大黄酸对系膜细胞葡萄糖摄入的影响及其机制*
作者：章 精△ 刘志红 李颖健 刘 浩 黎磊石
单位：南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所(南京，210002)
关键词：大黄酸；葡萄糖转运蛋白1；转化生长因子β1
肾脏病与透析肾移植杂志990401 摘 要 目的：研究大黄酸对系膜细胞萄萄糖摄入的影响，探讨大黄酸拮抗糖尿病肾脏代谢异常的可能机制。 方法：选用体外培养的小鼠肾小球系膜细胞，葡萄糖摄入及其动力学的测定采用2-deoxy-[3H]-D-glucose摄入法，葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1，GLUT 1)mRNA表达的检测采用Northern印迹。 结果：大黄酸对正常培养条件下系膜细胞的葡萄糖摄入及动力学没有明显影响，对于TGF-β1所引起的系膜细胞葡萄糖摄入的异常增加却有明显的抑制作用，其作用呈剂量依赖效应。动力学研究显示TGF-β1对系膜葡萄糖摄入Km和Vmax的影响都可以被大黄酸所拮抗。mRNA检测则表明大黄酸抑制TGF-β1增加系膜细胞GLUT 1表达的效应。 结论：大黄酸能通过影响GLUT 1的表达及其对萄萄糖的亲和力，明显抑制TGF-β1所引起的系膜细胞萄萄糖摄入的异常增高。
, 百拇医药
EFFECT OF RHEIN ON GLUCOSE UPTAKE IN GLOMERULAR MESANGIAL CELLS AND THE STUDY OF ITS UNDERLYING MECHANISM
Zhang Jing，Liu Zhihong，Liu Hao，Li Yingjian，Li Leishi
Research Institute of Nephrology，Jinling Hospital，Nanjing University School of Medicine，Nanjing 210002
OBJECTIVE To explore the effect of rhein on glucose uptake in mesangial cells and the possible molecular mechanism.
, 百拇医药
METHODOLOGY Cultured mouse mesangial cells were used in the study.The expression of GLUT1 mRNA was detected by northern blot；glucose uptake and its kinetics were determined by 2-Deoxy-[3H]-D-glucose uptake assay.
RESULTS Rhein had no effect on glucose uptake and its kinetics in mesangial cells cultured in normal glucose concentration.But it could antagonize the effect of TGF-β1 on glucose uptake and its Km and Vamx in mesangial cells，and it also suppressed the upregulation of GLUT1 mRNA stimulated by TGF-β1 in mesangial cells.
, 百拇医药
CONCLUSION Rhein is capable to antagonize the effect of TGF-β1 on glucose uptake in mesangial cells by suppressing the expression and function of GLUT1.
Key words rhein glucose transporter-1 TGF-β1
尽管良好的血糖控制可以有效预防和延缓糖尿病肾病的发生与发展，但在一些长期血糖控制良好的患者中仍然出现糖尿病肾脏损害，因此控制血糖并不能完全缓解肾脏的代谢异常状态[1～2]。
Heilig等人最近的研究表明，除了高糖外，系膜细胞葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1，GLUT 1)表达与功能的上调同样可以引起系膜细胞葡萄糖摄入的异常增加，进而导致细胞外基质合成增加[3～7]。我们以往的研究已经证实，高糖本身并不能刺激系膜细胞葡萄糖摄入的增加，相反，转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)通过上调系膜细胞GLUT 1的表达与功能，明显增加系膜细胞的葡萄糖摄入，而且该作用并不依赖于高血糖的存在[8]。抑制TGF-β1介导的GLUT 1在系膜细胞的过度表达与活化，是预防与治疗糖尿病肾病的重要途径。
, 百拇医药
大黄酸(rhein 4，5 dihydroxyanthraquinone-2-carboxylic acid)是中药大黄的一种主要成份，动物实验表明，中药大黄及其提取物大黄酸虽然对血糖没有明显影响，但可以抑制糖尿病大鼠肾脏的高代谢，明显减少尿蛋白，控制肾脏的肥大，其作用机制尚不清楚[9，10]。体外实验显示，大黄酸可以抑制肿瘤细胞葡萄糖的摄入，影响其能量供应[11，12]，而且大黄酸对系膜细胞的增殖也有抑制作用。
为了研究大黄酸对糖尿病状态下系膜细胞糖代谢可能的影响，我们分别观察了大黄酸对正常培养条件下和TGF-β1刺激下，系膜细胞葡萄糖摄入的影响并对其机制进行了初步探讨。
1 材料和方法
1.1 材料 大黄酸由本研究所从中药大黄中提取，纯度大于95%；DMEM购自Sigma公司；小牛血清购自四季青生物工程研究所；TGF-β1购自Promega公司；GLUT 1 cDNA探针由美国华盛顿大学 Mueckler 博士惠赠[13]；随机引物标记试剂盒来自 Promega 公司；2-Deoxy-[3H]-D-Glucose 购自 Amersham 公司。
, 百拇医药
1.2 系膜细胞培养 本实验采用的系膜细胞是从四周龄C57B 1/6J×SJL/J小鼠肾小球分离克隆的系膜细胞系[14]。所有实验均控制在25～35代细胞中进行。细胞在DMEM培养液中培养传代(20%小牛血清)。
1.3 RNA提取与Northern印迹 选70%融合的系膜细胞，用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA，取30μg RNA在含2.2 mol/L甲醛的1%琼脂糖中电泳，毛细管法转印至尼龙膜上，80℃固定2h，在预杂交液(5×SSPE，50%甲酰胺，5×Denhardt，0.1%SDS，100 mg/L鲑鱼精DNA)中42℃预杂交4h，在含32P标记cDNA探针的杂交液(5×SSPE，50%甲酰胺，0.1%SDS，100 mg/L鲑鱼精DNA)中42℃杂交18h，2×SSC，0.1%SDS溶液室温洗三次，0.2×SSC，0.1%SDS溶液55℃洗一次，对X光片-70℃曝光48h[15]。GLUT 1探针标记采用随机引物法。
, 百拇医药
1.4 系膜细胞葡萄糖摄入测定 系膜细胞接种24孔板中生长至70%融合，弃培养液，用20 mmol/L HEPES(140 mmol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl，2.5 mmol/L MgSO4，20 mmol/LHEPES，0.1%BSA，pH 7.4)洗三次，加入1 ml含1 μCi/ml 2-Deoxy-[3H]-D-Glucose的HEPES液，37℃30min，PBS洗三次，加1 mol/L NaOH作用2h，盐酸中和至中性，加闪烁液5 ml，液闪仪计数其每分钟衰变数(dpm)。蛋白质浓度测定采用考马斯亮兰G250法[16]。
