肿瘤抑制基因p53表达与人脑肿瘤对氯乙基亚硝脲耐药
作者：陈忠平 黄 强 Gerard Mohr Lawrence Panasci
单位：陈忠平 黄 强 苏州医学院附属第二医院神经外科暨脑肿瘤研究室(215004)；Gerard Mohr Lawrence Panasci Divisions of Neurosurgery and Medical Oncology， Sir Mortimer B.Davis-Jewish General Hospital， McGill University， Montreal， Canada
关键词：ERCC2 p53 脑肿瘤 化疗 耐药
江苏医药990511 摘要 目的：探讨人脑肿瘤p53表达与对亚硝脲类抗癌药耐药的关系。方法：采用Western Blot分析，对10株人脑肿瘤细胞的p53、ERCC2表达进行检测，并与肿瘤对二氯乙基亚硝脲(BCNU)及二氯乙基肉芥子亚硝脲(SarCNU)耐药性进行比较。结果：ERCC2表达与肿瘤对BCNU和SarCNU耐药相关。p53与BCNU和SarCNU耐药相关。多元回归分析，ERCC2+p53与BCNU和SarCNU间的相关性明显提高。结论：ERCC2和p53基因表达在人脑肿瘤对亚硝脲类抗癌药耐药中起重要作用。
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对恶性肿瘤的治疗，虽然有众多的新疗法在研究，但手术、化疗和放疗仍然是基本疗法。肿瘤对化疗药物耐药是妨碍许多肿瘤治愈的重要原因之一[1，2]。氯乙基亚硝脲(CENU)长期以来一直是脑瘤的常规化疗药，但由于相当一部分肿瘤对其耐药，临床效果不理想。
细胞被射线或化学物质损伤后，将进入GO期使损伤DNA修复，若损伤严重，无法修复，则细胞凋亡[3]。核苷酸切除修复(NER)基因能修复紫外线(UV)和多种抗癌药所致的DNA损伤。我们先前的研究发现，NER系统中的重要成员之一，核苷酸切除交叉互补基因(ERCC2)，与肿瘤对CENU耐药相关[4，5]。肿瘤抑制基因p53介导G1期进入G0期并促使细胞凋亡。因此，许多抗癌药物的作用可能是通过p53介导的细胞凋亡而产生的[6]。所以，p53表达的异常也可能与肿瘤耐药相关。最近的研究发现，p53能与ERCC2、ERCC3相结合，进而对NER和细胞凋亡起调节作用[7，8]。本文对10株人脑肿瘤细胞的ERCC2、p53表达进行了检测，并与其对二氯乙基亚硝脲(BCNU)及新一代亚硝脲类抗癌药，二氯乙基肉芥子亚硝脲(SarCNU)耐药性进行比较。
, 百拇医药
材料和方法
一、细胞培养
选用10株人脑肿瘤细胞：SF-295由美国国家癌症研究所(NCI)提供；T98-G由Yarosh博士(Applied Genetics Ine，Freeport，NY)提供；SKMG-4由Dr.G.Cairnocross(University of Western Ontario， Canada)提供；SKI-1由Dr.J.Shapiro(Barrow Neurological Inst itute，Phoenix，AZ，USA)提供；UW-28，MGR-1，MGR-2和MGR-3由Dr.F.Ali-Osman(UT M.D.An derson Cancer Center，Houston，TX，USA)提供；SKNSH来自Montreal Neurological Institute(Montreal，Quebec，Canada)。根据不同的肿瘤细胞，培养液分别采用McCoy′s5A，RPMI1640或DMEM；加10%胎牛血清，10μg/ml庆大霉素，5%CO2，37℃单层培养。
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二、Western blot
提取各种瘤细胞的总蛋白，每个标本取20μg蛋白在10%的SDS胶上电泳，然后转至硝纤膜上(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)。转有蛋白的硝纤膜先用5%的脱脂牛奶在室温下孵育1小时以阻断非特异性结合，然后用第一抗体在4℃孵育过夜。鼠抗人ERCC2一抗(MER2)由Dr.Larry Thompson提供(Lawrence Livermore National Laboratory，Livermore，CA)，用1∶5000浓度。鼠抗人p53(PAB-3)一抗用1μg/ml(Oncogene Science INC.Cambridge，MA)。抗α-tubulin一抗(Amersham Life Science)用1∶1000。硝纤膜用TBS-T洗2次各15分钟，2次各5分钟，而后，用连结有辣根过氧化物酶的第二抗体(Amersham Life Sciemnce)1∶1000在4℃孵育1小时。如前法用TBS-T洗去未结合的二抗，然后用ECL试剂(Amersham Life Science)显示。ERCC2、p53的光密度读数除以α-tubulin的光密度读数得到校准的基因表达。
