止消通脉对糖尿病大鼠肾小球形态改变的影响及定量分析*
作者：王耀献 原爱红 赵雁 魏民 吕仁和
单位：北京中医药大学 北京100029
关键词：止消通脉宁；实验性糖尿病；肾小球形态；定量分析；大鼠
北京中医药大学学报990407 摘要：采用链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立糖尿病大鼠模型，观察中药复方止消通脉宁对其肾小球形态学的影响。结果表明：与正常对照组相比，各组糖尿病大鼠肾小球毛细血管基底膜厚度(GBMW)、系膜区平均面积[A(M)]、肾小球平均截面积[A(G)]、肾小球直径[D(G)]和肾小球体积[V(G)]均显著增加，其中模型组最为明显，西药组次之，中药组最轻。控制肾脏肥大、减轻GBM增厚以及抑制系膜增生，是止消通脉宁治疗糖尿病肾病的主要作用机制。
A Quantitative Analysis on Effects of ZhiXiaoTongMaiNing on Glomerular Morphologic Changes of Diabetes Rat
, 百拇医药
Wang Yaoxian Yuan Aihong Zhao Yan,et al.
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)
ABSTRACT:A diabetes rat model was establisbed by intraperitoneal injection of streptozotocin.Observe the effects of Zhixiaotongmaining on the glomerular morphologic changes. The results show that: Compared to the normal control group, there are markedly increase of glomerular basement membrane width (GBMW), average mesentery area [
(M)], average glomeruluar sectional area,[(G)], glomerular diameter [D(G)] and volume [V(G)] in the deabetes group, among which the model group is most remarkable, the western medicine group is second to it and the Chinese medicine group is the lest remarkable. So controlling nephrohypertrophy, modifying GBM widening and inhibiting mesentery proliferation are the main mechanism of action.
, 百拇医药
KEY WORDS:Zhixiaotongmaining; Experimental diabetes; Glomerular morphology; Quantitative analysis; Rats
止消通脉宁具有益气养阴、消积散瘀、活血通脉等功效，临床主要用于治疗糖尿病肾病，但其治疗机制尚未完全清楚。本研究应用形态定量学方法观察止消通脉宁对实验性糖尿病大鼠肾小球形态学的影响，以探讨其对肾脏的保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康雄性纯种SD大鼠，体重(180±5)g,由北京市实验动物中心提供。
1.2 实验药品
止消通脉宁醇提剂(每mL含生药2g)，由北京中医药大学中药学院制剂室制备；糖适平(30mg/片)，北京第六制药厂生产；洛丁新(10mg/片)，北京诺华制药有限公司生产。
, http://www.100md.com
1.3 模型制备
