口腔癌中人乳头瘤病毒16型和Ha-ras癌基因点突变的研究
作者：周刚 程鹏 丁晓华 李辉菶
单位：430070武汉，湖北医科大学口腔医学院(周刚，李辉菶)；北京医科大学口腔医学院(程鹏)；湖北医科大学病毒研究所(丁晓华)
关键词：口腔癌；人乳头瘤病毒16型；Ha-ras癌基因；点突变
临床口腔医学杂志990408 提 要 目的 检测口腔癌中的人乳头瘤病毒(HPV)16型DNA和Ha-rar癌基因的点突变，探讨HPV16型和Ha-ras癌基因的点突变与口腔癌之间的关系。方法 应用多聚酶链反应(PCR)技术扩增HPV16 DNA和Ha-ras癌基因相关片段，分别采用2%琼脂糖凝胶电泳和限制性片段长度多态性分析(RFLP)，检测口腔癌中的HPV16 DNA和Ha-ras癌基因第12位密码子的点突变。结果 在17例口腔癌组织中，6例(35.5%)组织HPV16 DNA阳性，5例(29.4%)组织Ha—ras癌基因发生点突变，其中2例组织HPV16 DNA和Ha-ras癌基因点突变的检测均为阳性。结论 口腔癌的发生可能与HPV16和Ha—ras癌基因的点突变有一定的关系。
, 百拇医药
Human Papillomavirus 16 and point mutation of Ha-ras oncogene in oral squamous cell carcinoma.
zhou Gang, Cheng Peng, Ding Xiaohua, et al.
College of Stomatology, Hubei Medical University, Wuhan 430070
Abstract Objective To study the association of Human papillomavirus (HPV) 16 and point mutation of Ha-ras oncogene with oral squamous cell carcinoma. Methods Polymerase chain reaction(PCR) was used to detect HPV 16 DNA and point mutation at condon 12 of Ha-ras oncogene. Results 6 of 17(35.3%) cases of oral squamous cell carcinoma were proved to contain HPV16 DNA. 5(29.4%)were found to have point mutation of Ha-ras oncogene. Conclusion HPV16 and point mutation of Ha-ras oncogene might play some role in the carcinogenesis of oral squamous cell carcinona.
, 百拇医药
Key words Oral squamou cell carcinoma Human papillomavirus 16 Ha-ras oncogene Point mutation.
材料和方法
1. 标本：17例口腔鳞状细胞癌标本，来自湖北医科大学口腔医院手术切除或活检标本，均经病理确诊。
2. 组织DNA的提取：将组织剪碎、匀浆后，用蛋白酶K消化，苯酚、氯仿抽提，RNA酶纯化。紫外分光光度计测定DNA溶液的含量。按常规方法制备HPV16及突变型(G→T)Ha-ras癌基因质粒DNA。
3. 多聚酶链反应(PCR)：扩增HPV16上游调节区(URR)片段的两个引物，其序列为：
HPV16-1 :5′-GCTGTTAGGCACATATTTT-3′
, 百拇医药
HPV16-2 :5′-ATGAACTAGGGTGACATTT-3′扩增Ha-ras癌基因片段的两个引物，其序列为：
Ha-ras-a:5′-ACGGAATATAAGCTGGTGG-3′
Ha-ras-2:5′-CGGCGGCAGGTCCACGGTC-3′
引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成。
按标准各配制HPV16和Ha-ras癌基因的PCR反应体系50μl，94℃变性10分钟，55℃水浴2分钟，加入2单位Taq DNA聚合酶，覆盖30μl石蜡油，离心数秒，72℃水浴30秒。再以94℃60秒，55℃30秒，72℃30秒循环35次，最后一次循环在72℃保温10分钟，取PCR产物10μl在2%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察DNA扩增带。
, 百拇医药
4. 限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism,RFLP)：取Ha-ras PCR产物下层水相20μl，用等体积氯仿抽提，沉淀，抽干。加入酶切缓冲液3μl，双蒸水26μl，HpaⅡ10u,37℃保温4小时，用0.5M EDTA2μl终止反应，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察电泳片段。
结 果