1.5 系膜细胞葡萄糖摄入动力学测定 系膜细胞生长至亚融合，弃培养液，用20 mmol/L HEPES洗三次，每孔加入 1 μCi/ml 2-Deoxy-[3H]-D-Glucose，然后再分别加入含0.25、0.33、0.5、1、5、10(mmol/L)非标记的2-Deoxy-D-Glucose HEPES液1ml，用上述方法测定葡萄糖摄入。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 大黄酸对生理葡萄糖浓度培养条件下系膜细胞葡萄糖摄入及其动力学的影响 系膜细胞在生理葡萄糖浓度培养条件下生长至亚融合状态，分别加50 mg/L和25mg/L的大黄酸培养24 h，发现大黄酸对系膜细胞葡萄糖摄入无明显影响(图1)。进一步研究50 mg/L大黄酸作用 24 h对系膜细胞萄萄糖摄入动力学的影响，发现米氏常数(Km)值[对照0.23 mmol/L，大黄酸0.24 mmol/L)和葡萄糖最大摄入率(Vmax)值[对照759 nmol/(mg prot.h)，大黄酸761 nmol/(mg prot.h)]都无明显变化(图2)。
图1 大黄酸对生理葡萄糖浓度培养条件下系膜细胞葡萄糖摄入的影响
选择在DMEM-20%血清中培养的小鼠系膜细胞为对照，观察25 mg/L大黄酸(R25)和50 mg/L大黄酸(R50)处理24h后系膜细胞的糖摄入，差异不明显。
, http://www.100md.com
对照组 Km＝0.23mmol/L Vmax＝759nmol/(mg prot.h)
50mg/L
大黄酸 Km＝0.24mmol/L Vmax＝761nmol/(mg prot.h)
图2 大黄酸对生理葡萄糖浓度培养条件下系膜细胞葡萄糖摄入动力学的影响
选择在DMEM-20%血清中培养的小鼠系膜细胞为对照(MC)，测定50 mg/L大黄酸(MCR)处理24h后系膜细胞的葡萄糖摄入动力学，差异不明显。
2.2 大黄酸对TGF-β1增加肾小球系膜细胞葡萄糖摄入的影响 为了研究大黄酸对TGF-β1作用的影响，我们在加入2 μg/L TGF-β1的同时分别加入20 mg/L和50 mg/L的大黄酸，结果发现，系膜细胞经1%血清处理24h后，用2 μg/L TGF-β1刺激10h，系膜细胞葡萄糖摄入增加4.83倍，而大黄酸显著抑制TGF-β1对肾小球系膜细胞萄萄糖摄入的上调作用，加入2 μg/L TGF-β1的同时加入50 mg/L的大黄酸，系膜细胞葡萄糖摄入仅比对照增加1.55倍。(图3)
, 百拇医药
图3 大黄酸对TGF-β1增加肾小球系膜细胞葡萄糖摄入的影响
选择DMEM-1%血清中培养的系膜细胞为对照，观察2 μg/L TGF-β1作用10 h(T)，及2 μg/L TGF-β1再分别加20 mg/L大黄酸(T+R20)和50 mg/L大黄酸(T+R50)作用10h后系膜细胞糖摄入，发现50 mg/L大黄酸可以拮抗TGF-β1的作用。
2.3 TGF-β1和大黄酸对系膜细胞萄萄糖摄入动力学的影响 系膜细胞经1%血清处理24 h后，用2 μg/L TGF-β1刺激10 h，发现细胞葡萄糖摄入Km值降低，而50 mg/L大黄酸可以部分拮抗Km值的降低(对照组 Km＝1.24 mmol/L，2 μg/L TGF-β1 Km＝0.47 mmol/L，2 μg/L TGF-β1+50 mg/L Rhein Km＝0.57 mmol/L)；同时细胞葡萄糖摄入 Vmax 值升高，而50 mg/L大黄酸对 Vmax 值增加也有抑制作用[对照组 Vmax＝272 nmol/(mg prot.h)，2 μg/L TGF-β1 Vmax＝405 nmol/(mg prot.h)，2 μg/L TGF-β1+50 mg/L Rhein Vmax＝320 nmol/(mg prot.h)]。(图4)
, 百拇医药
对照组 Km＝1.24mmol/L Vmax＝272nmol/(mg prot.h)
2μg/L TGF-β1(T)
Km＝0.47mmol/L Vmax＝405nmol/(mg prot.h)
2μg/L TGF-β1+50mg/L Rhein(T+R)
Km＝0.57mmol/L Vmax＝320nmol/(mg prot.h)
图4 TGF-β1和大黄酸对系膜细胞葡萄糖摄入动力学影响的双倒数分析
选择DMEM-1%血清中培养的系膜细胞为对照，分别用2 μg/L TGF-β1(T)和2 μg/L TGF-β1再加50 mg/L Rhein(T+R)作用10h，测定系膜细胞糖摄入，并分析其动力学。
, 百拇医药
2.4 大黄酸对TGF-β1增加肾小球系膜细胞GLUT1 mRNA表达的影响 进一步研究大黄酸拮抗TGF-β1的机制，发现50 mg/L大黄酸明显抑制TGF-β1增加GLUT1 mRNA表达的作用。(图5)
图5 GLUT1 mRNA Northern分析
选择DMEM-1%血清中培养的系膜细胞为对照(泳道1)，观察2 μg/L TGF-β1作用10h(泳道2)，及2 μg/L TGF-β1再加50 mg/L大黄酸(泳道3)作用10h后系膜细胞GLUT1 mRNA表达量的变化，发现50 mg/L大黄酸可以抑制TGF-β1对GLUT1 mRNA的上调作用。
3 讨 论
葡萄糖是维持细胞能量代谢和生命活动的重要原料，小肠吸收或肝脏产生的萄萄糖通过血液流向体内各个器官和组织，提供能源和其它碳水化合物的最初前体。葡萄糖是一种极性分子不能以自由扩散的方式通过细胞膜脂双层结构的疏水区，除了小肠和肾小管可以通过主动运输方式吸收葡萄糖外，其它组织的细胞都必须通过细胞膜上的一类葡萄糖转运蛋白来摄入葡萄糖[17，18]。葡萄糖转运蛋白是细胞膜上的跨膜糖蛋白，介导细胞内外的葡萄糖以
, 百拇医药
易化扩散的方式相互转运。到目前为止已经发现了六种葡萄糖转运蛋白，按发现的先后顺序分别命名为葡萄糖转运蛋白1，2，3，4，5和7。不同的组织和细胞依据其在机体代谢中所扮演的不同角色，而具有不同类型的葡萄糖转运蛋白。GLUT1是一种分子量 55 000的葡萄糖高亲和性的转运蛋白，负责细胞基础代谢，广泛分布于各种组织中，一般不受控于胰岛素的调节[19]。
系膜细胞细胞外基质(ECM)合成异常增加所引起的系膜区病变是糖尿病肾病重要病理特征，高糖可以直接刺激系膜细胞ECM产生增多[20]，但机制不详。目前认为，在糖尿病的情况下，系膜细胞糖摄入增加，由此而引发了细胞内一系列异常改变的发生以及ECM的堆积。GLUT1是系膜细胞上主要的葡萄糖转运体，它对葡萄糖具高亲和性并能在生理葡萄糖浓度(5 mmol/L左右)下接近饱和[21]，因此其表达量及功能的改变是系膜细胞糖摄入增加的关键。利用基因转染技术将GLUT1基因导入体外培养的系膜细胞，结果这种大量表达CLUT1的系膜细胞在生理糖浓度下出现糖代谢增加、细胞肥大、ECM合成增加等类似糖尿病情况下出现的病理改变[4]，进一步证实了GLUT1在糖尿病肾病发病中的作用。
, 百拇医药
我们以往的研究已经证实高糖抑制系膜细胞GLUT1的表达与功能，相反TGF-β1不仅在生理糖浓度下上调GLUT1的表达与功能，而且在生理糖浓度下和高糖下增加系膜细胞葡萄糖摄入的作用无明显差别。这说明在糖尿病系膜细胞糖代谢异常中TGF-β1具有重要的作用，而在血糖控制良好的糖尿病肾病患者中它的作用可能尤为重要。因此拮抗TGF-β1对细胞GLUT1的作用有可能阻断或削弱TGF-β1在糖尿病肾病发病中的作用[22]。
