异种骨复合自体骨髓修复骨缺损的实验研究
作者：高中礼 王金成 陈 伟 赵 亮 李晓东
单位：高中礼 王金成 陈 伟 白求恩医科大学中日联谊医院骨科，长春 130031；赵 亮 李晓东 辽源市中医院骨科
关键词：异种骨；自体红骨髓；骨缺损
中国老年学杂志990517 摘 要 目的 观察异种骨复合自体红骨髓对骨缺损的修复能力。方法 选健康纯系6月龄大耳白兔20只，双侧桡骨中段制成1.5～1.8 cm的骨缺损模型，骨蜡封闭两断端骨髓腔，均植入等长度的异种骨，左侧注射红骨髓作为实验组，右侧不注射作为实验对照组。术后2、4、6、8 w拍X线片，行组织学检查。结果 实验组8 w时，X线示骨缺损修复良好、髓腔基本相通，组织学检查见皮质骨形成、骨髓腔相通。而对照组8 w时X线下仍可见未完全吸收的移植骨，光镜示缺损区有残存的坏死骨，纤维组织充填缺损区。结论 异种骨复合自体红骨髓后可明显促进骨融合，提高修复骨缺损的能力。
, 百拇医药
Renovation of bone defect with hetergenous inorganic spongy bone transplanting accompanied
with the injection of autogenous bone marrow
Gao Zhongli, Zhao Liang, Wang Jincheng et al
The third Clinical Hospital, Norman Bethune University of Medical Science, Changchun 130021
Objective To observe osteogenesis of autogenous bone marrow after injecting into the transplant defect of heterogenous inorganic bone for two weeks.Methods 20 rabbits with a 1.5～1.8 cm bone defect model were performed in each side of the radius, the two sides of fractures were closed by bone wax and transplant the isometric heterogenous inorganic bone. 2 ml bone marrow taken out from the tubercle of tibia were injected into the defect of left radial with the right side with out injection a control. Bone formations were observed with histologic technique, x-ray examinations 2, 4, 6 and 8 weeks after the injection.Results After 8 weeks of inject and the marrow cavities were fulfilled with formed cortex bone and the marrow cavities interlinked.Conclusions The heterogenous inorganic bone possesses good histocompatibility and is easy to be degradated. Ectopic ossification was not found after injection of the bone marrow.This showed that transplantion of hetorogerous inorganic bone marrow may be beneficial to the implantation of bone marrow, and then differentiate to bone. Bone marrow have obvious osteogenetic property.
, 百拇医药
Key words Heterogenous bone Autogenous bone marrow Bone defect
骨缺损、骨不连在老年患者中发生率较高，其修复及功能重建一直是骨科的一大难题。采用异种骨移植治疗有取材容易、制备简单、储存方便、可制成各种形状等优点，但由于丧失了骨诱导活性，其与宿主骨融合率及融合速度显著降低，而且移植后骨折的发生率达16.5%〔1〕。骨髓含有骨髓基质细胞，可自发或诱导成为骨祖细胞、前成骨细胞及成骨细胞，具有良好的成骨能力。本实验在兔桡骨缺损区植入异种无机松质骨后注射自体红骨髓，观察异种无机骨的生物性能及其与骨髓复合的成骨能力，为临床治疗骨不连、骨缺损奠定基础。
1 材料与方法
