多聚酶链反应诊断生殖支原体感染的研究
作者：常哲 吴移谋 余敏君 肖建华 张艳
单位：421001 湖南省衡阳医学院
关键词：
中华传染病杂志990413
生殖支原体(Mg)与急、慢性非淋菌性尿道炎(NGU)、慢性前列腺炎、宫颈炎或盆腔炎、不育症等疾病[1]有关。Mg的生长极其缓慢，初代生长时间长，需要的营养成分复杂，从临床标本中分离培养Mg难度大，阳性率很低。血清学诊断因与肺炎支原体(Mp)有交叉反应而特异性差。为评价聚合酶链反应(PCR)方法检测Mg的可靠性，了解Mg在衡阳地区高危人群中的感染状况，我们在MgPa基因上选择了3对不同的引物，用PCR方法对泌尿生殖道感染患者的标本进行了Mg检测，现将结果报告如下。
材料和方法
, 百拇医药
一、标准菌株
生殖支原体(Mg,G-37)、肺炎支原体(Mp)、解脲支原体4型(Uu4)、人型支原体(Mh)、唾液支原体、口腔支原体、螺原体(CR，CH-1)、大肠杆菌、绿脓杆菌、枯草杆菌(以上均为我室保存国际标准菌种)，淋球菌(NG系临床分离株)，沙眼衣原体(CT)L2标准血清型(模板DNA由加拿大易亚军博士惠赠)。
二、标本采集
收集1996年12月～1997年10月衡阳市各医院性病门诊拟诊为非淋菌性尿道炎、阴道炎、宫颈炎、慢性前列腺炎等泌尿生殖道感染患者标本200份。其中男147例，年龄17～64岁，平均31岁，女53例，年龄18～43岁，平均28.5岁。男性标本涂片镜检白细胞>5/HP,女性标本涂片白细胞>20/HP。
三、引物合成
, 百拇医药 参照De Barbeyrac等[2]、Jensen等[3]、Palmer等[4]依据Mg 140 000粘附素(MgPa)基因序列设计的Mg引物，由中国科学院上海生物工程研究中心合成：MgPa1/MgPa3、Mg1/Mg2及MGS-1/MGS-4。引物序列见表1。
表1 MgPa基因引物资料 引物名
序列(5′→3′)
基因中位置
产物长
度(bp)
酶切片
段(bp)
酶切
, 百拇医药
位点
MgPa1
AGTTGATGAAACCTTAACCCCTTGG
179～206
281
45(Alu I)
315
MgPa3
CCGTTGAGGGGTTTTCCATTTTTGC
435～460
236
MGS-1
, http://www.100md.com
GAGCCTTTCTAACCGCTGC
38～56
371
96(EcoR I)
315
MGS-4
GTTGTTATCATACCTTCTGAT
388～408
277
Mg1
TGTCTATGACCAGTATGTAC
3 837～3 856
, 百拇医药
374
84(EcoR I)
4 182
Mg2
CTGCTTTGGTCAAGACATCA
4 190～4 210
290
四、DNA模板的制备
支原体、其它菌种DNA模板提取方法见文献[2]。
五、PCR扩增
扩增反应体系总体积为50μl，其中含模板10μl，TaqDNA聚合酶2U，引物各1μmol/L，200μmol/L的每种dNTPs，1×PCR缓冲液(50mmol/L KCl，10mmol/L Tris(pH9.0)，1.5mmol/L MgCl2，0.01%明胶，0.1%TritonX-100)。灭菌双蒸水补足50μl，上覆矿物油50μl。95℃预变性5分钟，PCR反应温度及时间分别设置为：引物MgPa1/MgPa3 95℃变性1分钟，52℃复性1分钟，72℃延伸1分钟；引物Mg1/Mg2 95℃变性1分钟，45℃复性1分钟，72℃延伸1分钟；引物MGS-1/MGS-4 95℃变性1分钟，55℃复性1分钟，72℃延伸1分钟。3对引物PCR分别都进行35个循环，在最后1个循环将延伸时间延长至6分钟。每份标本分别行3对引物的扩增反应。每次试验应设立阴性及阳性对照，阴性对照加灭菌双蒸水作模板，阳性对照加Mg G-37模板DNA。
, 百拇医药
结果判断：取扩增产物10μl在2%琼脂糖凝胶中(含0.5μg/ml的溴化乙锭)进行电泳。在透过式紫外灯下观察结果并照相。出现预期长度的扩增片段或和阳性对照平行的DNA扩增带为PCR阳性。
六、特异性和敏感性试验
在特异性试验中使用Mp、Uu、Mh、NG、CT等病原体与Mg G-37模板一道分别行3对引物的MgPa基因PCR。敏感性试验中将已知支原体量的Mg G-37培养液用Mg培养基作系列梯度稀释，分别取105 CCU～1 CCU支原体量作模板分别进行3对引物的PCR扩增。
七、酶切鉴定PCR产物