1. 口腔癌中HPV16 DNA和Ha-ras癌基因点突变的检测结果：
分别以HPV16质粒DNA和突变型Ha-ras癌基因质粒DNA作为阳性对照，以双蒸水作为阴性对照。口腔癌组织经过HPV16 DNA扩增电泳后，若在100bp处出现DNA特异性的染色带，说明HPV16 DNA检测结果为阳性。经过Ha-ras癌基因扩增，HpaⅡ酶切电泳后，若在138bp处出现一条DNA扩增带，说明Ha-ras癌基因第12位密码子发生点突变。结果显示，在17例口腔癌组织中，6例(35.3%)组织HPV16 DNA阳性，5例(29.4%)组织Ha-ras癌基因发生突变，其中2例组织HPV16 DNA和Ha-ras癌基因点突变的检测均为阳性。
, 百拇医药
2. 口腔癌的分化程度和HPV16 DNA及Ha-ras癌基因点突变的关系(表1)。
表1 口腔癌分化程度和HPV16及Ha-ras点突变 分化程度
例数
HPV16阳性数
点突变阳性数
高
4
2
1
中
6
2
, 百拇医药
2
低
7
2
2
合计
17
6
5
*P>0.05讨 论
运用核酸杂交和PCR技术，近年来已在口腔癌中发现不同类型和不同阳性率的HPV DNA，包括HPV2、3、6、11、16、18和57型，以HPV16的检出率最高[1，2]。Watts在14例口腔鳞癌组织中，发现所有组织HPV DNA为阳性，其中11例为HPV16，2例为HPV18，1例为HPV6，7例为HPV11[3]。本文检测17例口腔癌组织中的HPV16 DNA，其阳性率为35.3%，结果提示HPV16可能与口腔癌之间存在一定的关系。分析口腔癌的分化程度与HPV16感染之间的关系，未发现它们之间的差异性(P>0.05)，和Maitland的报道[4]一致。目前已证实HPV的高危型(主要是HPV16，18)与宫颈癌的发生密切相关。HPV16可引起多种细胞株的转化，其E6、E7基因的表达与恶性表型的诱发和维持有关。但要证实其在口腔癌中的作用还需要大量的证据。
, 百拇医药
ras癌基因在人类肿瘤的发生中起着重要的作用，它在体内激活的主要方式是点突变。Ha-ras癌基因的点突变主要集中在第12、13和61位密码子上[5]，这些位点对于维持ras癌基因产物P21蛋白的构型和转化功能是非常重要的。Ha-ras癌基因第12位密码子发生G→T突变，其编码子由GGC变为GTC，降低了P21蛋白的GTP酶活性，使其水解GTP的速率大为降低，使ras蛋白维持于活化状态，不断激活靶分子，引起信号传导的持续流动，导致细胞大量繁殖，引起恶性转化。Saranath等在57例口腔癌标本中，发现20例(35%)标本Ha-ras的第12、13和61位密码子存在点突变[6]。我们在17例口腔癌中，发现5例组织的Ha-ras癌基因第12位密码子发生G→T突变。结果说明该突变可能是口腔癌中Ha-ras癌基因激活的方式之一，与口腔癌的发生可能有关。
有研究发现HPV16和ras癌基因可能具有协同致癌作用。高危型的HPV E7开放读码框架(ORF)能与激活的ras癌基因协同，促使原代细胞转化。HPV16 E7蛋白还能与激活的ras癌基因共同作用，导致小鼠胚胎纤维细胞及幼鼠肾细胞永生化。我们发现2例HPV16 DNA阳性的标本，同时发生了Ha-ras癌基因的点突变，但HPV16和Ha-ras癌基因之间联系的机制尚有待于进一步的研究。
, 百拇医药
参考文献
1 周刚.人类乳头瘤病毒与口腔癌的研究进展.国外医学口腔医学分册，1993，20(2)：94
2 Chang F,Syrjanen S,Kelloloski J,et al.Human papillomavirus(HPV) infections and their associations with oral diseases,J Oral Pathol Med 1991,20:305
3 Watts SL,Brewer EE,Fry TL,et al.Human papillomavirus DNA types in squamous cell carcinomas of the head and neck,Oral Surg Oral Med Oral Pathol,1991,71:701
4 Maitland NJ,Cox MF,Lynas C,et al.Detection of human papillomavirus DNA in biopsies of human oral tissue,Br J Cancer 1987,56:245
, 百拇医药
5 Scully C.Oncogenes,tumour suppressors and viruses in oral squamous carcinoma,J Oral Pathol Med 1993,22:337
6 Saranath D,Chang SE,Bhoite LT,et al.High frequency mutation in codons 12 and 61 of H-ras oncogene in chewing tobacco-related human oral carcinoma in India.Br J Cancer,1991,63;573