用0.1mmol/L枸橼缓冲液(pH 4.0，4℃)将链脲佐菌素(STZ)配成2%的溶液，以50mg/kg剂量腹腔注射；正常对照组仅给等量缓冲液。72h后，测定空腹血糖为13～25mmol/L者列入观察。
1.4 实验分组
大鼠注射STZ 3d后即分为模型组、中药治疗组、西药治疗组和正常对照组。中药治疗组予止消通脉宁按生药30g/(kg.d)灌胃，西药治疗组予糖适平15mg/(kg.d)、洛丁新1.5mg/(kg.d)灌胃，正常对照组、模型组不做任何处理，均予普通饲料、自由饮水。
1.5 标本制作及观察
, 百拇医药
1.5.1 光镜观察：实验第16周末大鼠处死后取肾，置10%Formalin固定液中固定，酒精逐级脱水，透明，包埋，切片3～4μm，染色(HE、PAM-Masson)，光镜下观察。
1.5.2 电镜观察：取肾皮质修成0.5mm3小块，用2.5%戊二醛前固定，10%锇酸后固定，梯度乙醇脱水，环氧树脂Epon 812包埋，切片厚度为80nm，醋酸铀与枸橼酸铅双重染色，透射电镜下观察。每份标本在电镜下拍摄10个视野，以每张图片中肾小球毛细血管基膜(GBM)最宽处作为测量部位，取10张图片的平均值为每例动物GBM的厚度值。
1.5.3 图像分析方法：将经PAM-Masson染色的肾组织切片置于连有CmIAS97A型图像分析系统的生物显微镜下，测定肾小球平均截面积[(G)]、系膜区平均面积[(M)]、肾小球直径[D(G)]，再根据公式V(G)=1.25×3/2(G)，计算肾小球体积[V(G)][1]。光学放大倍数为400，每侧肾组织测定30个肾小球得一均值。
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1.6 统计学分析
所有数据以
±s表示，组间差异用t检验。
2 结果
2.1 肾小球形态学改变
在光镜下观察，模型组大鼠肾小球系膜细胞增生，系膜区增宽，基质增生、硬化，GBM弥漫性增厚，有的肾小球毛细血管襻周缘部分出现嗜伊红的蛋白物质沉积。肾小管上皮细胞内有糖原沉积，管腔可见大量蛋白管型。电镜下可见肾小球上皮细胞足突断裂、融合及微绒毛，系膜细胞增生，系膜区出现基膜样物质，GBM呈不均匀性增厚。中、西药治疗组也有类似的改变，但病变较轻。
2.2 系膜区平均面积和肾小球平均截面积
图像分析发现，各组糖尿病大鼠(M)、(G)及(M)/(G)与正常对照组比较，均有极显著性差异(P<0.01)。其中模型组系膜增宽程度最重，中、西药治疗组次之，以中药组为最轻。见表1。
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表1 各组大鼠(M)、(G)、(M)/(G)的变化 (±s) 组 别
n(M)/μm2(G)/μm2(M)/(G)/%
, 百拇医药
正常对照组
6
408.9±24.8
5090.3±212.7
8.07±0.78
模 型 组
8
957.1±52.2**
6381.6±248.5**
15.02±1.24**
中 药 组
, 百拇医药
8
588.7±32.9**△△
5585.4±235.6**△△
10.60±1.01**△△
西 药 组
8
660.7±27.5**△△
5983.1±237.6**△
11.05±0.85**△△
注：与正常组比*P<0.05 **P<0.01; 与模型组比△P<0.05 △△P<0.01
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2.3 肾小球毛细血管基膜厚度(GBMW)
经电镜观察发现，各组糖尿病大鼠较正常对照组GBM显著增厚，而其中模型组和西药治疗组增厚最明显，中药治疗组较轻。中药组与西药组相比，经统计学处理有显著性差异(P<0.05)。GBMW具体测量结果见表2。
2.4 肾小球直径和肾小球体积
糖尿病大鼠肾小球除形态学发生改变外，肾小球直径、体积均较正常对照组明显增大。中、西药治疗组肾小球增大程度次于模型组，中药组又明显小于西药组(P<0.05)。见表2。
表2 各组大鼠GBMW、D(G)、V(G)的变化 (±s) 组 别
n
, 百拇医药
GBMW/nm
D(G)/μm
V(G)/103μm3
正常对照组
6
143.2±6.9
80.6±1.62