在一灭菌的Eppendorf管内将5μl PCR阳性扩增产物，与10×酶缓冲液，BSA(终浓度0.1mg/ml)，限制性内切酶EcoR I或Alu I 5U，无菌去离子水补足20μl，混匀，短时离心，37℃水浴2～3小时，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。
, 百拇医药
八、统计学分析
采用四格表的确切概率法。
结果
一、PCR的特异性
经3对引物PCR分别检测，Mg G-37分别有281bp、371bp、374bp的特异扩增带。Mp、Mh、Uu、CT、NG等其它支原体、螺原体、细菌均无任何特异扩增带出现。3对引物扩增产物经限制性内切酶EcoR I或Alu I消化分别产生了45bp与236bp、96bp与277bp、84bp与290bp的2个片段。
二、PCR的敏感性
将105 CCU的Mg作10倍系列梯度稀释至1CCU 3对引物PCR分别检测Mg的敏感性均达10 CCU的支原体量。
, 百拇医药
三、Mg的感染率
200例STD门诊患者标本经3对引物PCR分别检测Mg，有12例为Mg阳性，阳性率为6%(12/200)，其中男9例，阳性率为6.12%(9/147)；女3例，阳性率为5.66%(3/53)。Mg阳性率在性别上差异无显著性(χ2=0.048,P>0.05)。在12例Mg阳性患者中，存在其它病原体混合感染，有7例合并细菌感染，1例合并HPV感染，2例合并Uu、Mh感染，1例合并CT感染。
四、限制性内切酶酶切Mg标准株及临床标本3对引物的PCR扩增片段
除12例临床标本扩增的371bp片段缺失EcoR I酶切位点外，其余都产生了预期的两个片段。
讨论
本研究以Mg 140 000 MgPa基因序列为靶序列，设计合成了3对引物用于检测Mg。在特异性试验中，3对引物对Mg标准株均分别扩增出相应的特异DNA片段，而肺炎支原体等其它的支原体、螺原体和细菌未扩增出任何片段。用限制性内切酶酶切扩增产物分别产生了预期的两个片段。说明这3对引物具有良好的特异性。3对引物PCR的敏感性均达10 CCU的Mg。应用3对引物分别进行PCR检测临床标本的结果是一致的，阳性率为6%(12/200)，与国外报告的5%～27%[5]下限基本一致。其中男、女性感染率无明显差别。但研究中发现用引物MGS-1/MGS-4的所有临床标本PCR扩增产物缺失限制性内切酶EcoR I酶切位点。这可能与基因发生变异有关。文献报道[2，3，6]在扩增MgPa基因序列也发现MgPa基因序列在Mg各株之间有明显的异质性，其差异表现为硷基插入、点突变及某些限制性内切酶酶切位点的消失或限制性长度多态性上的差异等。MgPa基因5′端EcoR I酶切位点的缺失及用不同的引物进行临床检测时出现漏检的情况或扩增Mg DNA的失败[2，7]，可能反映了MgPa基因的变异或Mg株地理上的差异或由于点突变[2]。在引物3′端的变异将阻止有效的扩增产生假阴性或Mg不同的型株因MgPa基因序列不同就不可能被检测到[7]。用不同的引物检测Mg株或临床标本所获结果不同，表明选择合适的引物是非常重要的。
, http://www.100md.com
为证实PCR扩增产物的可靠性和特异性，本研究应用限制性内切酶酶切扩增产物产生了预期的酶切片段。Taylor-Robinson等[5]推荐用一序列的另1对引物或针对不同序列设计引物进行原PCR结果的重新确证。另有报道[2，5]应用限制性内切酶消化扩增产物，或选用同一基因另一引物或寡核苷酸探针以放射性或非放射性标记物标记，与扩增产物进行Southern印迹杂交[2，3，6]，以此来鉴定PCR扩增产物的特异性。
本研究结果也显示Mg感染患者存在着混合感染。12例Mg阳性患者1例合并CT感染，7例合并细菌感染，2例合并Uu与Mh感染。Jensen等[6]用PCR方法检测Mg，发现Mg常出现于衣原体阴性的NGU患者中，而且Mg的检出与CT存在与否无关，提示Mg可能是NGU的病因之一。
有关Mg PCR检测，煮沸样品对获得DNA是足够的。Mg DNA扩增不需要裂解，但临床标本用去污剂和蛋白酶K处理会更好些。对临床标本中存在的PCR抑制物而出现假阴性，可通过加热标本95℃～100℃数分钟或稀释标本，PCR抑制物可消失或降低。我们在处理临床标本时，省去了繁琐的DNA抽提步骤，具有简捷和可靠的优点。
, http://www.100md.com
本课题受湖南省科委资助
参考文献
1 Taylor-Robinson D. The history and role of Mycoplasma genitalium in sexually transmitted diseases. Genitourin Med, 1995,71:1-8.