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三、细胞毒试验
采用我们先前报道的改良Sulforhodamine B(SRB) Colorimetric抗癌药筛选法，用10株脑瘤细胞对CENU的耐药性进行检测。两种抗癌药分别为BCNU和SarCNU。肿瘤细胞对CENU的耐药性以抑制90%肿瘤细胞生长(IC90)的药物浓度(μM)表示，即IC90值越大，肿瘤细胞对此药的耐药性越大。
结果
p53和ERCC2在10株脑肿瘤细胞的表达结果见表1。各种瘤细胞对BCNU和SarCNU的敏感性用IC90(μM)表示(表1)。采用Stat Viwe512+计算机程序进行回归分析，发现肿瘤细胞的ERCC2基因表达与BCNU和SarCNU细胞毒性之间呈显著的正相关(r＝0.864，P＝0.0013和r＝0.739，P＝0.0147)。肿瘤细胞的CENU耐药性与p53表达也呈正相关(表2)。更有意思的是，当将ERCC2和p53二个因素一起考虑时，它们与CENU耐药性间的相关性更加显著(表2)。
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表1 10株人脑肿瘤p53、ERCC2表达及CENU细胞毒性试验结果 细胞*
BCNU
SarCNU
ERCC2
p53
SKNSH
173.00
367.67
1.000
3.631
T98-G
45.55
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165.20
0.042
1.337
SF-295
23.10
46.51
0.048
0.906
SK-MG-4
10.95
40.55
0.049
1.614
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SKI-1
14.80
44.77
0.061
1.000
MGR-3
85.67
266.40
0.039
3.952
UW-28
35.37
62.17
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0.029
2.953
MGR-1
37.92
72.42
0.007
1.374
MGR-2
17.94
36.80
0.024
1.266
UWR-7
, 百拇医药
13.77
33.37
0.175
1.247
*除SKNSH是神经母细胞瘤外，其余均为胶质细胞瘤。BCNU、SarCNU细胞毒性试验结果为抑制90%细胞生长的药物浓度(μM)。ERCC2、p53表达为Western blot检测结果，以α-tubuliu作为校准。表中所有结果均为至少三次实验的平均值。表2 10株人脑肿瘤细胞p53、ERCC2表达与对CENU耐药的关系
r
P
ERCC2
-BCNU
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0.863
0.0013
-SarCNU
0.736
0.0147
p53
-BCNU
0.772
0.0089
-SarCNU
0.792
0.0063
ERCC2+p53
, http://www.100md.com
-BCNU
0.95
0.0003
-SarCNU
0.887
0.0045
讨论
紫外线(UV)所致的DNA损伤由NER系统修复。我们先前的研究发现，肿瘤细胞对UV的敏感性与BCNU敏感性相一致，都与NER系统中的重要成员ERCC2表达呈正相关，提示由亚硝脲类抗癌药所致的DNA损伤，与UV所致的DNA损伤一样，至少部分由NER修复[4]。本研究中10株人脑肿瘤的ERCC2表达与CENU耐药相关，进一步支持NER在人脑肿瘤对CENU耐药中起重要作用。如果损伤的DNA不能修复，细胞将在p53介导下凋亡[3]。p53表达与肿瘤耐药的关系，各家研究结果并不一致[9，10]。本研究的结果支持p53在人脑肿瘤对CENU耐药中起作用。
, 百拇医药