1.1 异种骨的制备和自体骨髓的复合方法 取新鲜人尸体松质骨，彻底清除软组织及骨膜，切成3 cm×1 cm×1 cm的长条，用0.25 mol/L的NaOH浸泡48 h，蒸馏水冲洗，再用30%的H2O2浸泡24 h，再次蒸馏水冲洗，丙酮浸泡2 h，冲洗后置于无水乙醇中浸泡备用，用前行高压灭菌。实验组注射前用针尖轻轻剥离移植骨周围的软组织，以达扩大空间、减降压力的作用，然后在兔股骨粗隆部用16号骨穿针穿透一侧骨皮质抽取2 ml红骨髓。注射过程中用拇指轻压注射针的穿入部，并且由上至下反复注射，以达到使骨髓充满整个移植骨的目的。
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1.2 动物模型 健康6月龄纯系大耳白兔20只，体重2.0～3.0 kg，1%戊巴比妥钠按每千克体重3 ml于耳缘静脉注射实行全麻醉，麻醉生效后，取上肢前外侧切口，在桡骨中段取1.5 cm的长度，用电锯切除桡骨及其连带骨膜，用骨蜡封闭断端的髓腔，按截断桡骨的长度植入无机松质骨。
1.3 观察指标 分别于2、4、6、8 w各处死5只，立即拍X光片并制备组织标本。用75%甲醛固定，30%蚁酸脱钙，逐级酒精脱水，石蜡包埋，HE染色制备成组织切片进行光镜观察。
2 结果
2.1 X线表现 2 w：实验组移植物部分吸收，其孔隙增大，出现较浅的不规则云雾状阴影；而对照组移植物清晰可见，与宿主骨的接触处界线清楚，无新生骨形成征象。4 w：实验组移植骨基本消失，絮状阴影明显，密度较高，有的表现斑片状密度增高影，两断端骨折线模糊不清；而对照组移植物孔隙增大，部分吸收，断端髓腔封闭，界面清晰可见，无新生骨形成。6 w：骨痂生长明显，桡骨皮质骨出现，而且有不规则的髓腔影像。8 w：桡侧皮质骨连续，其密度接近正常骨，髓腔基本相通；而对照组移植物仍未完全吸收，断端髓腔硬化、封闭。
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2.2 组织学检查 实验组：2 w时移植物内有大量的软骨细胞，间充质细胞增殖明显；4 w见大片软骨细胞与新生骨细胞连成一体贯穿整个移植骨；6 w时新生骨痂大量增加，骨小梁融合成片、软骨内化骨作用明显；8 w时新生骨日趋成熟，皮质骨形成，骨髓腔相通。对照组：4 w时见未吸收的松质骨载体有血管长入，炎性细胞浸润；8 w时仍见残存的坏死骨，有纤维组织和血管长入其中。
3 讨论
3.1 动物模型可靠性 骨缺损的愈合主要取决于缺损的大小，在不同的研究中对截骨的长度有不同的报道〔2，3〕。目前公认的骨缺损模型是桡骨中段大于1.0 cm节段性缺损。本实验截骨长度为1.5 cm，采取了切除外骨膜及封闭髓腔的方法。这是考虑到外骨膜也能提供骨原细胞而成骨，用骨蜡封闭髓腔后排除骨断端骨髓流入骨缺损处对成骨的影响，使本实验能更好地单独观察注射骨髓的成骨能力，并且髓腔的封闭也更接近于临床骨不连的实际情况。
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3.2 移植骨的选择 骨移植治疗骨缺损是主要的发展方向，它即可以在短期内恢复骨的支撑作用，又可以经过一定时间的融合、再塑而实现与宿主骨相同的形态和功能。新鲜自体骨移植是最好的骨移植材料，但其存在取骨区疼痛、感染等并发症，而且取骨的量、大小和形状等受到一定的限制；同种异体骨存在一定的免疫排斥反应，骨源也是一大难题。异种骨为完全脱蛋白骨，处理后的主要成分为羟基磷灰石，除具有天然的多孔结构有利于细胞的着床分化外，还具有一定的机械强度，移植后可保持原有形状不变；它取材广泛，易于保存，可根据不同的要求制成不同的形状；从免疫学角度来看，完全清除了抗原成分，不会产生免疫排斥反应。本组实验结果证实异种无机骨具有良好的组织相容性和降解性，它的多孔结构有利于骨髓基质细胞着床、分化、成骨，并且它的制备、保存简便易行。
3.3 自体骨髓的成骨潜能 1934年Megaw和Marbin首次证实骨髓有成骨活性，他们单独用骨髓成功地修复了狗的腓骨缺损。1966年Burwell将动物的自体骨髓植于肌肉中也发现了明显的成骨。骨髓分为造血和基质两大系统，骨髓异位成骨的组织学检查发现大多数造血干细胞已经死亡，成骨的仅是少量的基质细胞〔4〕。现研究证实有2种骨先质细胞即确定性骨祖细胞(DOPC)和诱导性骨祖细胞(IOPC)，并且骨髓是唯一含有丰富的DOPC和IOPC的组织，但是单纯骨髓移植易被吸收，内含的多潜能干细胞数量少，也不能提供力学的稳定性。骨髓生成细胞的微环境决定它们的骨生成活性，依靠矿物质载体为其提供一个化学和几何学合适的基质是关键，复合后产生一个基本的骨组织，后期被宿主造血骨髓所替代。本实验8 w时X线示骨髓腔已基本相通，光镜下见完全成熟的骨组织，证明骨髓已着床于移植骨并且分化成骨。由于骨髓内含骨髓基质细胞的数量极少，所以注射骨髓的量将直接影响成骨效果，本实验注射骨髓时轻剥周围的软组织以利于骨髓充分渗入，充满整个移植骨，增强成骨能力，但针剥时必然造成局部出血，这新形成的血肿对骨愈合的影响有待于进一步研究。
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作者简介：高中礼，男，47岁，副教授
参考文献
1 Mankin HJ, Doppelt SH, Tomford WW et al.Clinical experience with allograft impantation.Clin Orthop，1983；174：69