(收稿：1999—06—25), http://www.100md.com
单位：430070武汉，湖北医科大学口腔医学院(周刚，李辉菶)；北京医科大学口腔医学院(程鹏)；湖北医科大学病毒研究所(丁晓华)
关键词：口腔癌；人乳头瘤病毒16型；Ha-ras癌基因；点突变
临床口腔医学杂志990408 提 要 目的 检测口腔癌中的人乳头瘤病毒(HPV)16型DNA和Ha-rar癌基因的点突变，探讨HPV16型和Ha-ras癌基因的点突变与口腔癌之间的关系。方法 应用多聚酶链反应(PCR)技术扩增HPV16 DNA和Ha-ras癌基因相关片段，分别采用2%琼脂糖凝胶电泳和限制性片段长度多态性分析(RFLP)，检测口腔癌中的HPV16 DNA和Ha-ras癌基因第12位密码子的点突变。结果 在17例口腔癌组织中，6例(35.5%)组织HPV16 DNA阳性，5例(29.4%)组织Ha—ras癌基因发生点突变，其中2例组织HPV16 DNA和Ha-ras癌基因点突变的检测均为阳性。结论 口腔癌的发生可能与HPV16和Ha—ras癌基因的点突变有一定的关系。
, 百拇医药
Human Papillomavirus 16 and point mutation of Ha-ras oncogene in oral squamous cell carcinoma.
zhou Gang, Cheng Peng, Ding Xiaohua, et al.
College of Stomatology, Hubei Medical University, Wuhan 430070
Abstract Objective To study the association of Human papillomavirus (HPV) 16 and point mutation of Ha-ras oncogene with oral squamous cell carcinoma. Methods Polymerase chain reaction(PCR) was used to detect HPV 16 DNA and point mutation at condon 12 of Ha-ras oncogene. Results 6 of 17(35.3%) cases of oral squamous cell carcinoma were proved to contain HPV16 DNA. 5(29.4%)were found to have point mutation of Ha-ras oncogene. Conclusion HPV16 and point mutation of Ha-ras oncogene might play some role in the carcinogenesis of oral squamous cell carcinona.
, 百拇医药
Key words Oral squamou cell carcinoma Human papillomavirus 16 Ha-ras oncogene Point mutation.
材料和方法
1. 标本：17例口腔鳞状细胞癌标本，来自湖北医科大学口腔医院手术切除或活检标本，均经病理确诊。
2. 组织DNA的提取：将组织剪碎、匀浆后，用蛋白酶K消化，苯酚、氯仿抽提，RNA酶纯化。紫外分光光度计测定DNA溶液的含量。按常规方法制备HPV16及突变型(G→T)Ha-ras癌基因质粒DNA。
3. 多聚酶链反应(PCR)：扩增HPV16上游调节区(URR)片段的两个引物，其序列为：
HPV16-1 :5′-GCTGTTAGGCACATATTTT-3′
, 百拇医药
HPV16-2 :5′-ATGAACTAGGGTGACATTT-3′扩增Ha-ras癌基因片段的两个引物，其序列为：
Ha-ras-a:5′-ACGGAATATAAGCTGGTGG-3′
Ha-ras-2:5′-CGGCGGCAGGTCCACGGTC-3′
引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成。
按标准各配制HPV16和Ha-ras癌基因的PCR反应体系50μl，94℃变性10分钟，55℃水浴2分钟，加入2单位Taq DNA聚合酶，覆盖30μl石蜡油，离心数秒，72℃水浴30秒。再以94℃60秒，55℃30秒，72℃30秒循环35次，最后一次循环在72℃保温10分钟，取PCR产物10μl在2%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察DNA扩增带。
, 百拇医药
4. 限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism,RFLP)：取Ha-ras PCR产物下层水相20μl，用等体积氯仿抽提，沉淀，抽干。加入酶切缓冲液3μl，双蒸水26μl，HpaⅡ10u,37℃保温4小时，用0.5M EDTA2μl终止反应，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察电泳片段。
结 果
