血清源酸热稳定多肽对伤口组织细胞增殖作用的研究
作者：张 艳 朱旭东 陈荣德
单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所一室(重庆 400042)
关键词：酸热稳定的多肽；细胞增殖；伤口愈合
重庆医学990510 摘 要 目的：研究一种对酸热稳定的多肽(Acid/heat Stable Polypeptides,AHSP)制剂对伤口组织细胞增殖反应的作用及机理。方法：利用从猪血清中分离出的一组对酸热稳定的多肽(AHSP)以及从国外购得的牛血清除大分子蛋白后的多肽成分(Solcoseryl)，观察两种多肽制剂在培养的伤口组织修复细胞及人表皮细胞增殖和细胞总蛋白合成能力中的作用。结果：当Solcoseryl和AHSP的浓度低于7%时，其对伤口修复细胞和人离体培养的表皮细胞的增殖和蛋白合成能力随浓度增加而增加，浓度为5%时，两者对细胞活力的促进作用明显强于相应浓度的小牛血清对照组；而与10%的小牛血清对照组相比无明显差异。Solcoseryl和AHSP的浓度为5%～7%时，曲线变化较为平缓，当浓度上升为10～12%时，Solcoseryl和AHSP组与相应浓度的小牛血清对照组相比有明显的抑制作用。结论：在伤口愈合过程中AHSP可能是通过提高细胞的酶活性，促进细胞的蛋白合成，进而刺激伤口组织细胞增生并促进伤口愈合的。
, 百拇医药
The Study of Acid/heat Stable Polypeptides
on the Proliferation of Wound Tissue Cells
Zhang Yan,Zu Xudong,Cheng Rongde Department 1,The Research Institute of Surgery,The 3rd Military
Medical University,Chongqing,400042
Abstract objective: In the experiment,the effects and its possible mechanisms of two polypeptides with different concentrations on the proliferation wound tissue cells were studied.Methods: One polypeptides stable to both acid and heat was isolated from pig serum,nominated as acid and/or heat stable polypeptides (AHSP).Another polypeptides was purchased from abroad(called Solcoseryl),which was isolated from cow serum,We then observed the effects of the both polypeptides on the proliferation and the synthesis of total protein of cultured wound repair cells and human epidermal cells.Results: It was found that both Solcoseryl and AHSP could effectively promote the growth of cultured human epithelium and wound healing cells when their concentrations were lower than 7%,At 5%,both polypeptides could improve the cell growth and were much more effective than those control groups using the corresponding concentrations of fetal calf serum.While it is not statistically different with the conrtol group of 10%FCS.When the concentrations of Solcoseryl and AHSP were 5～7%,their effects Were almost the same.When their concentrations reached to 10～12%,both presented remarkable inhibitory effects than those control groups of fetal calf serum of the corresponding concentrations.Conclusion: AHSP may play the roles of various growth factors during the process of wound healing,Its mechanisms of enhancing wound healing might be through the proliferation of wound healing cells.
