乳酸环丙沙星注射液细菌内毒素检查法的建立
作者：黄 俊
单位：钦州市药品检验所
关键词：乳酸环丙沙星；鲎试剂 细菌内毒素检测
广西医学990518
摘要 目的：用鲎试剂对乳酸环丙沙星注射液进行细菌内毒素检测研究。方法：采用稀释法以消除乳酸环丙沙星注射液对鲎试剂的干扰作用。结果：将乳酸环丙沙星注射液用细菌内毒素检查用水(1-26.4)稀释后，对鲎试剂无干扰作用，按此方法对样品进行检验，重现性及一致性均较好。结论：鲎试法可用于检测供试品的细菌内毒素，以替代热原检查法。
目前，乳酸环丙沙星注射液热原检查仍采用家兔法，细菌内毒素检查法未见文献报道。本文采用稀释法排除乳酸环丙沙星对细菌内毒素检查的干扰作用，对乳酸环丙沙星的细菌内毒素检查法作一探讨。
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1 细菌内毒素限值(L)的确定(1)
乳酸环丙沙星热原检查的兔剂量(M)(2)：200mg/100ml,3ml.kg-1，热原反应阈值(K)：5Eu.kg-1，内毒素反应限值(L)：L=1.66Eu.kg-1。
2 干扰试验有效浓度(C)稀释倍数(D)的计算(1)
本实验用鲎试剂灵敏度范围为0.5Eu.kg-1～0.03Eu.kg-1，按公式C=C0λ/L计算，样品干扰试验的有效浓度应是：药液的浓度C0为200mg.ml-1，即2mg.ml-1，干扰试验最小有效浓度Cmin=2×0.03/1.66=0.036mg.ml-1。
, 百拇医药
相对应的稀释倍数为：Dmin=3.3(倍)，Dmax=55.5(倍)。即干扰试验应从样品稀释3.3倍后开始进行。
3 实验材料
3.1 细菌内毒素工作标准品(批号9503规格70Eu.支-1，中国药品生物制品检定所)。
3.2 鲎试剂(批号：961226，规格：0.5Eu.ml-1，0.5ml，0.25Eu.ml-1，0.5ml，批号：961012，规格：0.125Eu.ml-1，0.5ml，批号：961020，规格：0.03Eu.ml-1，0.06Eu.ml-1，0.5ml)湛江安度斯生物有限公司。
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3.3 无热原水(批号：960501，规格：2ml.支-1湛江安度斯生物有限公司。
3.4 阳性对照内毒素(批号：970220，规格：0.5Eu.支-1)湛江安度斯生物有限公司。
3.5 无热原空安瓿(批号960527)湛江安度斯生物有限公司。
3.6 乳酸环丙沙星注射液(批号：960527-1，970131-2,970325-2,规格：200mg/100ml,250ml/瓶)广西钦州市第一人民医院。
4 实验方法与结果
4.1 用无热原水将细菌内毒素工作标准品按细菌内毒素稀释法(中国药典1995年版二部附录XIE76页)稀释成1，0.5，0.25，0.125，0.06，0.03Eu.ml-1，等系列浓度进行试验，实验结果见表1。
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表1 鲎试剂灵敏度实验结果 鲎试剂批号
灵敏度
/Eu.ml-1
961226
0.5
961226
0.25
961020
0.125
961020
0.06
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961020
0.03
内毒素浓度
/Eu.ml-1
水稀释
内毒素
1→3.3供
试品液稀
释内毒素
水稀释
内毒素
1→6.6供
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试品液稀
释内毒素
水稀释
内毒素
1→13.2供
试品液稀
释内毒素
水稀释
内毒素
1→26.4供
试品液稀
释内毒素
水稀释
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内毒素
1→52.8供
试品液稀
释内毒素
1
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0.5
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0.25--------
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0.125----------------
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++++
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0.06------------------------
++++
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++++