455.8±27.3
模 型 组
8
237.3±19.3**
, http://www.100md.com
90.1±1.77**
637.7±36.9**
中 药 组
8
179.7±10.2**△△
84.6±1.40**△△
522.1±33.0**△△
西 药 组
8
198.4±14.7**△△
, 百拇医药
87.3±1.80**△△
578.7±34.5**△
注：与正常组比*P<0.05 ** P<0.01；与模型组比△P<0.05 △△P<0.01
3 讨论
肾脏病变是糖尿病(DM)常见的慢性合并症之一，糖尿病肾病(DN)已成为终末期肾病的第一位原因[2]。由于长期高血糖以及由之引起的代谢紊乱、微循环障碍、多种细胞因子分泌异常等，共同作用于肾脏，引起肾小球细胞外基质(ECM)增生，表现为肾小球肥大、系膜基质积聚、GBM增厚，最后导致肾小球硬化、闭塞。
我们认为，DM日久，气阴两虚，痰、郁、热、瘀阻滞络脉，肾之络脉肿胀瘀结，甚至闭塞不通，而成DN[3]。止消通脉宁系吕仁和教授经验方，是针对DN气阴两虚、络脉瘀结证型而设。方中黄芪、生地益气养阴，大黄、鬼箭羽等化瘀通络、消肿散结，诸药合用具有益气养阴、化瘀散结作用，适用于DN早期。
, http://www.100md.com
本研究证实，止消通脉宁对实验性DM大鼠肾脏病变具有以下影响：①控制肾脏肥大。肾脏肥大是早期DN的主要病理特征，能否控制肾脏肥大是对DN有无疗效的一个标志[4]。本实验结果显示，止消通脉宁能抑制肾小球体积增大，从而起到抑制肾脏肥大的作用。②减轻GBM增厚、抑制系膜增生。GBM增厚、系膜基质扩张是DN特征性病理改变，也是引起临床蛋白尿与进行性肾功能衰竭的重要因素。本实验结果显示，止消通脉宁能够减轻GBM增厚、抑制系膜增生，从而延缓DM发生肾脏损害的病理过程。
显而易见，止消通脉宁是通过控制肾脏肥大、延缓GBM增厚以及抑制系膜增生而对DN起治疗作用的，至于其更深入的机制，我们正从分子生物学水平研究。
*“九五”国家科技攻关项目
作者简介：王耀献，男，33岁，在读医学博士生，主治医师
参考文献
, 百拇医药
1 Rudolf W, Mauer M, David ER, et al. Mean glomerular volume and rate of development of diabetes nephropathy. Diabetes，1989，38:1142
2 Ritz E, Stefanski A.Diabetic nephropathy in type Ⅱ diabetes. Am J Kidney Dis，1996，27:167
3 吕仁和，高彦彬，易京红，等.止消通脉饮治疗糖尿病微血管病变的临床研究.北京中医药大学学报，1996，19(5)：25～28
4 杨俊伟，黎磊石.大黄对实验性糖尿病大鼠肾脏肥大及高滤过作用的影响.中国中西医结合杂志,1993，13(5)：286～287
(收稿日期：1998-11-20), http://www.100md.com
单位：北京中医药大学 北京100029
关键词：止消通脉宁；实验性糖尿病；肾小球形态；定量分析；大鼠
北京中医药大学学报990407 摘要：采用链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立糖尿病大鼠模型，观察中药复方止消通脉宁对其肾小球形态学的影响。结果表明：与正常对照组相比，各组糖尿病大鼠肾小球毛细血管基底膜厚度(GBMW)、系膜区平均面积[A(M)]、肾小球平均截面积[A(G)]、肾小球直径[D(G)]和肾小球体积[V(G)]均显著增加，其中模型组最为明显，西药组次之，中药组最轻。控制肾脏肥大、减轻GBM增厚以及抑制系膜增生，是止消通脉宁治疗糖尿病肾病的主要作用机制。
A Quantitative Analysis on Effects of ZhiXiaoTongMaiNing on Glomerular Morphologic Changes of Diabetes Rat
, 百拇医药
Wang Yaoxian Yuan Aihong Zhao Yan,et al.
