阿糖胞苷、高三尖杉酯碱诱导急性非淋巴细胞白血病细胞凋亡的临床研究
作者：陈丽娟 盛瑞兰 汪承亚 朱广荣
单位：南京医科大学第一附属医院血液科 邮政编码：210029
关键词：细胞凋亡 急性非淋巴细胞白血病 临床疗效 耐药
江苏医药990403 摘要 运用吖啶橙(AO)/溴乙锭(EB)染色法检测阿糖胞苷(Ara-c)、高三尖杉酯碱(HHT)体外诱导临床初发及复发/难治急性非淋巴细胞白血病(ANLL)患者的白血病细胞凋亡，观察细胞凋亡指数与临床疗效的关系。结果显示初治ANLL药物诱导组凋亡率明显高于复发/难治组，初治组完全缓解(CR)者凋亡指数明显高于未缓解(NR)者。说明凋亡与耐药、凋亡与临床疗效有一定的关系。
A Study of Apoptosis on Non-lymphocytic Leukemia Cells Induced by
, 百拇医药
Cytosine Arabinoside and Homoharringtonine
Chen Lijuan et al
Department of Haemotology, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University
Abstract Using acridine orange (AO)/ethidium bromide(EB) staining, the apoptosis of leukemia cells from acute non-lymphocytic leukemia patients, which was induced by cytosine arabinoside (Ara-c) or/and homoharringtonine (HHT), was tested. The results showed that the apoptosis rates of initial ones were higher than those of relapsed/refractory ones, while apoptosis indexes of initial cases in complete remission were much higher than those of ones in non-remission. It suggested that apoptosis might be related to the drug resistance of leukemia cells and the clinical curative effects of chemotherapy.
, 百拇医药
Key words Apoptosis Acute non-lymphocytic leukemia Clinical curative effects Drug resistance
细胞凋亡是一种不同于坏死的细胞死亡形式，细胞凋亡与白血病治疗之间的关系已成为国际上研究的热点。本文主要研究Ara-c、HHT体外诱导临床初发及复发/难治白血病细胞凋亡，探讨细胞凋亡指数与耐药、临床疗效的关系。
材料与方法
一、对象
ANLL患者来源于本院血液科门诊及住院病例(15例)以及外院血液科已确诊的病例(13例)，均符合FAB协作组白血病分类标准。其中初治组13例，复发/难治组15例(复发7例，难治8例)。难治病例系指经标准化疗方案化疗两个疗程不缓解者。复发病例指化疗后获得CR又出现下列之一项者：(1)骨髓原粒细胞Ⅰ型+Ⅱ型(原单+幼单)>5%且<20%，经过有效抗白血病治疗1个疗程仍未能达到骨髓完全缓解标准者；(2)骨髓原单+幼单>20%者；(3)髓外白血病复发者。
, http://www.100md.com
二、方法
1.患者细胞培养 取患者抗凝骨髓2ml或静脉抗凝血5ml经Ficoll分离单个核细胞，取5×106个细胞于1640培养液(5ml)中悬浮培养，置37℃、5%CO2浓度及饱和湿度的恒温箱中悬浮培养，12小时后，分别加入Ara-c、HHT和Ara-c+HHT(Ara-c、HHT的终浓度分别为10μg/ml、80ng/ml)，诱导培养12小时。