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0.03--------------------------------
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阴性对照----------------------------------------
终点
0.5
0.25
0.125
0.06
0.03
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/Eu.ml-1
结论
合格
有干扰
合格
有干扰
合格
有干扰
合格
无干扰
合格
无干扰
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4.2 样品无抑制浓度的测定及干扰试验：以一样品(批号：970131-2)加无热原水稀释成一系列浓度，用此系列样品稀释液稀释内毒素，得到一系列含2λ，λ，0.5λ，0.25λ，0.125λ，0.06，0.03Eu.ml-1内毒素浓度的系列溶液，以与其相对应灵敏度的鲎试剂反应，实验结果见表1。
4.3 3批样品的细菌内毒素检查试验及结果从表1中可判断样品在1∶26.4时已无抑制作用，则样品可按26.4倍或52.8倍稀释后试验。本试验采用26.4倍稀释样品，按细菌内毒素检查法检查(3)，结果见表2。表2 3批稀释样品实验结果 样品批号
961101
970131-2
970325-2
, 百拇医药
鲎试剂灵敏度
/Eu.ml-1
0.06
0.03
0.06
0.03
0.06
0.03
S1
-
-
-
, 百拇医药
+
-
-
S2
-
+
-
+
-
-
NC
-
-
-
, 百拇医药
-
-
-
PC
+
+
+
+
+
+
PPC
+
+
+
, 百拇医药
+
+
+
结论
每1ml供试品液内毒素含量小于0.06Eu
每1ml供试品液内毒素含量小于0.06Eu
每1ml供试品液内毒素含量小于0.06Eu
5 讨论
5.1 供试品中添加的氯化钠及其pH值(3.5～4.5)均对鲎试剂生产干扰作用，这一现象经用细菌内毒素检查用水(1～26.4)稀释后，可以消除，限值为0.064Eu.ml-1，为了使实验结果更可靠，可同时选用0.06Eu.ml-1和0.03Eu.ml-1灵敏度的鲎试剂。
, 百拇医药
5.2 依照本实验建立的方法对12批供试品细菌内毒素检测，结果与热原检查法结果相符合，表明本品适用于鲎试法作细菌内毒素检查，但应注意的是鲎试法的灵敏度要比热原检查法的高得多，如果出现鲎试法检查呈阳性而用热原检查法呈阴性者，需认真复核鲎试剂的灵敏度及稀释倍数，以防供试品中内毒素的含量低于或高于理论值。
参考文献
1 黄清泉，许全明，夏振民等.泰索帝(Taxotere)细菌内毒素检查方法的建立.中国药房 1996；7(2)：85
2 中华人民共和国卫生部部颁试行标准WS-91(X-71)-9
3 中华人民共和国卫生部药典委员会.中国药典1995年版二部.广州：广东科技出版社，1995：附录XIE76, 百拇医药
单位：钦州市药品检验所
关键词：乳酸环丙沙星；鲎试剂 细菌内毒素检测
广西医学990518
摘要 目的：用鲎试剂对乳酸环丙沙星注射液进行细菌内毒素检测研究。方法：采用稀释法以消除乳酸环丙沙星注射液对鲎试剂的干扰作用。结果：将乳酸环丙沙星注射液用细菌内毒素检查用水(1-26.4)稀释后，对鲎试剂无干扰作用，按此方法对样品进行检验，重现性及一致性均较好。结论：鲎试法可用于检测供试品的细菌内毒素，以替代热原检查法。
目前，乳酸环丙沙星注射液热原检查仍采用家兔法，细菌内毒素检查法未见文献报道。本文采用稀释法排除乳酸环丙沙星对细菌内毒素检查的干扰作用，对乳酸环丙沙星的细菌内毒素检查法作一探讨。
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1 细菌内毒素限值(L)的确定(1)
乳酸环丙沙星热原检查的兔剂量(M)(2)：200mg/100ml,3ml.kg-1，热原反应阈值(K)：5Eu.kg-1，内毒素反应限值(L)：L=1.66Eu.kg-1。
2 干扰试验有效浓度(C)稀释倍数(D)的计算(1)
本实验用鲎试剂灵敏度范围为0.5Eu.kg-1～0.03Eu.kg-1，按公式C=C0λ/L计算，样品干扰试验的有效浓度应是：药液的浓度C0为200mg.ml-1，即2mg.ml-1，干扰试验最小有效浓度Cmin=2×0.03/1.66=0.036mg.ml-1。
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相对应的稀释倍数为：Dmin=3.3(倍)，Dmax=55.5(倍)。即干扰试验应从样品稀释3.3倍后开始进行。
3 实验材料
3.1 细菌内毒素工作标准品(批号9503规格70Eu.支-1，中国药品生物制品检定所)。
3.2 鲎试剂(批号：961226，规格：0.5Eu.ml-1，0.5ml，0.25Eu.ml-1，0.5ml，批号：961012，规格：0.125Eu.ml-1，0.5ml，批号：961020，规格：0.03Eu.ml-1，0.06Eu.ml-1，0.5ml)湛江安度斯生物有限公司。