1. 口腔癌中HPV16 DNA和Ha-ras癌基因点突变的检测结果：分别以HPV16质粒DNA和突变型Ha-ras癌基因质粒DNA作为阳性对照，以双蒸水作为阴性对照。口腔癌组织经过HPV16 DNA扩增电泳后，若在100bp处出现DNA特异性的染色带，说明HPV16 DNA检测结果为阳性。经过Ha-ras癌基因扩增，HpaⅡ酶切电泳后，若在138bp处出现一条DNA扩增带，说明Ha-ras癌基因第12位密码子发生点突变。结果显示，在17例口腔癌组织中，6例(35.3%)组织HPV16 DNA阳性，5例(29.4%)组织Ha-ras癌基因发生突变，其中2例组织HPV16 DNA和Ha-ras癌基因点突变的检测均为阳性。
, 百拇医药
2. 口腔癌的分化程度和HPV16 DNA及Ha-ras癌基因点突变的关系(表1)。
表1 口腔癌分化程度和HPV16及Ha-ras点突变 分化程度
例数
HPV16阳性数
点突变阳性数
高
4
2
1
中
6
2
, 百拇医药
2
低
7
2
2
合计
17
6
5
*P>0.05讨 论
运用核酸杂交和PCR技术，近年来已在口腔癌中发现不同类型和不同阳性率的HPV DNA，包括HPV2、3、6、11、16、18和57型，以HPV16的检出率最高[1，2]。Watts在14例口腔鳞癌组织中，发现所有组织HPV DNA为阳性，其中11例为HPV16，2例为HPV18，1例为HPV6，7例为HPV11[3]。本文检测17例口腔癌组织中的HPV16 DNA，其阳性率为35.3%，结果提示HPV16可能与口腔癌之间存在一定的关系。分析口腔癌的分化程度与HPV16感染之间的关系，未发现它们之间的差异性(P>0.05)，和Maitland的报道[4]一致。目前已证实HPV的高危型(主要是HPV16，18)与宫颈癌的发生密切相关。HPV16可引起多种细胞株的转化，其E6、E7基因的表达与恶性表型的诱发和维持有关。但要证实其在口腔癌中的作用还需要大量的证据。
, 百拇医药
ras癌基因在人类肿瘤的发生中起着重要的作用，它在体内激活的主要方式是点突变。Ha-ras癌基因的点突变主要集中在第12、13和61位密码子上[5]，这些位点对于维持ras癌基因产物P21蛋白的构型和转化功能是非常重要的。Ha-ras癌基因第12位密码子发生G→T突变，其编码子由GGC变为GTC，降低了P21蛋白的GTP酶活性，使其水解GTP的速率大为降低，使ras蛋白维持于活化状态，不断激活靶分子，引起信号传导的持续流动，导致细胞大量繁殖，引起恶性转化。Saranath等在57例口腔癌标本中，发现20例(35%)标本Ha-ras的第12、13和61位密码子存在点突变[6]。我们在17例口腔癌中，发现5例组织的Ha-ras癌基因第12位密码子发生G→T突变。结果说明该突变可能是口腔癌中Ha-ras癌基因激活的方式之一，与口腔癌的发生可能有关。
有研究发现HPV16和ras癌基因可能具有协同致癌作用。高危型的HPV E7开放读码框架(ORF)能与激活的ras癌基因协同，促使原代细胞转化。HPV16 E7蛋白还能与激活的ras癌基因共同作用，导致小鼠胚胎纤维细胞及幼鼠肾细胞永生化。我们发现2例HPV16 DNA阳性的标本，同时发生了Ha-ras癌基因的点突变，但HPV16和Ha-ras癌基因之间联系的机制尚有待于进一步的研究。
, 百拇医药
参考文献
1 周刚.人类乳头瘤病毒与口腔癌的研究进展.国外医学口腔医学分册，1993，20(2)：94
2 Chang F,Syrjanen S,Kelloloski J,et al.Human papillomavirus(HPV) infections and their associations with oral diseases,J Oral Pathol Med 1991,20:305
3 Watts SL,Brewer EE,Fry TL,et al.Human papillomavirus DNA types in squamous cell carcinomas of the head and neck,Oral Surg Oral Med Oral Pathol,1991,71:701
4 Maitland NJ,Cox MF,Lynas C,et al.Detection of human papillomavirus DNA in biopsies of human oral tissue,Br J Cancer 1987,56:245
, 百拇医药
5 Scully C.Oncogenes,tumour suppressors and viruses in oral squamous carcinoma,J Oral Pathol Med 1993,22:337
6 Saranath D,Chang SE,Bhoite LT,et al.High frequency mutation in codons 12 and 61 of H-ras oncogene in chewing tobacco-related human oral carcinoma in India.Br J Cancer,1991,63;573
(收稿：1999—06—25), http://www.100md.com