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Key words:Acid/heat stable polypeptides Cell proliferation Wound healing
难愈性伤口的愈合机理是近年来国内外研究的热点。利用牛血清除大分子蛋白后的多肽成份(商品名Solcoseryl)治疗临床难愈伤口在国外已取得良好的效果[1，2，3]，而国内相关的研究报导尚少见。作者所在实验室从猪血清中分离出一组对酸热稳定的多肽(Acid/heat Stable Polypeptids,AHSP)，无免疫原性和毒副作用，能明显促进伤口愈合[4]。本实验旨在通过对比研究观察不同浓度的AHSP及Solcoseryl对伤口组织细胞的增殖和蛋白合成的影响，同时探讨AHSP促进伤口愈合的可能机制。
1.材料和方法
1.1 伤口成纤维细胞的培养、传代：按本实验室所建立的方法培养成纤维细胞[5]：生长融合的成纤维细胞经0.25%的胰酶消化，1640液洗涤，用1640/1%FCS培养液将细胞团块调成1×106个/ml的细胞悬液，点接细胞悬液100ul到96孔培养皿中，37℃、5%CO2条件下孵育12hr，细胞呈贴壁伸展生长，吸去培养液，按加入的培养液不同，将培养细胞分为三大组，Solcoseryl组：BM/2.5%、5%、7.5%、10%、12%Solcoseryl；AHSP组：BM/2.5%、5%、7.5%、10%、12%AHSP；对照组：1640/2.5%、5%、7.5%、10%、12%FCS。BM(basic medium,1640/1%FCS)。
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1.2 表皮细胞的分离、培养及传代：取术后切下的包皮生理盐水冲洗，去真皮和皮下疏松组织制成2cm左右皮片，浸入消化液(0.05%胰酶+0.01%EDTA，1∶1)，4℃过夜。剥离表皮层，放入DMEM/F12培养液，胎盘兰染色，细胞计数，约20万/ml，接种于培养瓶内，贴壁48小时后，去除未附壁细胞，更换培养液，以后隔日换液，初化亚融合时间为12～15天。细胞长满贴壁后，加入0.1%胰酶和0.02%EDTA消化，台盼兰染色计数活细胞，调细胞浓度5×105/ml，每孔100ul。实验分三组：同上。
1.3 细胞增生的测定：待测液与细胞孵育48hr后，每孔培养皿中加入10ulMTT(5mg/ml)，37℃继续孵育4hr，再加入100ul10%SDS，37℃保温18hr后，在酶标仪(Bio-Rad450型)570nm波长处测定每孔溶液的光吸收值，每种待测液平行测定6个样品。
1.4 细胞总蛋白合成能力的测定：在每孔培养的细胞中加入2μCi的3H-亮氨酸，孵育18小时后除掉培养液，加入10%冷的TCA(三氯醋酸)液收集于玻璃纤维滤纸上，用5%TCA液洗涤滤纸两次，滤纸于80℃烘干15分钟，投入闪烁液中于液闪仪上测定放射性，以3H-亮氨酸掺入的cpm多少表示细胞总蛋白合成能力的大小。
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2.结 果
2.1 不同浓度的Solcoseryl和AHSP对伤口修复细胞增殖作用的影响：由图1.2可知，当Solcoseryl和AHSP的浓度低于7%时，其对伤口修复细胞和人离体培养的表皮细胞的增殖能力随浓度增加而增强，与相应浓度的小牛血清对照组相比均有不同程度的差异，以浓度为5%时最为明显。浓度为5%时，Solcoseryl组、AHSP组的OD值明显高于对照组，P<0.01，而Solcoseryl组、AHSP组之间虽绝对值有差异，但无统计学意义。浓度为5%的Solcoseryl和AHSP与10%的小牛血清对照组相比无明显差异(P>0.05)。Solcoseryl和AHSP的浓度为5%～7%时，曲线变化较为平缓，当浓度上升为10～12%时，出现抑制现象，与相应浓度的小牛血清对照组相比有明显差异，提示高浓度的Solcoseryl和AHSP可抑制伤口修复细胞和人表皮细胞的生长。
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图1 不同浓度的Solcoseryl和AHSP对伤口修复细胞的增殖作用
图2 不同浓度的Solcoseryl和AHSP对人表皮细胞的影响
2.2 不同浓度Solcoseryl和AHSP对伤口修复细胞蛋白合成能力的影响：不同浓度的 Solcoseryl和AHSP对伤口修复细胞蛋白合成能力与其对伤口修复细胞增殖作用明显相关，浓度为5%时，Solcoseryl组、AHSP组的cpm值明显高于5%FCS对照组，而与10%的小牛血清对照组相比无明显差异(P>0.05)，Solcoseryl组、AHSP组之间也无明显差异(见表1)。
表1 5%的Solcoseryl和AHSP对伤口组织细胞蛋白合成能力的影响(cpm)值 组别
伤口成纤维细胞
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人表皮细胞
SOLCOSERYL
8720±1040**
7645±1483*
AHSP
9400±1525**
7458±1197*
5%FCS对照组
3704±1241
4189±954
10%FCS对照组
6178±1703
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6923±1632