2 Connolly JF, Guse R, Lippiello L et al.Development of an osteogenic bone marrow preparation.J Bone Joint Surg，1989；71A(5)：684
3 Bruder SP, Kraus KH, Goldberg VM et al.The effect of implants loaded with autologous mesenchymal stem cells on the healing of canine segmental hone defects.J Bone Joint Surg，1998；80A(7)：985
4 Bab I, Ashton BA, Gazit D et al.Kinetics and differentiation of marrow stromal-cells in diffusion chamber in vivo.J Cell Sci，1986；84：139
1998-11-25收稿
1999-07-28修回, 百拇医药
单位：高中礼 王金成 陈 伟 白求恩医科大学中日联谊医院骨科，长春 130031；赵 亮 李晓东 辽源市中医院骨科
关键词：异种骨；自体红骨髓；骨缺损
中国老年学杂志990517 摘 要 目的 观察异种骨复合自体红骨髓对骨缺损的修复能力。方法 选健康纯系6月龄大耳白兔20只，双侧桡骨中段制成1.5～1.8 cm的骨缺损模型，骨蜡封闭两断端骨髓腔，均植入等长度的异种骨，左侧注射红骨髓作为实验组，右侧不注射作为实验对照组。术后2、4、6、8 w拍X线片，行组织学检查。结果 实验组8 w时，X线示骨缺损修复良好、髓腔基本相通，组织学检查见皮质骨形成、骨髓腔相通。而对照组8 w时X线下仍可见未完全吸收的移植骨，光镜示缺损区有残存的坏死骨，纤维组织充填缺损区。结论 异种骨复合自体红骨髓后可明显促进骨融合，提高修复骨缺损的能力。
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Renovation of bone defect with hetergenous inorganic spongy bone transplanting accompanied
with the injection of autogenous bone marrow
Gao Zhongli, Zhao Liang, Wang Jincheng et al
The third Clinical Hospital, Norman Bethune University of Medical Science, Changchun 130021
Objective To observe osteogenesis of autogenous bone marrow after injecting into the transplant defect of heterogenous inorganic bone for two weeks.Methods 20 rabbits with a 1.5～1.8 cm bone defect model were performed in each side of the radius, the two sides of fractures were closed by bone wax and transplant the isometric heterogenous inorganic bone. 2 ml bone marrow taken out from the tubercle of tibia were injected into the defect of left radial with the right side with out injection a control. Bone formations were observed with histologic technique, x-ray examinations 2, 4, 6 and 8 weeks after the injection.Results After 8 weeks of inject and the marrow cavities were fulfilled with formed cortex bone and the marrow cavities interlinked.Conclusions The heterogenous inorganic bone possesses good histocompatibility and is easy to be degradated. Ectopic ossification was not found after injection of the bone marrow.This showed that transplantion of hetorogerous inorganic bone marrow may be beneficial to the implantation of bone marrow, and then differentiate to bone. Bone marrow have obvious osteogenetic property.