最近的研究提示，NER过程中需要p53参与[11]，而p53介导的细胞凋亡也需要NER中的成员，如ERCC2和ERCC3的参与[7]。因此，NER和细胞凋亡之间有着密切的联系，p53和ERCC2在这二个过程中起极其重要的调节作用。本研究发现ERCC2和p53表达在肿瘤细胞对CENU耐药中有协调作用。ERCC2是转录因子IIH(TFIIH)中的主要成员，而TFIIH是细胞生存和NER所必须[8]。p53可能与ERCC2结合，影响TFIIH的解螺旋酶活性，进而对NER起调节作用和/或影响细胞的凋亡过程，使得肿瘤细胞在CENU下得以生存。然而，由于p53基因突变相当普遍，且对其功能产生不同的影响[6]，因此，下一步，我们将对p53的特征予以鉴定，以进一步明确p53在肿瘤对CENU耐药中的作用。然而，由于ERCC2和p53同时参与NER和细胞凋亡过程，它们在NER和细胞凋亡过程中如何运作，以及如何导致肿瘤细胞对CENU耐药还待进一步研究。
, 百拇医药 参考文献
[1] Feun LG, et al. J Neurooncol 1994；20：165.
[2] Phillips PC. Neurol Clin 1991；9：383.
[3] Smith ML, et al. Muta Res 1996；340：109.
[4] Chen Z-P,et al. Mol Pharmacol 1997；52：185.
[5] Chen Z-P,et al. Cancer Res 1996；56：2475.
[6] Ko LJ, et al. Gene Dev 1996；10：1054.
, 百拇医药
[7] Wang XW, et al. Gene Dev 1995；10：1219.
[8] Leveillard T, et al. EMBO J 1996；15：1615.
[9] Anthoney DA, et al. Cancer Res 1996；56：1374.
[10] Feudis PD, et al. British J Cancer 1997；76：474.
[11] Wang XW, et al. Nature Genet 1995；10：188.
(1998年10月14日收稿 1999年1月20日修回), 百拇医药
单位：陈忠平 黄 强 苏州医学院附属第二医院神经外科暨脑肿瘤研究室(215004)；Gerard Mohr Lawrence Panasci Divisions of Neurosurgery and Medical Oncology， Sir Mortimer B.Davis-Jewish General Hospital， McGill University， Montreal， Canada
关键词：ERCC2 p53 脑肿瘤 化疗 耐药
江苏医药990511 摘要 目的：探讨人脑肿瘤p53表达与对亚硝脲类抗癌药耐药的关系。方法：采用Western Blot分析，对10株人脑肿瘤细胞的p53、ERCC2表达进行检测，并与肿瘤对二氯乙基亚硝脲(BCNU)及二氯乙基肉芥子亚硝脲(SarCNU)耐药性进行比较。结果：ERCC2表达与肿瘤对BCNU和SarCNU耐药相关。p53与BCNU和SarCNU耐药相关。多元回归分析，ERCC2+p53与BCNU和SarCNU间的相关性明显提高。结论：ERCC2和p53基因表达在人脑肿瘤对亚硝脲类抗癌药耐药中起重要作用。
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对恶性肿瘤的治疗，虽然有众多的新疗法在研究，但手术、化疗和放疗仍然是基本疗法。肿瘤对化疗药物耐药是妨碍许多肿瘤治愈的重要原因之一[1，2]。氯乙基亚硝脲(CENU)长期以来一直是脑瘤的常规化疗药，但由于相当一部分肿瘤对其耐药，临床效果不理想。
细胞被射线或化学物质损伤后，将进入GO期使损伤DNA修复，若损伤严重，无法修复，则细胞凋亡[3]。核苷酸切除修复(NER)基因能修复紫外线(UV)和多种抗癌药所致的DNA损伤。我们先前的研究发现，NER系统中的重要成员之一，核苷酸切除交叉互补基因(ERCC2)，与肿瘤对CENU耐药相关[4，5]。肿瘤抑制基因p53介导G1期进入G0期并促使细胞凋亡。因此，许多抗癌药物的作用可能是通过p53介导的细胞凋亡而产生的[6]。所以，p53表达的异常也可能与肿瘤耐药相关。最近的研究发现，p53能与ERCC2、ERCC3相结合，进而对NER和细胞凋亡起调节作用[7，8]。本文对10株人脑肿瘤细胞的ERCC2、p53表达进行了检测，并与其对二氯乙基亚硝脲(BCNU)及新一代亚硝脲类抗癌药，二氯乙基肉芥子亚硝脲(SarCNU)耐药性进行比较。