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3.3 无热原水(批号：960501，规格：2ml.支-1湛江安度斯生物有限公司。
3.4 阳性对照内毒素(批号：970220，规格：0.5Eu.支-1)湛江安度斯生物有限公司。
3.5 无热原空安瓿(批号960527)湛江安度斯生物有限公司。
3.6 乳酸环丙沙星注射液(批号：960527-1，970131-2,970325-2,规格：200mg/100ml,250ml/瓶)广西钦州市第一人民医院。
4 实验方法与结果
4.1 用无热原水将细菌内毒素工作标准品按细菌内毒素稀释法(中国药典1995年版二部附录XIE76页)稀释成1，0.5，0.25，0.125，0.06，0.03Eu.ml-1，等系列浓度进行试验，实验结果见表1。
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表1 鲎试剂灵敏度实验结果 鲎试剂批号
灵敏度
/Eu.ml-1
961226
0.5
961226
0.25
961020
0.125
961020
0.06
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0.03
内毒素浓度
/Eu.ml-1
水稀释
内毒素
1→3.3供
试品液稀
释内毒素
水稀释
内毒素
1→6.6供
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试品液稀
释内毒素
水稀释
内毒素
1→13.2供
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水稀释
内毒素
1→26.4供
试品液稀
释内毒素
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1→52.8供
试品液稀
释内毒素
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0.125----------------
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终点
0.5
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结论
合格
有干扰
合格
有干扰
合格
有干扰
合格
无干扰
合格
无干扰
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4.2 样品无抑制浓度的测定及干扰试验：以一样品(批号：970131-2)加无热原水稀释成一系列浓度，用此系列样品稀释液稀释内毒素，得到一系列含2λ，λ，0.5λ，0.25λ，0.125λ，0.06，0.03Eu.ml-1内毒素浓度的系列溶液，以与其相对应灵敏度的鲎试剂反应，实验结果见表1。
4.3 3批样品的细菌内毒素检查试验及结果从表1中可判断样品在1∶26.4时已无抑制作用，则样品可按26.4倍或52.8倍稀释后试验。本试验采用26.4倍稀释样品，按细菌内毒素检查法检查(3)，结果见表2。表2 3批稀释样品实验结果 样品批号
961101
970131-2
970325-2
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鲎试剂灵敏度
/Eu.ml-1
0.06
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结论
每1ml供试品液内毒素含量小于0.06Eu
每1ml供试品液内毒素含量小于0.06Eu
每1ml供试品液内毒素含量小于0.06Eu
5 讨论
5.1 供试品中添加的氯化钠及其pH值(3.5～4.5)均对鲎试剂生产干扰作用，这一现象经用细菌内毒素检查用水(1～26.4)稀释后，可以消除，限值为0.064Eu.ml-1，为了使实验结果更可靠，可同时选用0.06Eu.ml-1和0.03Eu.ml-1灵敏度的鲎试剂。
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5.2 依照本实验建立的方法对12批供试品细菌内毒素检测，结果与热原检查法结果相符合，表明本品适用于鲎试法作细菌内毒素检查，但应注意的是鲎试法的灵敏度要比热原检查法的高得多，如果出现鲎试法检查呈阳性而用热原检查法呈阴性者，需认真复核鲎试剂的灵敏度及稀释倍数，以防供试品中内毒素的含量低于或高于理论值。
参考文献
1 黄清泉，许全明，夏振民等.泰索帝(Taxotere)细菌内毒素检查方法的建立.中国药房 1996；7(2)：85
2 中华人民共和国卫生部部颁试行标准WS-91(X-71)-9
3 中华人民共和国卫生部药典委员会.中国药典1995年版二部.广州：广东科技出版社，1995：附录XIE76, 百拇医药