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Key words Heterogenous bone Autogenous bone marrow Bone defect
骨缺损、骨不连在老年患者中发生率较高，其修复及功能重建一直是骨科的一大难题。采用异种骨移植治疗有取材容易、制备简单、储存方便、可制成各种形状等优点，但由于丧失了骨诱导活性，其与宿主骨融合率及融合速度显著降低，而且移植后骨折的发生率达16.5%〔1〕。骨髓含有骨髓基质细胞，可自发或诱导成为骨祖细胞、前成骨细胞及成骨细胞，具有良好的成骨能力。本实验在兔桡骨缺损区植入异种无机松质骨后注射自体红骨髓，观察异种无机骨的生物性能及其与骨髓复合的成骨能力，为临床治疗骨不连、骨缺损奠定基础。
1 材料与方法
1.1 异种骨的制备和自体骨髓的复合方法 取新鲜人尸体松质骨，彻底清除软组织及骨膜，切成3 cm×1 cm×1 cm的长条，用0.25 mol/L的NaOH浸泡48 h，蒸馏水冲洗，再用30%的H2O2浸泡24 h，再次蒸馏水冲洗，丙酮浸泡2 h，冲洗后置于无水乙醇中浸泡备用，用前行高压灭菌。实验组注射前用针尖轻轻剥离移植骨周围的软组织，以达扩大空间、减降压力的作用，然后在兔股骨粗隆部用16号骨穿针穿透一侧骨皮质抽取2 ml红骨髓。注射过程中用拇指轻压注射针的穿入部，并且由上至下反复注射，以达到使骨髓充满整个移植骨的目的。
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1.2 动物模型 健康6月龄纯系大耳白兔20只，体重2.0～3.0 kg，1%戊巴比妥钠按每千克体重3 ml于耳缘静脉注射实行全麻醉，麻醉生效后，取上肢前外侧切口，在桡骨中段取1.5 cm的长度，用电锯切除桡骨及其连带骨膜，用骨蜡封闭断端的髓腔，按截断桡骨的长度植入无机松质骨。
1.3 观察指标 分别于2、4、6、8 w各处死5只，立即拍X光片并制备组织标本。用75%甲醛固定，30%蚁酸脱钙，逐级酒精脱水，石蜡包埋，HE染色制备成组织切片进行光镜观察。
2 结果
2.1 X线表现 2 w：实验组移植物部分吸收，其孔隙增大，出现较浅的不规则云雾状阴影；而对照组移植物清晰可见，与宿主骨的接触处界线清楚，无新生骨形成征象。4 w：实验组移植骨基本消失，絮状阴影明显，密度较高，有的表现斑片状密度增高影，两断端骨折线模糊不清；而对照组移植物孔隙增大，部分吸收，断端髓腔封闭，界面清晰可见，无新生骨形成。6 w：骨痂生长明显，桡骨皮质骨出现，而且有不规则的髓腔影像。8 w：桡侧皮质骨连续，其密度接近正常骨，髓腔基本相通；而对照组移植物仍未完全吸收，断端髓腔硬化、封闭。
, http://www.100md.com
2.2 组织学检查 实验组：2 w时移植物内有大量的软骨细胞，间充质细胞增殖明显；4 w见大片软骨细胞与新生骨细胞连成一体贯穿整个移植骨；6 w时新生骨痂大量增加，骨小梁融合成片、软骨内化骨作用明显；8 w时新生骨日趋成熟，皮质骨形成，骨髓腔相通。对照组：4 w时见未吸收的松质骨载体有血管长入，炎性细胞浸润；8 w时仍见残存的坏死骨，有纤维组织和血管长入其中。
3 讨论
3.1 动物模型可靠性 骨缺损的愈合主要取决于缺损的大小，在不同的研究中对截骨的长度有不同的报道〔2，3〕。目前公认的骨缺损模型是桡骨中段大于1.0 cm节段性缺损。本实验截骨长度为1.5 cm，采取了切除外骨膜及封闭髓腔的方法。这是考虑到外骨膜也能提供骨原细胞而成骨，用骨蜡封闭髓腔后排除骨断端骨髓流入骨缺损处对成骨的影响，使本实验能更好地单独观察注射骨髓的成骨能力，并且髓腔的封闭也更接近于临床骨不连的实际情况。
