列M1(1888-1908)：5′-GGGTGGCTTTAGGGCAT-GGAC-3′及M2(1887～1908)：5′-TGGGTGGCTTTAGGACATGGAC-3′。
, http://www.100md.com
三、抗-HBe效价的测定
采用ELISA法深圳月亮湾生物工程有限公司试剂盒(批号9607006)，按说明书操作。
四、淋巴细胞因子的诱生及检测
参照Lohn等[2]法，抽取外周血，分离PBMC，调节细胞浓度至5×106/ml,加0.1mg/ml PHA及5%人AB型血清，37℃培养，分别于24(测IL-4)、32(IL-2)、48(IFN-γ)和72(IL-6)小时收集上清。用Genzyme公司ELISA试剂盒检测。
五、统计学处理
资料统计采用四格表χ2检验，t检测，秩和检验。
结果
, http://www.100md.com
一、突变株的检出情况
13例HBeAg阳性乙肝患者中，血清HBV DNA阳性12例；60例抗-HBe阳性患者中，HBV DNA阳性11例；HBeAg阳性组野毒株感染率为91.7%(11/12)，HBeAg变异株感染率为0，混合感染率为8%(1/12)；抗-HBe阳性组野毒株感染率为0，HBeAg阴性变异株感染率为45.5%(5/11)，混合感染率为27.3%(3/11)；经四格表χ2检验，HBeAg阴性变异株感染率在抗-HBe阳性组显著高于HBeAg阳性组(χ2=9.304，P<0.01)。
二、血清抗-HBe效价测定结果
见表1。
表1 乙肝患者血清抗-HBe效价的比较(
s) 组别
, 百拇医药
例数
滴度
平均滴度
原液
50
100
200
400
800
1 600
3 200
突变组
9
, 百拇医药
2
3
2
2
635.33±2.87
PCR(-)
17
4
2
5
3
3
77.45±3.78
, 百拇医药
注：经两均数的t检验，突变组显著高于PCR(-)组(t=379.51,P<0.01)
三、淋巴细胞因子IL-2，IFN-γ、IL-4及IL-6检测结果
见表2。
表2 不同组PBMC培养上清中TH1、TH2型细胞因子含量的比较() 组别
例数
IFN-γ(pg/ml)
IL-2(pg/ml)
IL-4(pg/ml)
, http://www.100md.com
IL-6(ng/ml)
Con
5
173.8±225.6
106.3±55.4
<6
3.73±0.04
M0
5
783.4±673.0
140.9±74.0
<6
, 百拇医药
3.69±0.56
M1/M2
5
471.1±586.5
111.5±27.9
<6
3.78±0.12
PCR(-)
5
797.9±289.1
126.2±49.3
<6
, 百拇医药
4.10±0.40
注：Con：曾用HBsAg疫苗免疫的健康人；M0：HBeAg阳性的野毒株感染者；M1/M2：HBeAg阳性变异株感染者。经非参数的秩和检验，TH1、TH2型细胞因子在各感染组之间均差异无显著性(P>0.05)
讨论
HBeAg阴性变异株的出现及演变，涉及病毒的突变及选择条件两个方面。血清中的抗-HBe可特异性结合感染肝细胞表面的HBeAg，并介导宿主免疫细胞杀伤、清除HBV感染的肝细胞[1，2]，本研究对26例HBeAg阴性变异株感染者，及已清除病毒(HBV DNA阴性)的2组病例进行抗-HBe效价滴定后，发现抗-HBe不仅与病毒清除有关，而且在机体选择HBeAg阴性变异株的过程中也起一定作用，变异株感染者的抗-HBe效价显著高于HBV DNA阴性组(P<0.01)，提示高效价的抗体作为对野毒株的一种免疫压力，可促使野毒株向变异株转化，并使后者成为体内主导毒株。
, http://www.100md.com
抗-HBV特异免疫应答及其效应机制主要由TH亚群调节，近年来研究发现TH亚群在参与和调节免疫应答过程中显示出多样性与不均一性，依据TH细胞分泌细胞因子的不同将其分为TH1、TH2亚群，TH1亚群分泌IL-2、IFN-γ及TNF-β，主要参与细胞免疫应答；TH2细胞则分泌IL-4、IL-5、IL-6等，促进体液免疫应答；机体有效清除入侵微生物的能力取决于其诱导产生的特异性TH1或TH2应答类型。本研究，TH1、TH2型细胞因子在各感染组之间差异均无显著性(P>0.05)，表明在我们所选的病例中，HBV野毒株与无变异株间未检测到明显TH1/TH2偏离现象。
HBV复制过程中，极易产生突变，为逃避机体的免疫清除，HBV处于不断调整的动态过程中，而本实验未能获得连续数年同一患者的系列标本，故不能对TH1、TH2型细胞因子调变与HBV突变的关系做动态研究；且例数有限，所测结果离散度较大，难能从一点窥及全貌，HBeAg阴性变异株的出现是否与TH1、TH2应答偏离有关尚须进一步研究。
, 百拇医药
(本课题承蒙上海医科大学医学分子病毒学重点实验室闻玉梅教授提供寡核苷酸和指导，特此致谢)
本课题受山东省教委基金资助
参考文献
1 Schilicht HJ,Brunn AV,Theilmann L,et al.Antibodies in anti-HBe-positive patient sera bind to an HBe protein expressed on the cell surface of human hepatoma cell:implication for virus clearance.Hepatology,1991,13:57-69.