2 De Barbeyrac B, Bernet-Poggi C, Febrer F, et al. Detection of Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium in clinical samples by polymerase chain reaction. Clin Infect Dis, 1993,17(suppl 1):S83-89.
3 Jensen JS, Uldum SA. Scndergard-Anderson J, et al. Polymerase chain reaction for detection of Mycoplasma genitalium in clinical samples. J Clin Microbiol, 1991,29:46-50.
, 百拇医药
4 Palmer HM, Gilroy CB, Furr PM, et al. Development and evaluation of the polymerase chain reaction to detect Mycoplasma genitalium. FEMS Microbiol Lett, 1991, 77:199-204.
5 Taylor-Robinson D, Gilroy CB, Hay PE. Occurence of Mycoplasma genitalium in different populations and its clinical significance. Clin Infect Disease, 1993,17(suppl 1):S66-68.
6 Jensen JS, Orsum R, Dohn B, et al.Mycoplasma genitalium: a cause of male urethritis? Genitourin Med, 1993, 69:265-269.
7 Jensen JS. Mycoplasma genitalium: acause of non-gonococcal urethritis? Genitourin Med, 1994,70:363-366.
(收稿：1998-09-14 修回：1999-09-28), http://www.100md.com
单位：421001 湖南省衡阳医学院
关键词：
中华传染病杂志990413
生殖支原体(Mg)与急、慢性非淋菌性尿道炎(NGU)、慢性前列腺炎、宫颈炎或盆腔炎、不育症等疾病[1]有关。Mg的生长极其缓慢，初代生长时间长，需要的营养成分复杂，从临床标本中分离培养Mg难度大，阳性率很低。血清学诊断因与肺炎支原体(Mp)有交叉反应而特异性差。为评价聚合酶链反应(PCR)方法检测Mg的可靠性，了解Mg在衡阳地区高危人群中的感染状况，我们在MgPa基因上选择了3对不同的引物，用PCR方法对泌尿生殖道感染患者的标本进行了Mg检测，现将结果报告如下。
材料和方法
, 百拇医药
一、标准菌株
生殖支原体(Mg,G-37)、肺炎支原体(Mp)、解脲支原体4型(Uu4)、人型支原体(Mh)、唾液支原体、口腔支原体、螺原体(CR，CH-1)、大肠杆菌、绿脓杆菌、枯草杆菌(以上均为我室保存国际标准菌种)，淋球菌(NG系临床分离株)，沙眼衣原体(CT)L2标准血清型(模板DNA由加拿大易亚军博士惠赠)。
二、标本采集
收集1996年12月～1997年10月衡阳市各医院性病门诊拟诊为非淋菌性尿道炎、阴道炎、宫颈炎、慢性前列腺炎等泌尿生殖道感染患者标本200份。其中男147例，年龄17～64岁，平均31岁，女53例，年龄18～43岁，平均28.5岁。男性标本涂片镜检白细胞>5/HP,女性标本涂片白细胞>20/HP。
三、引物合成
, 百拇医药 参照De Barbeyrac等[2]、Jensen等[3]、Palmer等[4]依据Mg 140 000粘附素(MgPa)基因序列设计的Mg引物，由中国科学院上海生物工程研究中心合成：MgPa1/MgPa3、Mg1/Mg2及MGS-1/MGS-4。引物序列见表1。
表1 MgPa基因引物资料 引物名
序列(5′→3′)
基因中位置
产物长
度(bp)
酶切片
段(bp)
酶切
, 百拇医药
位点
MgPa1
AGTTGATGAAACCTTAACCCCTTGG
179～206
281
45(Alu I)
315
MgPa3
CCGTTGAGGGGTTTTCCATTTTTGC
435～460
236
MGS-1
, http://www.100md.com