, 百拇医药
3.2 移植骨的选择 骨移植治疗骨缺损是主要的发展方向，它即可以在短期内恢复骨的支撑作用，又可以经过一定时间的融合、再塑而实现与宿主骨相同的形态和功能。新鲜自体骨移植是最好的骨移植材料，但其存在取骨区疼痛、感染等并发症，而且取骨的量、大小和形状等受到一定的限制；同种异体骨存在一定的免疫排斥反应，骨源也是一大难题。异种骨为完全脱蛋白骨，处理后的主要成分为羟基磷灰石，除具有天然的多孔结构有利于细胞的着床分化外，还具有一定的机械强度，移植后可保持原有形状不变；它取材广泛，易于保存，可根据不同的要求制成不同的形状；从免疫学角度来看，完全清除了抗原成分，不会产生免疫排斥反应。本组实验结果证实异种无机骨具有良好的组织相容性和降解性，它的多孔结构有利于骨髓基质细胞着床、分化、成骨，并且它的制备、保存简便易行。
3.3 自体骨髓的成骨潜能 1934年Megaw和Marbin首次证实骨髓有成骨活性，他们单独用骨髓成功地修复了狗的腓骨缺损。1966年Burwell将动物的自体骨髓植于肌肉中也发现了明显的成骨。骨髓分为造血和基质两大系统，骨髓异位成骨的组织学检查发现大多数造血干细胞已经死亡，成骨的仅是少量的基质细胞〔4〕。现研究证实有2种骨先质细胞即确定性骨祖细胞(DOPC)和诱导性骨祖细胞(IOPC)，并且骨髓是唯一含有丰富的DOPC和IOPC的组织，但是单纯骨髓移植易被吸收，内含的多潜能干细胞数量少，也不能提供力学的稳定性。骨髓生成细胞的微环境决定它们的骨生成活性，依靠矿物质载体为其提供一个化学和几何学合适的基质是关键，复合后产生一个基本的骨组织，后期被宿主造血骨髓所替代。本实验8 w时X线示骨髓腔已基本相通，光镜下见完全成熟的骨组织，证明骨髓已着床于移植骨并且分化成骨。由于骨髓内含骨髓基质细胞的数量极少，所以注射骨髓的量将直接影响成骨效果，本实验注射骨髓时轻剥周围的软组织以利于骨髓充分渗入，充满整个移植骨，增强成骨能力，但针剥时必然造成局部出血，这新形成的血肿对骨愈合的影响有待于进一步研究。
, 百拇医药
作者简介：高中礼，男，47岁，副教授
参考文献
1 Mankin HJ, Doppelt SH, Tomford WW et al.Clinical experience with allograft impantation.Clin Orthop，1983；174：69
2 Connolly JF, Guse R, Lippiello L et al.Development of an osteogenic bone marrow preparation.J Bone Joint Surg，1989；71A(5)：684
3 Bruder SP, Kraus KH, Goldberg VM et al.The effect of implants loaded with autologous mesenchymal stem cells on the healing of canine segmental hone defects.J Bone Joint Surg，1998；80A(7)：985
4 Bab I, Ashton BA, Gazit D et al.Kinetics and differentiation of marrow stromal-cells in diffusion chamber in vivo.J Cell Sci，1986；84：139
1998-11-25收稿
1999-07-28修回, 百拇医药