(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)
ABSTRACT:A diabetes rat model was establisbed by intraperitoneal injection of streptozotocin.Observe the effects of Zhixiaotongmaining on the glomerular morphologic changes. The results show that: Compared to the normal control group, there are markedly increase of glomerular basement membrane width (GBMW), average mesentery area [
(M)], average glomeruluar sectional area,[(G)], glomerular diameter [D(G)] and volume [V(G)] in the deabetes group, among which the model group is most remarkable, the western medicine group is second to it and the Chinese medicine group is the lest remarkable. So controlling nephrohypertrophy, modifying GBM widening and inhibiting mesentery proliferation are the main mechanism of action., 百拇医药
KEY WORDS:Zhixiaotongmaining; Experimental diabetes; Glomerular morphology; Quantitative analysis; Rats
止消通脉宁具有益气养阴、消积散瘀、活血通脉等功效，临床主要用于治疗糖尿病肾病，但其治疗机制尚未完全清楚。本研究应用形态定量学方法观察止消通脉宁对实验性糖尿病大鼠肾小球形态学的影响，以探讨其对肾脏的保护作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物
健康雄性纯种SD大鼠，体重(180±5)g,由北京市实验动物中心提供。
1.2 实验药品
止消通脉宁醇提剂(每mL含生药2g)，由北京中医药大学中药学院制剂室制备；糖适平(30mg/片)，北京第六制药厂生产；洛丁新(10mg/片)，北京诺华制药有限公司生产。
, http://www.100md.com
1.3 模型制备
用0.1mmol/L枸橼缓冲液(pH 4.0，4℃)将链脲佐菌素(STZ)配成2%的溶液，以50mg/kg剂量腹腔注射；正常对照组仅给等量缓冲液。72h后，测定空腹血糖为13～25mmol/L者列入观察。
1.4 实验分组
大鼠注射STZ 3d后即分为模型组、中药治疗组、西药治疗组和正常对照组。中药治疗组予止消通脉宁按生药30g/(kg.d)灌胃，西药治疗组予糖适平15mg/(kg.d)、洛丁新1.5mg/(kg.d)灌胃，正常对照组、模型组不做任何处理，均予普通饲料、自由饮水。
1.5 标本制作及观察
, 百拇医药
1.5.1 光镜观察：实验第16周末大鼠处死后取肾，置10%Formalin固定液中固定，酒精逐级脱水，透明，包埋，切片3～4μm，染色(HE、PAM-Masson)，光镜下观察。
1.5.2 电镜观察：取肾皮质修成0.5mm3小块，用2.5%戊二醛前固定，10%锇酸后固定，梯度乙醇脱水，环氧树脂Epon 812包埋，切片厚度为80nm，醋酸铀与枸橼酸铅双重染色，透射电镜下观察。每份标本在电镜下拍摄10个视野，以每张图片中肾小球毛细血管基膜(GBM)最宽处作为测量部位，取10张图片的平均值为每例动物GBM的厚度值。
1.5.3 图像分析方法：将经PAM-Masson染色的肾组织切片置于连有CmIAS97A型图像分析系统的生物显微镜下，测定肾小球平均截面积[
(G)]、系膜区平均面积[(M)]、肾小球直径[D(G)]，再根据公式V(G)=1.25×3/2(G)，计算肾小球体积[V(G)][1]。光学放大倍数为400，每侧肾组织测定30个肾小球得一均值。, http://www.100md.com
1.6 统计学分析
所有数据以
±s表示，组间差异用t检验。2 结果
2.1 肾小球形态学改变
在光镜下观察，模型组大鼠肾小球系膜细胞增生，系膜区增宽，基质增生、硬化，GBM弥漫性增厚，有的肾小球毛细血管襻周缘部分出现嗜伊红的蛋白物质沉积。肾小管上皮细胞内有糖原沉积，管腔可见大量蛋白管型。电镜下可见肾小球上皮细胞足突断裂、融合及微绒毛，系膜细胞增生，系膜区出现基膜样物质，GBM呈不均匀性增厚。中、西药治疗组也有类似的改变，但病变较轻。
2.2 系膜区平均面积和肾小球平均截面积