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材料和方法
一、细胞培养
选用10株人脑肿瘤细胞：SF-295由美国国家癌症研究所(NCI)提供；T98-G由Yarosh博士(Applied Genetics Ine，Freeport，NY)提供；SKMG-4由Dr.G.Cairnocross(University of Western Ontario， Canada)提供；SKI-1由Dr.J.Shapiro(Barrow Neurological Inst itute，Phoenix，AZ，USA)提供；UW-28，MGR-1，MGR-2和MGR-3由Dr.F.Ali-Osman(UT M.D.An derson Cancer Center，Houston，TX，USA)提供；SKNSH来自Montreal Neurological Institute(Montreal，Quebec，Canada)。根据不同的肿瘤细胞，培养液分别采用McCoy′s5A，RPMI1640或DMEM；加10%胎牛血清，10μg/ml庆大霉素，5%CO2，37℃单层培养。
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二、Western blot
提取各种瘤细胞的总蛋白，每个标本取20μg蛋白在10%的SDS胶上电泳，然后转至硝纤膜上(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)。转有蛋白的硝纤膜先用5%的脱脂牛奶在室温下孵育1小时以阻断非特异性结合，然后用第一抗体在4℃孵育过夜。鼠抗人ERCC2一抗(MER2)由Dr.Larry Thompson提供(Lawrence Livermore National Laboratory，Livermore，CA)，用1∶5000浓度。鼠抗人p53(PAB-3)一抗用1μg/ml(Oncogene Science INC.Cambridge，MA)。抗α-tubulin一抗(Amersham Life Science)用1∶1000。硝纤膜用TBS-T洗2次各15分钟，2次各5分钟，而后，用连结有辣根过氧化物酶的第二抗体(Amersham Life Sciemnce)1∶1000在4℃孵育1小时。如前法用TBS-T洗去未结合的二抗，然后用ECL试剂(Amersham Life Science)显示。ERCC2、p53的光密度读数除以α-tubulin的光密度读数得到校准的基因表达。
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三、细胞毒试验
采用我们先前报道的改良Sulforhodamine B(SRB) Colorimetric抗癌药筛选法，用10株脑瘤细胞对CENU的耐药性进行检测。两种抗癌药分别为BCNU和SarCNU。肿瘤细胞对CENU的耐药性以抑制90%肿瘤细胞生长(IC90)的药物浓度(μM)表示，即IC90值越大，肿瘤细胞对此药的耐药性越大。
结果
p53和ERCC2在10株脑肿瘤细胞的表达结果见表1。各种瘤细胞对BCNU和SarCNU的敏感性用IC90(μM)表示(表1)。采用Stat Viwe512+计算机程序进行回归分析，发现肿瘤细胞的ERCC2基因表达与BCNU和SarCNU细胞毒性之间呈显著的正相关(r＝0.864，P＝0.0013和r＝0.739，P＝0.0147)。肿瘤细胞的CENU耐药性与p53表达也呈正相关(表2)。更有意思的是，当将ERCC2和p53二个因素一起考虑时，它们与CENU耐药性间的相关性更加显著(表2)。
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表1 10株人脑肿瘤p53、ERCC2表达及CENU细胞毒性试验结果 细胞*
BCNU
SarCNU
ERCC2
p53
SKNSH
173.00
367.67
1.000
3.631
T98-G
45.55
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165.20
0.042
1.337
SF-295
23.10
46.51
0.048
0.906
SK-MG-4
10.95
40.55
0.049
1.614
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SKI-1
14.80
44.77
0.061
1.000
MGR-3
85.67
266.40
0.039