2 Lohn HF,Weber W,Schlaak J,et al.Proliferative Response of CD4+ T cells and hepatitis B virus clearance in chronic hepatitis with or without hepatitis B e-minus hepatitis B virus mutants.Hepatology,1995,22:61-68.
, 百拇医药
3 Marinos G,Torre F,Cholshi S,et al.Induction of T helper cell response to hepatitis B core antigen in chronic hepatitis B virus:A major factor in activation of the host immune response to HBV.Hepatology.1996，22：1040-1049.
4 屠红，熊思东，兰林，等.快速检测乙型肝炎病毒前核心区基因变异方法的建立与初步应用.上海医科大学学报，1995，22：161-163.
(收稿：1999-02-26 修回：1999-09-28), http://www.100md.com
单位：王延军、王晓燕、曲春枫、李在连 261042 山东省潍坊医学院免疫室；玄恩余 维坊市人民医院；郭少愚 东营市胜利油田中心医院；第一作者现在山东省立医院；
关键词：
中华传染病杂志990415
乙型肝炎病毒HBeAg阴性变异株的出现及演变涉及病毒突变和选择条件两个方面[1]，目前造成HBV突变的免疫因素尚未阐明。抗-HBe特异免疫应答主要由分泌不同细胞因子的CD4+T辅助细胞(TH)亚群调节[2，3]，为分析不同亚群在HBV突变中的作用，对不同乙型肝炎(乙肝)患者的TH1、TH2亚群进行了研究，现报告如下。
材料与方法
, http://www.100md.com
一、病例来源
为山东省潍坊市人民医院和东营市胜利油田中心医院1995年9月至1996年6月间住院或门诊随访的乙肝患者，年龄20～60岁;其中HBeAg阳性、抗-HBe阴性患者13例，HBeAg阴性、抗-HBe阳性患者60例。
二、HBeAg阴性变异株的检测
采用斑点杂交，方法详见文献[4]。聚合酶链反应(PCR)引物序列为：P24：5′-CCTAAGCTTGACATAG-CTGACTACTAATTC-3′，P32：5′-CA-GGAATTCTGTAGGACTAAATTGG-TCTGTTC-3′。探针分别为：野毒株序列M0(1887-1908)：5′-TGGGTGGCTTTGGGGCATGGAC-3′；常见的HBeAg阴性变异株序列M1(1888-1908)：5′-GGGTGGCTTTAGGGCAT-GGAC-3′及M2(1887～1908)：5′-TGGGTGGCTTTAGGACATGGAC-3′。
, http://www.100md.com
三、抗-HBe效价的测定
采用ELISA法深圳月亮湾生物工程有限公司试剂盒(批号9607006)，按说明书操作。
四、淋巴细胞因子的诱生及检测
参照Lohn等[2]法，抽取外周血，分离PBMC，调节细胞浓度至5×106/ml,加0.1mg/ml PHA及5%人AB型血清，37℃培养，分别于24(测IL-4)、32(IL-2)、48(IFN-γ)和72(IL-6)小时收集上清。用Genzyme公司ELISA试剂盒检测。
五、统计学处理
资料统计采用四格表χ2检验，t检测，秩和检验。
结果
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一、突变株的检出情况
13例HBeAg阳性乙肝患者中，血清HBV DNA阳性12例；60例抗-HBe阳性患者中，HBV DNA阳性11例；HBeAg阳性组野毒株感染率为91.7%(11/12)，HBeAg变异株感染率为0，混合感染率为8%(1/12)；抗-HBe阳性组野毒株感染率为0，HBeAg阴性变异株感染率为45.5%(5/11)，混合感染率为27.3%(3/11)；经四格表χ2检验，HBeAg阴性变异株感染率在抗-HBe阳性组显著高于HBeAg阳性组(χ2=9.304，P<0.01)。
二、血清抗-HBe效价测定结果
见表1。
表1 乙肝患者血清抗-HBe效价的比较(
s) 组别, 百拇医药
例数
滴度
平均滴度
原液
50
100
200
400
800
1 600
3 200
突变组
9
, 百拇医药
2
3
2
2
635.33±2.87
PCR(-)
17
4
2
5
3
3
77.45±3.78
, 百拇医药
注：经两均数的t检验，突变组显著高于PCR(-)组(t=379.51,P<0.01)