图像分析发现，各组糖尿病大鼠
(M)、(G)及(M)/(G)与正常对照组比较，均有极显著性差异(P<0.01)。其中模型组系膜增宽程度最重，中、西药治疗组次之，以中药组为最轻。见表1。, http://www.100md.com
表1 各组大鼠
(M)、(G)、(M)/(G)的变化 (±s) 组 别n
(M)/μm2(G)/μm2(M)/(G)/%, 百拇医药
正常对照组
6
408.9±24.8
5090.3±212.7
8.07±0.78
模 型 组
8
957.1±52.2**
6381.6±248.5**
15.02±1.24**
中 药 组
, 百拇医药
8
588.7±32.9**△△
5585.4±235.6**△△
10.60±1.01**△△
西 药 组
8
660.7±27.5**△△
5983.1±237.6**△
11.05±0.85**△△
注：与正常组比*P<0.05 **P<0.01; 与模型组比△P<0.05 △△P<0.01
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2.3 肾小球毛细血管基膜厚度(GBMW)
经电镜观察发现，各组糖尿病大鼠较正常对照组GBM显著增厚，而其中模型组和西药治疗组增厚最明显，中药治疗组较轻。中药组与西药组相比，经统计学处理有显著性差异(P<0.05)。GBMW具体测量结果见表2。
2.4 肾小球直径和肾小球体积
糖尿病大鼠肾小球除形态学发生改变外，肾小球直径、体积均较正常对照组明显增大。中、西药治疗组肾小球增大程度次于模型组，中药组又明显小于西药组(P<0.05)。见表2。
表2 各组大鼠GBMW、D(G)、V(G)的变化 (
±s) 组 别n
, 百拇医药
GBMW/nm
D(G)/μm
V(G)/103μm3
正常对照组
6
143.2±6.9
80.6±1.62
455.8±27.3
模 型 组
8
237.3±19.3**
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90.1±1.77**
637.7±36.9**
中 药 组
8
179.7±10.2**△△
84.6±1.40**△△
522.1±33.0**△△
西 药 组
8
198.4±14.7**△△
, 百拇医药
87.3±1.80**△△
578.7±34.5**△
注：与正常组比*P<0.05 ** P<0.01；与模型组比△P<0.05 △△P<0.01
3 讨论
肾脏病变是糖尿病(DM)常见的慢性合并症之一，糖尿病肾病(DN)已成为终末期肾病的第一位原因[2]。由于长期高血糖以及由之引起的代谢紊乱、微循环障碍、多种细胞因子分泌异常等，共同作用于肾脏，引起肾小球细胞外基质(ECM)增生，表现为肾小球肥大、系膜基质积聚、GBM增厚，最后导致肾小球硬化、闭塞。
我们认为，DM日久，气阴两虚，痰、郁、热、瘀阻滞络脉，肾之络脉肿胀瘀结，甚至闭塞不通，而成DN[3]。止消通脉宁系吕仁和教授经验方，是针对DN气阴两虚、络脉瘀结证型而设。方中黄芪、生地益气养阴，大黄、鬼箭羽等化瘀通络、消肿散结，诸药合用具有益气养阴、化瘀散结作用，适用于DN早期。
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本研究证实，止消通脉宁对实验性DM大鼠肾脏病变具有以下影响：①控制肾脏肥大。肾脏肥大是早期DN的主要病理特征，能否控制肾脏肥大是对DN有无疗效的一个标志[4]。本实验结果显示，止消通脉宁能抑制肾小球体积增大，从而起到抑制肾脏肥大的作用。②减轻GBM增厚、抑制系膜增生。GBM增厚、系膜基质扩张是DN特征性病理改变，也是引起临床蛋白尿与进行性肾功能衰竭的重要因素。本实验结果显示，止消通脉宁能够减轻GBM增厚、抑制系膜增生，从而延缓DM发生肾脏损害的病理过程。
显而易见，止消通脉宁是通过控制肾脏肥大、延缓GBM增厚以及抑制系膜增生而对DN起治疗作用的，至于其更深入的机制，我们正从分子生物学水平研究。
*“九五”国家科技攻关项目
作者简介：王耀献，男，33岁，在读医学博士生，主治医师
参考文献
, 百拇医药
1 Rudolf W, Mauer M, David ER, et al. Mean glomerular volume and rate of development of diabetes nephropathy. Diabetes，1989，38:1142
2 Ritz E, Stefanski A.Diabetic nephropathy in type Ⅱ diabetes. Am J Kidney Dis，1996，27:167
3 吕仁和，高彦彬，易京红，等.止消通脉饮治疗糖尿病微血管病变的临床研究.北京中医药大学学报，1996，19(5)：25～28
4 杨俊伟，黎磊石.大黄对实验性糖尿病大鼠肾脏肥大及高滤过作用的影响.中国中西医结合杂志,1993，13(5)：286～287
(收稿日期：1998-11-20), http://www.100md.com