本实验室大量的实验研究表明，中药大黄提取物大黄酸可以抑制糖尿病大鼠的高代谢[9，23]，临床研究也表明，大黄酸可以减轻早期糖尿病肾病患者的白蛋白尿。国外有关大黄酸对肿瘤细胞作用的研究表明，大黄酸可以通过抑制葡萄糖的摄入，影响肿瘤细胞异常增高的糖代谢和氧耗量[10，11]。大黄酸的上述作用是否是通过影响GLUT1的表达与功能完成的，大黄酸能不能纠正TGF-β1所引起的系膜细胞代谢异常呢?
, http://www.100md.com
本实验研究表明，大黄酸对在正常糖浓度培养条件下的小鼠系膜细胞的葡萄糖摄入没有明显影响，而且不影响正常糖浓度下系膜细胞葡萄糖摄入动力学。但对于TGF-β1所引起的系膜细胞葡萄糖摄入的异常增加，大黄酸却有明显的抑制作用，其作用呈剂量依赖效应。动力学研究显示，TGF-β1对系膜葡萄糖摄入Km和Vmax的影响都可以被大黄酸所拮抗，因此大黄酸不仅能够抑制GLUT1对葡萄糖亲和力的增加，还能拮抗系膜细胞GLUT1的表达量。对mRNA表达的研究进一步证实，大黄酸可以拮抗TGF-β1对系膜细胞GLUT1表达的上调作用。大黄酸对于葡萄糖转运系统广泛的作用提示，大黄酸并不直接作用于葡萄糖转运系统的某个环节，而是作用于葡萄糖转运系统的调控系统。
尽管TGF-β1信号转导系统的研究目前并没有很大的进展，但普遍认为TGF-β的信号转导系统与其它生长因子有着很大的不同，TGF-β1受体具有非常特别的丝氨酸/苏氨酸激酶活性，而且它是TGF-β信号转导所必需的[24]。TGF-β1对细胞GLUT 1的表达及细胞糖摄入的作用与其它生长因子表现出明显的协同效应，而且TGF-β1对细胞糖摄入与糖酵解作用需要EGF受体激酶系统的活化[25，26]。TGF-β1和PDGF、FGF等生长因子都可以增加细胞GLUT 1的表达量，但只有TGF-β1能够影响GLUT 1的糖基化增加对葡萄糖的亲合力[27]，PDGF、FGF等生长因子对细胞葡萄糖摄入的Km值没有明显影响[28]。
, http://www.100md.com
目前已在GLUT1基因5′端非翻译区的启动子中发现了佛波酯反应元件(phorbol ester responsive element)，细胞原癌基因的活化可以促进GLUT1的表达，但单纯抑制细胞蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的活性并不能阻止生长因子对GLUT1表达的促进作用，细胞GLUT1表达的调控受多种因素的共同调控[17～19]。系膜细胞GLUT1表达的调控机制目前还不清楚，在糖尿病状态下系膜细胞PKC与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase MAPK)的活性升高，这两种蛋白激酶可能进一步活化特定的转录因子，启动GLUT1的表达，而最新的研究结果表明，转录因子USF2a(upstream stimulating factor 2a)介导了糖尿病情况下系膜细胞GLUT1表达的异常增高[5，19，29，30]。
我们以往的实验发现大黄酸抑制系膜细胞的增殖，并使S期细胞比例明显下降，而对另一种大黄蒽醌类提取物大黄素的研究表明，大黄素抑制细胞PKC的活性以及c-myc原癌基因的表达[31，32]，大黄酸对系膜细胞的信号转导系统的影响，可能是其抑制TGF-β1对系膜细胞葡萄糖转运系统的影响以及系膜细胞增殖的主要途径。由于除TGF-β1之外其它生长因子并不影响GLUT 1对葡萄糖的亲合力[27，28]，大黄酸对TGF-β1刺激下系膜细胞葡萄糖摄入Km值的影响，表明它对TGF-β1信号系统作用的特异性。
, http://www.100md.com
很多学者认为，大黄酸可以直接抑制细胞线粒体的能量代谢并进而抑制细胞的蛋白质合成[33，34]，而且认为这会对肝脏细胞产生毒性[35]。但我们研究所对用大黄治疗的慢性肾衰患者的研究表明，大黄不会产生肝毒性，相反患者血浆白蛋白和转铁蛋白明显上升，营养状况改善[10，36]。这进一步说明中药大黄及其提取物大黄酸对机体的代谢并无直接影响，它们的作用可能是抑制在病理状态下活化的细胞内信号分子，并进而抑制了细胞代谢的异常增高。
本项研究发现，大黄酸能通过影响GLUT1的表达及其对葡萄糖的亲和力，而明显抑制TGF-β1所引起的系膜细胞葡萄糖摄入的异常增高。该结果为阐明大黄酸在防治糖尿病肾病的作用中奠定了基础。
*本课题为江苏省自然科学基金资助项目(BK97176)
作者简介：南京大学医学院博士研究生
, 百拇医药
参考文献
1 Reichard P，Nilsson BY，Rosenovist U.The effect of long-term intensive insulin treatment on the devlopment of microvascular complication of diabetes mellitus.N Engl J Med，1993，329：304
2 Pugliese G，Pricci F，Pesce C et al.Early，but not advanced，glomerulopathy is reversed by pancreatic islet transplants in experimental diabetic rats.Diabetes，1997，46：1198
3 Heilig CW，Concepcion LA，Riser BL et al.Overexpression of glucose transporters in rat mesangial cells cultured in a normal glucose milieu mimics diabetic phenotype.J Clin Invest，1995，96：1802
, http://www.100md.com
4 Heilig CW，Brosius FC，Henry DN.Glucose transporters of the glomerulus and the implincations for diabetic nephropathy.Kidney Int，1997，52：S91
5 Heilig CW，Liu Y，England RL et al.D-Glucose stimulates mesangial cell GLUT1 expression and basal and IGF-I-sensitive glucose uptake in rat mesangial cells.Diabetes，1997，46：1030
6 Inoki K，Haneda M，Maeda S et al.TGF-β1 stimulates glucose uptake by enhancing GLUT1 expression in mesangial cells.Kidney Int，1999，55：1704
, 百拇医药
7 Cortes P，Riser BL，Asano K et al.Effects of oral antihyperglycemic agents on extracellular matrix synthesis by mesangial cells.Kidney Int，1998，54：1985
8 章 精，刘志红，刘 浩等.高糖和TGF-β1对系膜细胞葡萄糖转运蛋白1表达与功能影响.中华肾脏病杂志(待发表).