GAGCCTTTCTAACCGCTGC
38～56
371
96(EcoR I)
315
MGS-4
GTTGTTATCATACCTTCTGAT
388～408
277
Mg1
TGTCTATGACCAGTATGTAC
3 837～3 856
, 百拇医药
374
84(EcoR I)
4 182
Mg2
CTGCTTTGGTCAAGACATCA
4 190～4 210
290
四、DNA模板的制备
支原体、其它菌种DNA模板提取方法见文献[2]。
五、PCR扩增
扩增反应体系总体积为50μl，其中含模板10μl，TaqDNA聚合酶2U，引物各1μmol/L，200μmol/L的每种dNTPs，1×PCR缓冲液(50mmol/L KCl，10mmol/L Tris(pH9.0)，1.5mmol/L MgCl2，0.01%明胶，0.1%TritonX-100)。灭菌双蒸水补足50μl，上覆矿物油50μl。95℃预变性5分钟，PCR反应温度及时间分别设置为：引物MgPa1/MgPa3 95℃变性1分钟，52℃复性1分钟，72℃延伸1分钟；引物Mg1/Mg2 95℃变性1分钟，45℃复性1分钟，72℃延伸1分钟；引物MGS-1/MGS-4 95℃变性1分钟，55℃复性1分钟，72℃延伸1分钟。3对引物PCR分别都进行35个循环，在最后1个循环将延伸时间延长至6分钟。每份标本分别行3对引物的扩增反应。每次试验应设立阴性及阳性对照，阴性对照加灭菌双蒸水作模板，阳性对照加Mg G-37模板DNA。
, 百拇医药
结果判断：取扩增产物10μl在2%琼脂糖凝胶中(含0.5μg/ml的溴化乙锭)进行电泳。在透过式紫外灯下观察结果并照相。出现预期长度的扩增片段或和阳性对照平行的DNA扩增带为PCR阳性。
六、特异性和敏感性试验
在特异性试验中使用Mp、Uu、Mh、NG、CT等病原体与Mg G-37模板一道分别行3对引物的MgPa基因PCR。敏感性试验中将已知支原体量的Mg G-37培养液用Mg培养基作系列梯度稀释，分别取105 CCU～1 CCU支原体量作模板分别进行3对引物的PCR扩增。
七、酶切鉴定PCR产物
在一灭菌的Eppendorf管内将5μl PCR阳性扩增产物，与10×酶缓冲液，BSA(终浓度0.1mg/ml)，限制性内切酶EcoR I或Alu I 5U，无菌去离子水补足20μl，混匀，短时离心，37℃水浴2～3小时，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。
, 百拇医药
八、统计学分析
采用四格表的确切概率法。
结果
一、PCR的特异性
经3对引物PCR分别检测，Mg G-37分别有281bp、371bp、374bp的特异扩增带。Mp、Mh、Uu、CT、NG等其它支原体、螺原体、细菌均无任何特异扩增带出现。3对引物扩增产物经限制性内切酶EcoR I或Alu I消化分别产生了45bp与236bp、96bp与277bp、84bp与290bp的2个片段。
二、PCR的敏感性
将105 CCU的Mg作10倍系列梯度稀释至1CCU 3对引物PCR分别检测Mg的敏感性均达10 CCU的支原体量。
, 百拇医药
三、Mg的感染率
200例STD门诊患者标本经3对引物PCR分别检测Mg，有12例为Mg阳性，阳性率为6%(12/200)，其中男9例，阳性率为6.12%(9/147)；女3例，阳性率为5.66%(3/53)。Mg阳性率在性别上差异无显著性(χ2=0.048,P>0.05)。在12例Mg阳性患者中，存在其它病原体混合感染，有7例合并细菌感染，1例合并HPV感染，2例合并Uu、Mh感染，1例合并CT感染。
四、限制性内切酶酶切Mg标准株及临床标本3对引物的PCR扩增片段
除12例临床标本扩增的371bp片段缺失EcoR I酶切位点外，其余都产生了预期的两个片段。
讨论
本研究以Mg 140 000 MgPa基因序列为靶序列，设计合成了3对引物用于检测Mg。在特异性试验中，3对引物对Mg标准株均分别扩增出相应的特异DNA片段，而肺炎支原体等其它的支原体、螺原体和细菌未扩增出任何片段。用限制性内切酶酶切扩增产物分别产生了预期的两个片段。说明这3对引物具有良好的特异性。3对引物PCR的敏感性均达10 CCU的Mg。应用3对引物分别进行PCR检测临床标本的结果是一致的，阳性率为6%(12/200)，与国外报告的5%～27%[5]下限基本一致。其中男、女性感染率无明显差别。但研究中发现用引物MGS-1/MGS-4的所有临床标本PCR扩增产物缺失限制性内切酶EcoR I酶切位点。这可能与基因发生变异有关。文献报道[2，3，6]在扩增MgPa基因序列也发现MgPa基因序列在Mg各株之间有明显的异质性，其差异表现为硷基插入、点突变及某些限制性内切酶酶切位点的消失或限制性长度多态性上的差异等。MgPa基因5′端EcoR I酶切位点的缺失及用不同的引物进行临床检测时出现漏检的情况或扩增Mg DNA的失败[2，7]，可能反映了MgPa基因的变异或Mg株地理上的差异或由于点突变[2]。在引物3′端的变异将阻止有效的扩增产生假阴性或Mg不同的型株因MgPa基因序列不同就不可能被检测到[7]。用不同的引物检测Mg株或临床标本所获结果不同，表明选择合适的引物是非常重要的。