**与5%FCS对照组比较，P<0.01，*与5%FCS对照组比较，P<0.053.讨 论
近年来研究证实，Solcoseryl具有多种生长因子样活性，可直接刺激伤口修复细胞的迁移、增生，刺激单核细胞的生长和分化，刺激内皮细胞生长，有利于新血管生长，改善伤口局部微循环和营养物质的供应[6，7，8]，进而促进伤口愈合。我们从猪血清中分离出一组对酸热稳定的多肽(AHSP)，其化学成分与Solcoseryl相似。本研究发现当Solcoseryl和AHSP的浓度低于7%时，其对伤口修复细胞和人离体培养的表皮细胞的增殖和蛋白合成能力随浓度增加而增加，与相应浓度的小牛血清对照组相比，均有不同程度的差异，浓度为5%时，两者对伤口修复细胞和人表皮细胞的增殖能力及细胞蛋白合成的促进作用明显强于相应浓度的对照组；而与10%的小牛血清对照组相比无明显差异。Solcoseryl和AHSP的浓度为5%～7%时，曲线变化较为平缓，当浓度上升为10～12%时，Solcoseryl和AHSP的相应浓度的小牛血清对照组相比明显降低，提示高浓度的Solcoseryl和AHSP可抑制伤口修复细胞和人表皮细胞的生长。以往文献报导，生长因子与创伤修复作用有一定的剂量、效应相关性，即低浓度时能刺激细胞增殖，高浓度时则抑制细胞生长[9]。AHSP和Solcoseryl与其它生长因子类似，Solcoseryl和AHSP的剂量与其对伤口组织细胞的增殖能力呈双相性反应，与文献报道相符。AHSP能提高细胞的酶活性，促进细胞的蛋白合成，进而促进细胞的增殖能力。提示AHSP在伤口愈合过程中可能是通过发挥其多种生长因子样活性，刺激伤口组织细胞增生，进而促进伤口愈合的。但有关其在伤口愈合中的作用及机理还有待进一步研究。
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参考文献
1 Niinikoski J,Renvall S,Laato M.Effect of the hemodialysate Solcosery on experiment granulation tissue.Eur Surg Res,1986，18:58
2 Buckley A,Jeffrey M.Sustained release of epidermal growth factor accelerates wound repair.Proc Natl Acad Sci USA，1985，142(3):28
3 Miltenburger HG,Baschong W,Horner V.Cooperative effects in vitro on fibroblast and keratinoncyte functions related to wound healing by transforming growth factor-beta and a low molecular weight fraction from hemodialyzed blood.Arzneimittelforschung.1994，44(7):872
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4 朱旭东，张艳.血清源酸热稳定多肽促伤口愈合的研究.中国修复重建外科杂志，1997，11(2)：113
5 朱旭东，张艳.伤口修复细胞的简易培养方法.中国修复重建外科杂志，1993，3：157
6 Schreier T,Denge E,Baschong W.Fibroblast migration and proliferation during in vitro wound healing.A quantitative comparison between various growth factors and a low molecular weight blood dialysate used in the clinic impaired wound healing Res Exp.Med Berl.1993，193(4):195
7 Konturek SJ,Brzozowski T,Denbinski A.Comparison of Solcosery and epidermal growth factor in healing of chronc gastroduodenal ulceration and mucosal growth in rats.Hapatogastroenterology，1988，35(1):25
8 Spessotto P,Dri P,Baschong W。Effect of protein-free dialysate from calf blood on human monocyte differentiation in vitro.Arzneimittelfor-schung.1993，43(7):747
9 傅小兵编著.生长因子与修复.北京：人民军医出版社，1991；30, 百拇医药
单位：第三军医大学大坪医院野战外科研究所一室(重庆 400042)
关键词：酸热稳定的多肽；细胞增殖；伤口愈合
重庆医学990510 摘 要 目的：研究一种对酸热稳定的多肽(Acid/heat Stable Polypeptides,AHSP)制剂对伤口组织细胞增殖反应的作用及机理。方法：利用从猪血清中分离出的一组对酸热稳定的多肽(AHSP)以及从国外购得的牛血清除大分子蛋白后的多肽成分(Solcoseryl)，观察两种多肽制剂在培养的伤口组织修复细胞及人表皮细胞增殖和细胞总蛋白合成能力中的作用。结果：当Solcoseryl和AHSP的浓度低于7%时，其对伤口修复细胞和人离体培养的表皮细胞的增殖和蛋白合成能力随浓度增加而增加，浓度为5%时，两者对细胞活力的促进作用明显强于相应浓度的小牛血清对照组；而与10%的小牛血清对照组相比无明显差异。Solcoseryl和AHSP的浓度为5%～7%时，曲线变化较为平缓，当浓度上升为10～12%时，Solcoseryl和AHSP组与相应浓度的小牛血清对照组相比有明显的抑制作用。结论：在伤口愈合过程中AHSP可能是通过提高细胞的酶活性，促进细胞的蛋白合成，进而刺激伤口组织细胞增生并促进伤口愈合的。