9 杨俊伟，黎磊石，张 真.大黄治疗糖尿病肾病的实验研究.中华内分泌代谢杂志，1993，9：222
10 Li Leishi.End-stage renal disease in China.Kidney Int，1996，49：287
11 Floridi A，Castiglione S，Bianchi C et al.Effect of rhein on the glucose metablism of ehrlich ascites tumor cells.Biochem Pharmacol，1990，40：217
, http://www.100md.com
12 Castiglione S，Fanciulli M，Bruno T et al.Rhein inhibits glucose uptake in Ehrlich ascites tumor cells by alteration of membrane-associated functions，Anti-Cancer Drugs，1993，4：407
13 Mueckler MC，Caruso SA，Baldwin M et al.Sequence and structure of a human glucose transporter.Science，1985，229：941
14 Dio T，Vlassara H，Kirstein M et al.Receptor-specific increase in extracellular matrix production in mouse mesangial cells by advanced glycosylation end products is mediated via platelet-derived growth factor.Proc Natl Acad Sci USA，1992，89：2873
, 百拇医药
15 Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T et al.Molecular Cloning.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989
16 Wakisaka M，He Q，Spiro Mj et al.Glucose entry into rat mesangial cells is mediated by both Na+-coupled and facilitative transporters.Diabetologia，1995，38：291
17 Kahn BB.Facilitative glucose transporter：regulatory mechanism and dysregulation in dibetes.J Clin Invest，1992，89：1367
18 Klip A，Tsakiridis T，Marette A et al .Regulation of expression of glucose transporters by glucose：a review of studies in vivo and in cell cultures.FASEB J，1994，8：43
, http://www.100md.com
19 Mueckler M.Facilitative glucose transporters.Eur J Biochem，1994，219：713
20 Ayo S，Radnik R，Garoni J et al.High glucose causes an increase in extracellular matrix proteins in cultured mesangial cells.Am J Pathol，1990，136：1339
21 章 精，刘志红，陈朝红等.小鼠系膜细胞葡萄糖转运蛋白的鉴定及其功能研究.肾脏病与透析肾移植杂志，1998，7：212
22 Ziyadeh FN，Sharma K，Ericksen M et al.Stimulation of collagen gene expression and protein synthesis in murine mesangial cells by high glucose is mediated by autocrine activation of transforming growth factor β.J Clin Invest，1994，93：536
, 百拇医药
23 Yang Junwei，Li Leishi.Effects of rheum officinal on the renal hypertroy and hyperfiltration in the streptozotocin-induced diabetic rats.CJIM，1995，1：125
24 Ziyadeh FN，Han DC.Involvement of transforing growth factor-β and its receptros in the pathogenesis of diabetic nephropathy.Kidney Int，1997，52：S-7
25 Inman WH，Colowick SP.Stimulation of glucose uptake by transforming growth factor β：evidence for the requirement of epidermal growth factor-receptor activation.Proc Natl Acad Sci USA，1985，82：1346
, 百拇医药
26 Kitagawa T，Mtsuko M，Akamatsu Y.Transforming growth factor-β1 stimulates glucose uptake and the expression of glucose transporter mRNA in quiescent swiss mouse 3T3 cells.J Biol Chem，1991，266：18066
27 Masumi A，Akamatsu Y，Kitagawa T.Modulation of the synthesis and glycosylation of the glucose transporter protein by transforming growth factor-β1 in Swiss 3T3 fibroblasts.Biochim Biophys Acta，1993，1145：227
28 Kitagawa T，Tanaka M，Akamatsu Y.Regulation of glucose transport activty and expression of glucose transporter mRNA by serum，growth factors and phorbol ester in quiescent mouse fibroblasts.Biochim Biophys Acta，1989，980：100
, 百拇医药
29 Brosius FC，Qu X，Lin Z et al.Increased GLUT1 and extracellular glucose levels reduce mesangial cell MAP kinase and JNK activities.J Am Soc Nephrol，1998，8：629A
30 Heilig C，Ebina Y，Raymondjean M et al.Identification of potential transcription factors(IFs)for mediation of GLUT1 positive feedback in mesangial cells(MC).J Am Soc Nephrol，1998，8：632A
31 Yang Junwei，Li Leishi.Emodin act on protein kinase C activity to inhibit the accumulation of extracellular matrix in glomeruli from STZ-induced diabetic rats.Nephrol，1997，3(suppl)：S261
, http://www.100md.com
32 Liu Zhihong，Li Leishi，Hu Weixin et al.Effect of emodin on c-myc proto-oncongen expression in cultured rat mesangial cells.Acta Pharmacol Sinica，1996，17：61
33 Castiglione S，Paggi MG，Delpino A et al.Inhibition of protein synthesis in neoplastic cells by rhein.Biochem Pharmacol，1990，40：967
34 Delpino A，Paggi MG，Gentile PF et al.Protein synthetic activity and adenylate energy charge in Rhein-treated clutured human glioma cells.Cancer Biochem Biophys，1992，12：241
35 Bironaite D，Ollinger K.The hepatotoxicity of rhein involves impairment of mitochondrial functions.Chem Biol Interact，1997，103：35
36 Li Leishi.Rheum officinale：a new lead in preventing progression of chronic renal failure.Chin Med J，1996，109：35
(1999-06-20收稿), http://www.100md.com
单位：南京军区南京总医院 解放军肾脏病研究所(南京，210002)
关键词：大黄酸；葡萄糖转运蛋白1；转化生长因子β1
肾脏病与透析肾移植杂志990401 摘 要 目的：研究大黄酸对系膜细胞萄萄糖摄入的影响，探讨大黄酸拮抗糖尿病肾脏代谢异常的可能机制。 方法：选用体外培养的小鼠肾小球系膜细胞，葡萄糖摄入及其动力学的测定采用2-deoxy-[3H]-D-glucose摄入法，葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1，GLUT 1)mRNA表达的检测采用Northern印迹。 结果：大黄酸对正常培养条件下系膜细胞的葡萄糖摄入及动力学没有明显影响，对于TGF-β1所引起的系膜细胞葡萄糖摄入的异常增加却有明显的抑制作用，其作用呈剂量依赖效应。动力学研究显示TGF-β1对系膜葡萄糖摄入Km和Vmax的影响都可以被大黄酸所拮抗。mRNA检测则表明大黄酸抑制TGF-β1增加系膜细胞GLUT 1表达的效应。 结论：大黄酸能通过影响GLUT 1的表达及其对萄萄糖的亲和力，明显抑制TGF-β1所引起的系膜细胞萄萄糖摄入的异常增高。
, 百拇医药
EFFECT OF RHEIN ON GLUCOSE UPTAKE IN GLOMERULAR MESANGIAL CELLS AND THE STUDY OF ITS UNDERLYING MECHANISM
Zhang Jing，Liu Zhihong，Liu Hao，Li Yingjian，Li Leishi
Research Institute of Nephrology，Jinling Hospital，Nanjing University School of Medicine，Nanjing 210002
OBJECTIVE To explore the effect of rhein on glucose uptake in mesangial cells and the possible molecular mechanism.