, http://www.100md.com
为证实PCR扩增产物的可靠性和特异性，本研究应用限制性内切酶酶切扩增产物产生了预期的酶切片段。Taylor-Robinson等[5]推荐用一序列的另1对引物或针对不同序列设计引物进行原PCR结果的重新确证。另有报道[2，5]应用限制性内切酶消化扩增产物，或选用同一基因另一引物或寡核苷酸探针以放射性或非放射性标记物标记，与扩增产物进行Southern印迹杂交[2，3，6]，以此来鉴定PCR扩增产物的特异性。
本研究结果也显示Mg感染患者存在着混合感染。12例Mg阳性患者1例合并CT感染，7例合并细菌感染，2例合并Uu与Mh感染。Jensen等[6]用PCR方法检测Mg，发现Mg常出现于衣原体阴性的NGU患者中，而且Mg的检出与CT存在与否无关，提示Mg可能是NGU的病因之一。
有关Mg PCR检测，煮沸样品对获得DNA是足够的。Mg DNA扩增不需要裂解，但临床标本用去污剂和蛋白酶K处理会更好些。对临床标本中存在的PCR抑制物而出现假阴性，可通过加热标本95℃～100℃数分钟或稀释标本，PCR抑制物可消失或降低。我们在处理临床标本时，省去了繁琐的DNA抽提步骤，具有简捷和可靠的优点。
, http://www.100md.com
本课题受湖南省科委资助
参考文献
1 Taylor-Robinson D. The history and role of Mycoplasma genitalium in sexually transmitted diseases. Genitourin Med, 1995,71:1-8.
2 De Barbeyrac B, Bernet-Poggi C, Febrer F, et al. Detection of Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium in clinical samples by polymerase chain reaction. Clin Infect Dis, 1993,17(suppl 1):S83-89.
3 Jensen JS, Uldum SA. Scndergard-Anderson J, et al. Polymerase chain reaction for detection of Mycoplasma genitalium in clinical samples. J Clin Microbiol, 1991,29:46-50.
, 百拇医药
4 Palmer HM, Gilroy CB, Furr PM, et al. Development and evaluation of the polymerase chain reaction to detect Mycoplasma genitalium. FEMS Microbiol Lett, 1991, 77:199-204.
5 Taylor-Robinson D, Gilroy CB, Hay PE. Occurence of Mycoplasma genitalium in different populations and its clinical significance. Clin Infect Disease, 1993,17(suppl 1):S66-68.
6 Jensen JS, Orsum R, Dohn B, et al.Mycoplasma genitalium: a cause of male urethritis? Genitourin Med, 1993, 69:265-269.
7 Jensen JS. Mycoplasma genitalium: acause of non-gonococcal urethritis? Genitourin Med, 1994,70:363-366.
(收稿：1998-09-14 修回：1999-09-28), http://www.100md.com