2.吖啶橙(AO)/溴乙锭(EB)染色及结果观察[1] 取上述诱导培养的细胞悬液100μl加入AO/EB染料4μl，混匀，置一滴于载玻片上，上覆盖玻片，在荧光显微镜下观察结果并计数200个细胞，核染色质呈固缩状、片段状或小珠状示凋亡细胞，核染色质呈正常结构示非凋亡细胞。细胞凋亡率由下式计算：
×100%
, 百拇医药
3.临床疗效判断 详见全国白血病化学治疗讨论会急性白血病疗效判断标准[2]。
4.统计学方法 凋亡率经变量转换(Y＝arcsin
)后行方差分析。
结果
初治13例经临床化疗后获得CR7例，部分缓解(PR)1例，NR5例。15例复发/难治组，仅1例经去甲氧柔红霉素+阿糖胞苷方案化疗3次后达CR，1例经HA(HHT+Ara-c)方案化疗后PR，余均为NR，详见表1。
表1 初发、复发/难治ANLL患者的临床疗效 组别
例数
, 百拇医药
CR
PR
NR
初 发 组
13
7
1
5
复发/难治组
15
1
3
11
由患者的凋亡指数及临床疗效(见表2、3)可得出以下结论：(1)初治组与复发/难治组凋亡率各诱导组方差分析均有显著性差异(P<0.05)，复发/难治组经Ara-c、HHT诱导后白血病细胞凋亡指数明显低于初发组；(2)初治组获得CR者与NR者凋亡指数间有显著性差异(P<0.05)，CR者凋亡指数明显高于NR者。表2 初发、复发/难治ANLL患者的平均凋亡率 组别
, http://www.100md.com
例数
各药物诱导平均凋亡率(%)
对照
Ara-c
HHT
A+H
初 发 组
13
3.85
41.85
42.31
53.88
复发/难治组
, 百拇医药
15
2.10
16.63
19.57
27.43
表3 初发ANLL患者CR组与NR组平均凋亡率 组别
例数
各药物诱导平均凋亡率(%)
对照
Ara-c
HHT
A+H
, 百拇医药
CR
7
3.50
58.00
52.93
64.86
NR
5
3.60
19.80
29.10
40.10
讨论
, http://www.100md.com
细胞凋亡是不同于细胞坏死的一种主动死亡，其检测方法有多种，AO/EB荧光染色不仅易于识别凋亡细胞的存在，而且能计算出受检细胞群体中细胞凋亡的发生率，是一种半定量方法，此法简便、经济，便于开展。
ANLL是成人急性白血病最常见的类型，国内常用的化疗方案为HA方案，过去认为HHT、Ara-c的作用机制大剂量时是细胞毒作用，小剂量为诱导分化作用[3，4]，本研究证实二者具有诱导ANLL白血病细胞凋亡的作用。
本研究将ANLL患者分成初发及难治/复发两组，复发/难治组患者经Ara-c、HHT诱导的白血病凋亡指数均低于敏感者，很符合所谓的耐药可被视为抗调亡的推论。抗凋亡与下列机制有关：(1)与药物结合的受体发生突变；(2)调控细胞凋亡的基因表达异常及突变，抑制细胞凋亡的基因如BCL-2基因、BCR/ABL融合基因、PML/RARα基因等表达水平增加，野生型p53基因突变致突变型p53基因表达水平增加；(3)细胞因子的刺激作用。而与多药耐药基因mdr1、mdr3基因无关[5]。
, 百拇医药
初治ANLL经化疗达CR者本实验证实其白血病细胞凋亡指数明显高于NR者，尽管例数较少，尚有待进一步积累，但结果提示凋亡指数与临床疗效呈现正相关，今后可作为判断临床预后的指标之一，亦可用于新药筛选。
作者设想在难治及耐药患者，为了增强药物的敏感性，可运用凋亡学说原理，在治疗过程中有目的地调控诱导白血病细胞凋亡的各种因素，如上调诱导细胞凋亡的基因(野生型p53基因)，下调抑制凋亡的基因(BCL-2基因)，加用促进细胞凋亡的细胞因子(TNF、TGF-β)，清除抑制细胞凋亡的细胞因子(GM-CSF、G-CSF、IL-3等)，以增强化疗药物诱导细胞凋亡的效应，此将为克服复发/难治性白血病提供崭新的治疗方案。
参考文献
[1] Wang chenya, et al. CMJ 1996；109：537.
[2] 全国白血病化学治疗讨论会急性白血病疗效标准.中华血液学杂志 1988；9：183.
[3] Lotem J, et al. Blood 1992；80：1750.
[4] 李林.药学学报 1994；9：667.