, 百拇医药
METHODOLOGY Cultured mouse mesangial cells were used in the study.The expression of GLUT1 mRNA was detected by northern blot；glucose uptake and its kinetics were determined by 2-Deoxy-[3H]-D-glucose uptake assay.
RESULTS Rhein had no effect on glucose uptake and its kinetics in mesangial cells cultured in normal glucose concentration.But it could antagonize the effect of TGF-β1 on glucose uptake and its Km and Vamx in mesangial cells，and it also suppressed the upregulation of GLUT1 mRNA stimulated by TGF-β1 in mesangial cells.
, 百拇医药
CONCLUSION Rhein is capable to antagonize the effect of TGF-β1 on glucose uptake in mesangial cells by suppressing the expression and function of GLUT1.
Key words rhein glucose transporter-1 TGF-β1
尽管良好的血糖控制可以有效预防和延缓糖尿病肾病的发生与发展，但在一些长期血糖控制良好的患者中仍然出现糖尿病肾脏损害，因此控制血糖并不能完全缓解肾脏的代谢异常状态[1～2]。
Heilig等人最近的研究表明，除了高糖外，系膜细胞葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1，GLUT 1)表达与功能的上调同样可以引起系膜细胞葡萄糖摄入的异常增加，进而导致细胞外基质合成增加[3～7]。我们以往的研究已经证实，高糖本身并不能刺激系膜细胞葡萄糖摄入的增加，相反，转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)通过上调系膜细胞GLUT 1的表达与功能，明显增加系膜细胞的葡萄糖摄入，而且该作用并不依赖于高血糖的存在[8]。抑制TGF-β1介导的GLUT 1在系膜细胞的过度表达与活化，是预防与治疗糖尿病肾病的重要途径。
, 百拇医药
大黄酸(rhein 4，5 dihydroxyanthraquinone-2-carboxylic acid)是中药大黄的一种主要成份，动物实验表明，中药大黄及其提取物大黄酸虽然对血糖没有明显影响，但可以抑制糖尿病大鼠肾脏的高代谢，明显减少尿蛋白，控制肾脏的肥大，其作用机制尚不清楚[9，10]。体外实验显示，大黄酸可以抑制肿瘤细胞葡萄糖的摄入，影响其能量供应[11，12]，而且大黄酸对系膜细胞的增殖也有抑制作用。
为了研究大黄酸对糖尿病状态下系膜细胞糖代谢可能的影响，我们分别观察了大黄酸对正常培养条件下和TGF-β1刺激下，系膜细胞葡萄糖摄入的影响并对其机制进行了初步探讨。
1 材料和方法
1.1 材料 大黄酸由本研究所从中药大黄中提取，纯度大于95%；DMEM购自Sigma公司；小牛血清购自四季青生物工程研究所；TGF-β1购自Promega公司；GLUT 1 cDNA探针由美国华盛顿大学 Mueckler 博士惠赠[13]；随机引物标记试剂盒来自 Promega 公司；2-Deoxy-[3H]-D-Glucose 购自 Amersham 公司。
, 百拇医药
1.2 系膜细胞培养 本实验采用的系膜细胞是从四周龄C57B 1/6J×SJL/J小鼠肾小球分离克隆的系膜细胞系[14]。所有实验均控制在25～35代细胞中进行。细胞在DMEM培养液中培养传代(20%小牛血清)。
1.3 RNA提取与Northern印迹 选70%融合的系膜细胞，用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA，取30μg RNA在含2.2 mol/L甲醛的1%琼脂糖中电泳，毛细管法转印至尼龙膜上，80℃固定2h，在预杂交液(5×SSPE，50%甲酰胺，5×Denhardt，0.1%SDS，100 mg/L鲑鱼精DNA)中42℃预杂交4h，在含32P标记cDNA探针的杂交液(5×SSPE，50%甲酰胺，0.1%SDS，100 mg/L鲑鱼精DNA)中42℃杂交18h，2×SSC，0.1%SDS溶液室温洗三次，0.2×SSC，0.1%SDS溶液55℃洗一次，对X光片-70℃曝光48h[15]。GLUT 1探针标记采用随机引物法。
, 百拇医药
1.4 系膜细胞葡萄糖摄入测定 系膜细胞接种24孔板中生长至70%融合，弃培养液，用20 mmol/L HEPES(140 mmol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl，2.5 mmol/L MgSO4，20 mmol/LHEPES，0.1%BSA，pH 7.4)洗三次，加入1 ml含1 μCi/ml 2-Deoxy-[3H]-D-Glucose的HEPES液，37℃30min，PBS洗三次，加1 mol/L NaOH作用2h，盐酸中和至中性，加闪烁液5 ml，液闪仪计数其每分钟衰变数(dpm)。蛋白质浓度测定采用考马斯亮兰G250法[16]。
1.5 系膜细胞葡萄糖摄入动力学测定 系膜细胞生长至亚融合，弃培养液，用20 mmol/L HEPES洗三次，每孔加入 1 μCi/ml 2-Deoxy-[3H]-D-Glucose，然后再分别加入含0.25、0.33、0.5、1、5、10(mmol/L)非标记的2-Deoxy-D-Glucose HEPES液1ml，用上述方法测定葡萄糖摄入。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 大黄酸对生理葡萄糖浓度培养条件下系膜细胞葡萄糖摄入及其动力学的影响 系膜细胞在生理葡萄糖浓度培养条件下生长至亚融合状态，分别加50 mg/L和25mg/L的大黄酸培养24 h，发现大黄酸对系膜细胞葡萄糖摄入无明显影响(图1)。进一步研究50 mg/L大黄酸作用 24 h对系膜细胞萄萄糖摄入动力学的影响，发现米氏常数(Km)值[对照0.23 mmol/L，大黄酸0.24 mmol/L)和葡萄糖最大摄入率(Vmax)值[对照759 nmol/(mg prot.h)，大黄酸761 nmol/(mg prot.h)]都无明显变化(图2)。