3.952
UW-28
35.37
62.17
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0.029
2.953
MGR-1
37.92
72.42
0.007
1.374
MGR-2
17.94
36.80
0.024
1.266
UWR-7
, 百拇医药
13.77
33.37
0.175
1.247
*除SKNSH是神经母细胞瘤外，其余均为胶质细胞瘤。BCNU、SarCNU细胞毒性试验结果为抑制90%细胞生长的药物浓度(μM)。ERCC2、p53表达为Western blot检测结果，以α-tubuliu作为校准。表中所有结果均为至少三次实验的平均值。表2 10株人脑肿瘤细胞p53、ERCC2表达与对CENU耐药的关系
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P
ERCC2
-BCNU
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0.863
0.0013
-SarCNU
0.736
0.0147
p53
-BCNU
0.772
0.0089
-SarCNU
0.792
0.0063
ERCC2+p53
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-BCNU
0.95
0.0003
-SarCNU
0.887
0.0045
讨论
紫外线(UV)所致的DNA损伤由NER系统修复。我们先前的研究发现，肿瘤细胞对UV的敏感性与BCNU敏感性相一致，都与NER系统中的重要成员ERCC2表达呈正相关，提示由亚硝脲类抗癌药所致的DNA损伤，与UV所致的DNA损伤一样，至少部分由NER修复[4]。本研究中10株人脑肿瘤的ERCC2表达与CENU耐药相关，进一步支持NER在人脑肿瘤对CENU耐药中起重要作用。如果损伤的DNA不能修复，细胞将在p53介导下凋亡[3]。p53表达与肿瘤耐药的关系，各家研究结果并不一致[9，10]。本研究的结果支持p53在人脑肿瘤对CENU耐药中起作用。
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最近的研究提示，NER过程中需要p53参与[11]，而p53介导的细胞凋亡也需要NER中的成员，如ERCC2和ERCC3的参与[7]。因此，NER和细胞凋亡之间有着密切的联系，p53和ERCC2在这二个过程中起极其重要的调节作用。本研究发现ERCC2和p53表达在肿瘤细胞对CENU耐药中有协调作用。ERCC2是转录因子IIH(TFIIH)中的主要成员，而TFIIH是细胞生存和NER所必须[8]。p53可能与ERCC2结合，影响TFIIH的解螺旋酶活性，进而对NER起调节作用和/或影响细胞的凋亡过程，使得肿瘤细胞在CENU下得以生存。然而，由于p53基因突变相当普遍，且对其功能产生不同的影响[6]，因此，下一步，我们将对p53的特征予以鉴定，以进一步明确p53在肿瘤对CENU耐药中的作用。然而，由于ERCC2和p53同时参与NER和细胞凋亡过程，它们在NER和细胞凋亡过程中如何运作，以及如何导致肿瘤细胞对CENU耐药还待进一步研究。
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[1] Feun LG, et al. J Neurooncol 1994；20：165.
[2] Phillips PC. Neurol Clin 1991；9：383.
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[4] Chen Z-P,et al. Mol Pharmacol 1997；52：185.
[5] Chen Z-P,et al. Cancer Res 1996；56：2475.
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[8] Leveillard T, et al. EMBO J 1996；15：1615.
[9] Anthoney DA, et al. Cancer Res 1996；56：1374.
[10] Feudis PD, et al. British J Cancer 1997；76：474.
[11] Wang XW, et al. Nature Genet 1995；10：188.
(1998年10月14日收稿 1999年1月20日修回), 百拇医药