[5] Soumaga ER, et al. Blood 1993；82：3452.
(1998年4月28日收稿 同年6月25日修回), http://www.100md.com
单位：南京医科大学第一附属医院血液科 邮政编码：210029
关键词：细胞凋亡 急性非淋巴细胞白血病 临床疗效 耐药
江苏医药990403 摘要 运用吖啶橙(AO)/溴乙锭(EB)染色法检测阿糖胞苷(Ara-c)、高三尖杉酯碱(HHT)体外诱导临床初发及复发/难治急性非淋巴细胞白血病(ANLL)患者的白血病细胞凋亡，观察细胞凋亡指数与临床疗效的关系。结果显示初治ANLL药物诱导组凋亡率明显高于复发/难治组，初治组完全缓解(CR)者凋亡指数明显高于未缓解(NR)者。说明凋亡与耐药、凋亡与临床疗效有一定的关系。
A Study of Apoptosis on Non-lymphocytic Leukemia Cells Induced by
, 百拇医药
Cytosine Arabinoside and Homoharringtonine
Chen Lijuan et al
Department of Haemotology, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University
Abstract Using acridine orange (AO)/ethidium bromide(EB) staining, the apoptosis of leukemia cells from acute non-lymphocytic leukemia patients, which was induced by cytosine arabinoside (Ara-c) or/and homoharringtonine (HHT), was tested. The results showed that the apoptosis rates of initial ones were higher than those of relapsed/refractory ones, while apoptosis indexes of initial cases in complete remission were much higher than those of ones in non-remission. It suggested that apoptosis might be related to the drug resistance of leukemia cells and the clinical curative effects of chemotherapy.
, 百拇医药
Key words Apoptosis Acute non-lymphocytic leukemia Clinical curative effects Drug resistance
细胞凋亡是一种不同于坏死的细胞死亡形式，细胞凋亡与白血病治疗之间的关系已成为国际上研究的热点。本文主要研究Ara-c、HHT体外诱导临床初发及复发/难治白血病细胞凋亡，探讨细胞凋亡指数与耐药、临床疗效的关系。
材料与方法
一、对象
ANLL患者来源于本院血液科门诊及住院病例(15例)以及外院血液科已确诊的病例(13例)，均符合FAB协作组白血病分类标准。其中初治组13例，复发/难治组15例(复发7例，难治8例)。难治病例系指经标准化疗方案化疗两个疗程不缓解者。复发病例指化疗后获得CR又出现下列之一项者：(1)骨髓原粒细胞Ⅰ型+Ⅱ型(原单+幼单)>5%且<20%，经过有效抗白血病治疗1个疗程仍未能达到骨髓完全缓解标准者；(2)骨髓原单+幼单>20%者；(3)髓外白血病复发者。
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二、方法
1.患者细胞培养 取患者抗凝骨髓2ml或静脉抗凝血5ml经Ficoll分离单个核细胞，取5×106个细胞于1640培养液(5ml)中悬浮培养，置37℃、5%CO2浓度及饱和湿度的恒温箱中悬浮培养，12小时后，分别加入Ara-c、HHT和Ara-c+HHT(Ara-c、HHT的终浓度分别为10μg/ml、80ng/ml)，诱导培养12小时。