图1 大黄酸对生理葡萄糖浓度培养条件下系膜细胞葡萄糖摄入的影响
选择在DMEM-20%血清中培养的小鼠系膜细胞为对照，观察25 mg/L大黄酸(R25)和50 mg/L大黄酸(R50)处理24h后系膜细胞的糖摄入，差异不明显。
, http://www.100md.com
对照组 Km＝0.23mmol/L Vmax＝759nmol/(mg prot.h)
50mg/L
大黄酸 Km＝0.24mmol/L Vmax＝761nmol/(mg prot.h)
图2 大黄酸对生理葡萄糖浓度培养条件下系膜细胞葡萄糖摄入动力学的影响
选择在DMEM-20%血清中培养的小鼠系膜细胞为对照(MC)，测定50 mg/L大黄酸(MCR)处理24h后系膜细胞的葡萄糖摄入动力学，差异不明显。
2.2 大黄酸对TGF-β1增加肾小球系膜细胞葡萄糖摄入的影响 为了研究大黄酸对TGF-β1作用的影响，我们在加入2 μg/L TGF-β1的同时分别加入20 mg/L和50 mg/L的大黄酸，结果发现，系膜细胞经1%血清处理24h后，用2 μg/L TGF-β1刺激10h，系膜细胞葡萄糖摄入增加4.83倍，而大黄酸显著抑制TGF-β1对肾小球系膜细胞萄萄糖摄入的上调作用，加入2 μg/L TGF-β1的同时加入50 mg/L的大黄酸，系膜细胞葡萄糖摄入仅比对照增加1.55倍。(图3)
, 百拇医药
图3 大黄酸对TGF-β1增加肾小球系膜细胞葡萄糖摄入的影响
选择DMEM-1%血清中培养的系膜细胞为对照，观察2 μg/L TGF-β1作用10 h(T)，及2 μg/L TGF-β1再分别加20 mg/L大黄酸(T+R20)和50 mg/L大黄酸(T+R50)作用10h后系膜细胞糖摄入，发现50 mg/L大黄酸可以拮抗TGF-β1的作用。
2.3 TGF-β1和大黄酸对系膜细胞萄萄糖摄入动力学的影响 系膜细胞经1%血清处理24 h后，用2 μg/L TGF-β1刺激10 h，发现细胞葡萄糖摄入Km值降低，而50 mg/L大黄酸可以部分拮抗Km值的降低(对照组 Km＝1.24 mmol/L，2 μg/L TGF-β1 Km＝0.47 mmol/L，2 μg/L TGF-β1+50 mg/L Rhein Km＝0.57 mmol/L)；同时细胞葡萄糖摄入 Vmax 值升高，而50 mg/L大黄酸对 Vmax 值增加也有抑制作用[对照组 Vmax＝272 nmol/(mg prot.h)，2 μg/L TGF-β1 Vmax＝405 nmol/(mg prot.h)，2 μg/L TGF-β1+50 mg/L Rhein Vmax＝320 nmol/(mg prot.h)]。(图4)
, 百拇医药
对照组 Km＝1.24mmol/L Vmax＝272nmol/(mg prot.h)
2μg/L TGF-β1(T)
Km＝0.47mmol/L Vmax＝405nmol/(mg prot.h)
2μg/L TGF-β1+50mg/L Rhein(T+R)
Km＝0.57mmol/L Vmax＝320nmol/(mg prot.h)
图4 TGF-β1和大黄酸对系膜细胞葡萄糖摄入动力学影响的双倒数分析
选择DMEM-1%血清中培养的系膜细胞为对照，分别用2 μg/L TGF-β1(T)和2 μg/L TGF-β1再加50 mg/L Rhein(T+R)作用10h，测定系膜细胞糖摄入，并分析其动力学。
, 百拇医药
2.4 大黄酸对TGF-β1增加肾小球系膜细胞GLUT1 mRNA表达的影响 进一步研究大黄酸拮抗TGF-β1的机制，发现50 mg/L大黄酸明显抑制TGF-β1增加GLUT1 mRNA表达的作用。(图5)
图5 GLUT1 mRNA Northern分析
选择DMEM-1%血清中培养的系膜细胞为对照(泳道1)，观察2 μg/L TGF-β1作用10h(泳道2)，及2 μg/L TGF-β1再加50 mg/L大黄酸(泳道3)作用10h后系膜细胞GLUT1 mRNA表达量的变化，发现50 mg/L大黄酸可以抑制TGF-β1对GLUT1 mRNA的上调作用。
3 讨 论
葡萄糖是维持细胞能量代谢和生命活动的重要原料，小肠吸收或肝脏产生的萄萄糖通过血液流向体内各个器官和组织，提供能源和其它碳水化合物的最初前体。葡萄糖是一种极性分子不能以自由扩散的方式通过细胞膜脂双层结构的疏水区，除了小肠和肾小管可以通过主动运输方式吸收葡萄糖外，其它组织的细胞都必须通过细胞膜上的一类葡萄糖转运蛋白来摄入葡萄糖[17，18]。葡萄糖转运蛋白是细胞膜上的跨膜糖蛋白，介导细胞内外的葡萄糖以
, 百拇医药
易化扩散的方式相互转运。到目前为止已经发现了六种葡萄糖转运蛋白，按发现的先后顺序分别命名为葡萄糖转运蛋白1，2，3，4，5和7。不同的组织和细胞依据其在机体代谢中所扮演的不同角色，而具有不同类型的葡萄糖转运蛋白。GLUT1是一种分子量 55 000的葡萄糖高亲和性的转运蛋白，负责细胞基础代谢，广泛分布于各种组织中，一般不受控于胰岛素的调节[19]。
系膜细胞细胞外基质(ECM)合成异常增加所引起的系膜区病变是糖尿病肾病重要病理特征，高糖可以直接刺激系膜细胞ECM产生增多[20]，但机制不详。目前认为，在糖尿病的情况下，系膜细胞糖摄入增加，由此而引发了细胞内一系列异常改变的发生以及ECM的堆积。GLUT1是系膜细胞上主要的葡萄糖转运体，它对葡萄糖具高亲和性并能在生理葡萄糖浓度(5 mmol/L左右)下接近饱和[21]，因此其表达量及功能的改变是系膜细胞糖摄入增加的关键。利用基因转染技术将GLUT1基因导入体外培养的系膜细胞，结果这种大量表达CLUT1的系膜细胞在生理糖浓度下出现糖代谢增加、细胞肥大、ECM合成增加等类似糖尿病情况下出现的病理改变[4]，进一步证实了GLUT1在糖尿病肾病发病中的作用。
, 百拇医药
我们以往的研究已经证实高糖抑制系膜细胞GLUT1的表达与功能，相反TGF-β1不仅在生理糖浓度下上调GLUT1的表达与功能，而且在生理糖浓度下和高糖下增加系膜细胞葡萄糖摄入的作用无明显差别。这说明在糖尿病系膜细胞糖代谢异常中TGF-β1具有重要的作用，而在血糖控制良好的糖尿病肾病患者中它的作用可能尤为重要。因此拮抗TGF-β1对细胞GLUT1的作用有可能阻断或削弱TGF-β1在糖尿病肾病发病中的作用[22]。
本实验室大量的实验研究表明，中药大黄提取物大黄酸可以抑制糖尿病大鼠的高代谢[9，23]，临床研究也表明，大黄酸可以减轻早期糖尿病肾病患者的白蛋白尿。国外有关大黄酸对肿瘤细胞作用的研究表明，大黄酸可以通过抑制葡萄糖的摄入，影响肿瘤细胞异常增高的糖代谢和氧耗量[10，11]。大黄酸的上述作用是否是通过影响GLUT1的表达与功能完成的，大黄酸能不能纠正TGF-β1所引起的系膜细胞代谢异常呢?
, http://www.100md.com