三、淋巴细胞因子IL-2，IFN-γ、IL-4及IL-6检测结果
见表2。
表2 不同组PBMC培养上清中TH1、TH2型细胞因子含量的比较(
) 组别例数
IFN-γ(pg/ml)
IL-2(pg/ml)
IL-4(pg/ml)
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IL-6(ng/ml)
Con
5
173.8±225.6
106.3±55.4
<6
3.73±0.04
M0
5
783.4±673.0
140.9±74.0
<6
, 百拇医药
3.69±0.56
M1/M2
5
471.1±586.5
111.5±27.9
<6
3.78±0.12
PCR(-)
5
797.9±289.1
126.2±49.3
<6
, 百拇医药
4.10±0.40
注：Con：曾用HBsAg疫苗免疫的健康人；M0：HBeAg阳性的野毒株感染者；M1/M2：HBeAg阳性变异株感染者。经非参数的秩和检验，TH1、TH2型细胞因子在各感染组之间均差异无显著性(P>0.05)
讨论
HBeAg阴性变异株的出现及演变，涉及病毒的突变及选择条件两个方面。血清中的抗-HBe可特异性结合感染肝细胞表面的HBeAg，并介导宿主免疫细胞杀伤、清除HBV感染的肝细胞[1，2]，本研究对26例HBeAg阴性变异株感染者，及已清除病毒(HBV DNA阴性)的2组病例进行抗-HBe效价滴定后，发现抗-HBe不仅与病毒清除有关，而且在机体选择HBeAg阴性变异株的过程中也起一定作用，变异株感染者的抗-HBe效价显著高于HBV DNA阴性组(P<0.01)，提示高效价的抗体作为对野毒株的一种免疫压力，可促使野毒株向变异株转化，并使后者成为体内主导毒株。
, http://www.100md.com
抗-HBV特异免疫应答及其效应机制主要由TH亚群调节，近年来研究发现TH亚群在参与和调节免疫应答过程中显示出多样性与不均一性，依据TH细胞分泌细胞因子的不同将其分为TH1、TH2亚群，TH1亚群分泌IL-2、IFN-γ及TNF-β，主要参与细胞免疫应答；TH2细胞则分泌IL-4、IL-5、IL-6等，促进体液免疫应答；机体有效清除入侵微生物的能力取决于其诱导产生的特异性TH1或TH2应答类型。本研究，TH1、TH2型细胞因子在各感染组之间差异均无显著性(P>0.05)，表明在我们所选的病例中，HBV野毒株与无变异株间未检测到明显TH1/TH2偏离现象。
HBV复制过程中，极易产生突变，为逃避机体的免疫清除，HBV处于不断调整的动态过程中，而本实验未能获得连续数年同一患者的系列标本，故不能对TH1、TH2型细胞因子调变与HBV突变的关系做动态研究；且例数有限，所测结果离散度较大，难能从一点窥及全貌，HBeAg阴性变异株的出现是否与TH1、TH2应答偏离有关尚须进一步研究。
, 百拇医药
(本课题承蒙上海医科大学医学分子病毒学重点实验室闻玉梅教授提供寡核苷酸和指导，特此致谢)
本课题受山东省教委基金资助
参考文献
1 Schilicht HJ,Brunn AV,Theilmann L,et al.Antibodies in anti-HBe-positive patient sera bind to an HBe protein expressed on the cell surface of human hepatoma cell:implication for virus clearance.Hepatology,1991,13:57-69.
2 Lohn HF,Weber W,Schlaak J,et al.Proliferative Response of CD4+ T cells and hepatitis B virus clearance in chronic hepatitis with or without hepatitis B e-minus hepatitis B virus mutants.Hepatology,1995,22:61-68.
, 百拇医药
3 Marinos G,Torre F,Cholshi S,et al.Induction of T helper cell response to hepatitis B core antigen in chronic hepatitis B virus:A major factor in activation of the host immune response to HBV.Hepatology.1996，22：1040-1049.
4 屠红，熊思东，兰林，等.快速检测乙型肝炎病毒前核心区基因变异方法的建立与初步应用.上海医科大学学报，1995，22：161-163.
(收稿：1999-02-26 修回：1999-09-28), http://www.100md.com