2.吖啶橙(AO)/溴乙锭(EB)染色及结果观察[1] 取上述诱导培养的细胞悬液100μl加入AO/EB染料4μl，混匀，置一滴于载玻片上，上覆盖玻片，在荧光显微镜下观察结果并计数200个细胞，核染色质呈固缩状、片段状或小珠状示凋亡细胞，核染色质呈正常结构示非凋亡细胞。细胞凋亡率由下式计算：
×100%, 百拇医药
3.临床疗效判断 详见全国白血病化学治疗讨论会急性白血病疗效判断标准[2]。
4.统计学方法 凋亡率经变量转换(Y＝arcsin
)后行方差分析。结果
初治13例经临床化疗后获得CR7例，部分缓解(PR)1例，NR5例。15例复发/难治组，仅1例经去甲氧柔红霉素+阿糖胞苷方案化疗3次后达CR，1例经HA(HHT+Ara-c)方案化疗后PR，余均为NR，详见表1。
表1 初发、复发/难治ANLL患者的临床疗效 组别
例数
, 百拇医药
CR
PR
NR
初 发 组
13
7
1
5
复发/难治组
15
1
3
11
由患者的凋亡指数及临床疗效(见表2、3)可得出以下结论：(1)初治组与复发/难治组凋亡率各诱导组方差分析均有显著性差异(P<0.05)，复发/难治组经Ara-c、HHT诱导后白血病细胞凋亡指数明显低于初发组；(2)初治组获得CR者与NR者凋亡指数间有显著性差异(P<0.05)，CR者凋亡指数明显高于NR者。表2 初发、复发/难治ANLL患者的平均凋亡率 组别
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例数
各药物诱导平均凋亡率(%)
对照
Ara-c
HHT
A+H
初 发 组
13
3.85
41.85
42.31
53.88
复发/难治组
, 百拇医药
15
2.10
16.63
19.57
27.43
表3 初发ANLL患者CR组与NR组平均凋亡率 组别
例数
各药物诱导平均凋亡率(%)
对照
Ara-c
HHT
A+H
, 百拇医药
CR
7
3.50
58.00
52.93
64.86
NR
5
3.60
19.80
29.10
40.10
讨论
, http://www.100md.com
细胞凋亡是不同于细胞坏死的一种主动死亡，其检测方法有多种，AO/EB荧光染色不仅易于识别凋亡细胞的存在，而且能计算出受检细胞群体中细胞凋亡的发生率，是一种半定量方法，此法简便、经济，便于开展。
ANLL是成人急性白血病最常见的类型，国内常用的化疗方案为HA方案，过去认为HHT、Ara-c的作用机制大剂量时是细胞毒作用，小剂量为诱导分化作用[3，4]，本研究证实二者具有诱导ANLL白血病细胞凋亡的作用。
本研究将ANLL患者分成初发及难治/复发两组，复发/难治组患者经Ara-c、HHT诱导的白血病凋亡指数均低于敏感者，很符合所谓的耐药可被视为抗调亡的推论。抗凋亡与下列机制有关：(1)与药物结合的受体发生突变；(2)调控细胞凋亡的基因表达异常及突变，抑制细胞凋亡的基因如BCL-2基因、BCR/ABL融合基因、PML/RARα基因等表达水平增加，野生型p53基因突变致突变型p53基因表达水平增加；(3)细胞因子的刺激作用。而与多药耐药基因mdr1、mdr3基因无关[5]。
, 百拇医药
初治ANLL经化疗达CR者本实验证实其白血病细胞凋亡指数明显高于NR者，尽管例数较少，尚有待进一步积累，但结果提示凋亡指数与临床疗效呈现正相关，今后可作为判断临床预后的指标之一，亦可用于新药筛选。
作者设想在难治及耐药患者，为了增强药物的敏感性，可运用凋亡学说原理，在治疗过程中有目的地调控诱导白血病细胞凋亡的各种因素，如上调诱导细胞凋亡的基因(野生型p53基因)，下调抑制凋亡的基因(BCL-2基因)，加用促进细胞凋亡的细胞因子(TNF、TGF-β)，清除抑制细胞凋亡的细胞因子(GM-CSF、G-CSF、IL-3等)，以增强化疗药物诱导细胞凋亡的效应，此将为克服复发/难治性白血病提供崭新的治疗方案。
参考文献
[1] Wang chenya, et al. CMJ 1996；109：537.
[2] 全国白血病化学治疗讨论会急性白血病疗效标准.中华血液学杂志 1988；9：183.
[3] Lotem J, et al. Blood 1992；80：1750.
[4] 李林.药学学报 1994；9：667.
[5] Soumaga ER, et al. Blood 1993；82：3452.
(1998年4月28日收稿 同年6月25日修回), http://www.100md.com