本实验研究表明，大黄酸对在正常糖浓度培养条件下的小鼠系膜细胞的葡萄糖摄入没有明显影响，而且不影响正常糖浓度下系膜细胞葡萄糖摄入动力学。但对于TGF-β1所引起的系膜细胞葡萄糖摄入的异常增加，大黄酸却有明显的抑制作用，其作用呈剂量依赖效应。动力学研究显示，TGF-β1对系膜葡萄糖摄入Km和Vmax的影响都可以被大黄酸所拮抗，因此大黄酸不仅能够抑制GLUT1对葡萄糖亲和力的增加，还能拮抗系膜细胞GLUT1的表达量。对mRNA表达的研究进一步证实，大黄酸可以拮抗TGF-β1对系膜细胞GLUT1表达的上调作用。大黄酸对于葡萄糖转运系统广泛的作用提示，大黄酸并不直接作用于葡萄糖转运系统的某个环节，而是作用于葡萄糖转运系统的调控系统。
尽管TGF-β1信号转导系统的研究目前并没有很大的进展，但普遍认为TGF-β的信号转导系统与其它生长因子有着很大的不同，TGF-β1受体具有非常特别的丝氨酸/苏氨酸激酶活性，而且它是TGF-β信号转导所必需的[24]。TGF-β1对细胞GLUT 1的表达及细胞糖摄入的作用与其它生长因子表现出明显的协同效应，而且TGF-β1对细胞糖摄入与糖酵解作用需要EGF受体激酶系统的活化[25，26]。TGF-β1和PDGF、FGF等生长因子都可以增加细胞GLUT 1的表达量，但只有TGF-β1能够影响GLUT 1的糖基化增加对葡萄糖的亲合力[27]，PDGF、FGF等生长因子对细胞葡萄糖摄入的Km值没有明显影响[28]。
, http://www.100md.com
目前已在GLUT1基因5′端非翻译区的启动子中发现了佛波酯反应元件(phorbol ester responsive element)，细胞原癌基因的活化可以促进GLUT1的表达，但单纯抑制细胞蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的活性并不能阻止生长因子对GLUT1表达的促进作用，细胞GLUT1表达的调控受多种因素的共同调控[17～19]。系膜细胞GLUT1表达的调控机制目前还不清楚，在糖尿病状态下系膜细胞PKC与丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase MAPK)的活性升高，这两种蛋白激酶可能进一步活化特定的转录因子，启动GLUT1的表达，而最新的研究结果表明，转录因子USF2a(upstream stimulating factor 2a)介导了糖尿病情况下系膜细胞GLUT1表达的异常增高[5，19，29，30]。
我们以往的实验发现大黄酸抑制系膜细胞的增殖，并使S期细胞比例明显下降，而对另一种大黄蒽醌类提取物大黄素的研究表明，大黄素抑制细胞PKC的活性以及c-myc原癌基因的表达[31，32]，大黄酸对系膜细胞的信号转导系统的影响，可能是其抑制TGF-β1对系膜细胞葡萄糖转运系统的影响以及系膜细胞增殖的主要途径。由于除TGF-β1之外其它生长因子并不影响GLUT 1对葡萄糖的亲合力[27，28]，大黄酸对TGF-β1刺激下系膜细胞葡萄糖摄入Km值的影响，表明它对TGF-β1信号系统作用的特异性。
, http://www.100md.com
很多学者认为，大黄酸可以直接抑制细胞线粒体的能量代谢并进而抑制细胞的蛋白质合成[33，34]，而且认为这会对肝脏细胞产生毒性[35]。但我们研究所对用大黄治疗的慢性肾衰患者的研究表明，大黄不会产生肝毒性，相反患者血浆白蛋白和转铁蛋白明显上升，营养状况改善[10，36]。这进一步说明中药大黄及其提取物大黄酸对机体的代谢并无直接影响，它们的作用可能是抑制在病理状态下活化的细胞内信号分子，并进而抑制了细胞代谢的异常增高。
本项研究发现，大黄酸能通过影响GLUT1的表达及其对葡萄糖的亲和力，而明显抑制TGF-β1所引起的系膜细胞葡萄糖摄入的异常增高。该结果为阐明大黄酸在防治糖尿病肾病的作用中奠定了基础。
*本课题为江苏省自然科学基金资助项目(BK97176)
作者简介：南京大学医学院博士研究生
, 百拇医药
参考文献
1 Reichard P，Nilsson BY，Rosenovist U.The effect of long-term intensive insulin treatment on the devlopment of microvascular complication of diabetes mellitus.N Engl J Med，1993，329：304
2 Pugliese G，Pricci F，Pesce C et al.Early，but not advanced，glomerulopathy is reversed by pancreatic islet transplants in experimental diabetic rats.Diabetes，1997，46：1198
3 Heilig CW，Concepcion LA，Riser BL et al.Overexpression of glucose transporters in rat mesangial cells cultured in a normal glucose milieu mimics diabetic phenotype.J Clin Invest，1995，96：1802
, http://www.100md.com
4 Heilig CW，Brosius FC，Henry DN.Glucose transporters of the glomerulus and the implincations for diabetic nephropathy.Kidney Int，1997，52：S91
5 Heilig CW，Liu Y，England RL et al.D-Glucose stimulates mesangial cell GLUT1 expression and basal and IGF-I-sensitive glucose uptake in rat mesangial cells.Diabetes，1997，46：1030
6 Inoki K，Haneda M，Maeda S et al.TGF-β1 stimulates glucose uptake by enhancing GLUT1 expression in mesangial cells.Kidney Int，1999，55：1704
, 百拇医药
7 Cortes P，Riser BL，Asano K et al.Effects of oral antihyperglycemic agents on extracellular matrix synthesis by mesangial cells.Kidney Int，1998，54：1985
8 章 精，刘志红，刘 浩等.高糖和TGF-β1对系膜细胞葡萄糖转运蛋白1表达与功能影响.中华肾脏病杂志(待发表).
9 杨俊伟，黎磊石，张 真.大黄治疗糖尿病肾病的实验研究.中华内分泌代谢杂志，1993，9：222
10 Li Leishi.End-stage renal disease in China.Kidney Int，1996，49：287
11 Floridi A，Castiglione S，Bianchi C et al.Effect of rhein on the glucose metablism of ehrlich ascites tumor cells.Biochem Pharmacol，1990，40：217
, http://www.100md.com
12 Castiglione S，Fanciulli M，Bruno T et al.Rhein inhibits glucose uptake in Ehrlich ascites tumor cells by alteration of membrane-associated functions，Anti-Cancer Drugs，1993，4：407
13 Mueckler MC，Caruso SA，Baldwin M et al.Sequence and structure of a human glucose transporter.Science，1985，229：941
14 Dio T，Vlassara H，Kirstein M et al.Receptor-specific increase in extracellular matrix production in mouse mesangial cells by advanced glycosylation end products is mediated via platelet-derived growth factor.Proc Natl Acad Sci USA，1992，89：2873
, 百拇医药
15 Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T et al.Molecular Cloning.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989
16 Wakisaka M，He Q，Spiro Mj et al.Glucose entry into rat mesangial cells is mediated by both Na+-coupled and facilitative transporters.Diabetologia，1995，38：291
17 Kahn BB.Facilitative glucose transporter：regulatory mechanism and dysregulation in dibetes.J Clin Invest，1992，89：1367
18 Klip A，Tsakiridis T，Marette A et al .Regulation of expression of glucose transporters by glucose：a review of studies in vivo and in cell cultures.FASEB J，1994，8：43
, http://www.100md.com
19 Mueckler M.Facilitative glucose transporters.Eur J Biochem，1994，219：713
20 Ayo S，Radnik R，Garoni J et al.High glucose causes an increase in extracellular matrix proteins in cultured mesangial cells.Am J Pathol，1990，136：1339
21 章 精，刘志红，陈朝红等.小鼠系膜细胞葡萄糖转运蛋白的鉴定及其功能研究.肾脏病与透析肾移植杂志，1998，7：212
22 Ziyadeh FN，Sharma K，Ericksen M et al.Stimulation of collagen gene expression and protein synthesis in murine mesangial cells by high glucose is mediated by autocrine activation of transforming growth factor β.J Clin Invest，1994，93：536
, 百拇医药
23 Yang Junwei，Li Leishi.Effects of rheum officinal on the renal hypertroy and hyperfiltration in the streptozotocin-induced diabetic rats.CJIM，1995，1：125
24 Ziyadeh FN，Han DC.Involvement of transforing growth factor-β and its receptros in the pathogenesis of diabetic nephropathy.Kidney Int，1997，52：S-7
25 Inman WH，Colowick SP.Stimulation of glucose uptake by transforming growth factor β：evidence for the requirement of epidermal growth factor-receptor activation.Proc Natl Acad Sci USA，1985，82：1346
, 百拇医药
26 Kitagawa T，Mtsuko M，Akamatsu Y.Transforming growth factor-β1 stimulates glucose uptake and the expression of glucose transporter mRNA in quiescent swiss mouse 3T3 cells.J Biol Chem，1991，266：18066
27 Masumi A，Akamatsu Y，Kitagawa T.Modulation of the synthesis and glycosylation of the glucose transporter protein by transforming growth factor-β1 in Swiss 3T3 fibroblasts.Biochim Biophys Acta，1993，1145：227
28 Kitagawa T，Tanaka M，Akamatsu Y.Regulation of glucose transport activty and expression of glucose transporter mRNA by serum，growth factors and phorbol ester in quiescent mouse fibroblasts.Biochim Biophys Acta，1989，980：100
, 百拇医药
29 Brosius FC，Qu X，Lin Z et al.Increased GLUT1 and extracellular glucose levels reduce mesangial cell MAP kinase and JNK activities.J Am Soc Nephrol，1998，8：629A
30 Heilig C，Ebina Y，Raymondjean M et al.Identification of potential transcription factors(IFs)for mediation of GLUT1 positive feedback in mesangial cells(MC).J Am Soc Nephrol，1998，8：632A
31 Yang Junwei，Li Leishi.Emodin act on protein kinase C activity to inhibit the accumulation of extracellular matrix in glomeruli from STZ-induced diabetic rats.Nephrol，1997，3(suppl)：S261
, http://www.100md.com
32 Liu Zhihong，Li Leishi，Hu Weixin et al.Effect of emodin on c-myc proto-oncongen expression in cultured rat mesangial cells.Acta Pharmacol Sinica，1996，17：61
33 Castiglione S，Paggi MG，Delpino A et al.Inhibition of protein synthesis in neoplastic cells by rhein.Biochem Pharmacol，1990，40：967
34 Delpino A，Paggi MG，Gentile PF et al.Protein synthetic activity and adenylate energy charge in Rhein-treated clutured human glioma cells.Cancer Biochem Biophys，1992，12：241
35 Bironaite D，Ollinger K.The hepatotoxicity of rhein involves impairment of mitochondrial functions.Chem Biol Interact，1997，103：35
36 Li Leishi.Rheum officinale：a new lead in preventing progression of chronic renal failure.Chin Med J，1996，109：35
(1999-06-20收稿), http://www.100md.com