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The Study of Acid/heat Stable Polypeptides
on the Proliferation of Wound Tissue Cells
Zhang Yan,Zu Xudong,Cheng Rongde Department 1,The Research Institute of Surgery,The 3rd Military
Medical University,Chongqing,400042
Abstract objective: In the experiment,the effects and its possible mechanisms of two polypeptides with different concentrations on the proliferation wound tissue cells were studied.Methods: One polypeptides stable to both acid and heat was isolated from pig serum,nominated as acid and/or heat stable polypeptides (AHSP).Another polypeptides was purchased from abroad(called Solcoseryl),which was isolated from cow serum,We then observed the effects of the both polypeptides on the proliferation and the synthesis of total protein of cultured wound repair cells and human epidermal cells.Results: It was found that both Solcoseryl and AHSP could effectively promote the growth of cultured human epithelium and wound healing cells when their concentrations were lower than 7%,At 5%,both polypeptides could improve the cell growth and were much more effective than those control groups using the corresponding concentrations of fetal calf serum.While it is not statistically different with the conrtol group of 10%FCS.When the concentrations of Solcoseryl and AHSP were 5～7%,their effects Were almost the same.When their concentrations reached to 10～12%,both presented remarkable inhibitory effects than those control groups of fetal calf serum of the corresponding concentrations.Conclusion: AHSP may play the roles of various growth factors during the process of wound healing,Its mechanisms of enhancing wound healing might be through the proliferation of wound healing cells.
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Key words:Acid/heat stable polypeptides Cell proliferation Wound healing
难愈性伤口的愈合机理是近年来国内外研究的热点。利用牛血清除大分子蛋白后的多肽成份(商品名Solcoseryl)治疗临床难愈伤口在国外已取得良好的效果[1，2，3]，而国内相关的研究报导尚少见。作者所在实验室从猪血清中分离出一组对酸热稳定的多肽(Acid/heat Stable Polypeptids,AHSP)，无免疫原性和毒副作用，能明显促进伤口愈合[4]。本实验旨在通过对比研究观察不同浓度的AHSP及Solcoseryl对伤口组织细胞的增殖和蛋白合成的影响，同时探讨AHSP促进伤口愈合的可能机制。
1.材料和方法
1.1 伤口成纤维细胞的培养、传代：按本实验室所建立的方法培养成纤维细胞[5]：生长融合的成纤维细胞经0.25%的胰酶消化，1640液洗涤，用1640/1%FCS培养液将细胞团块调成1×106个/ml的细胞悬液，点接细胞悬液100ul到96孔培养皿中，37℃、5%CO2条件下孵育12hr，细胞呈贴壁伸展生长，吸去培养液，按加入的培养液不同，将培养细胞分为三大组，Solcoseryl组：BM/2.5%、5%、7.5%、10%、12%Solcoseryl；AHSP组：BM/2.5%、5%、7.5%、10%、12%AHSP；对照组：1640/2.5%、5%、7.5%、10%、12%FCS。BM(basic medium,1640/1%FCS)。
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1.2 表皮细胞的分离、培养及传代：取术后切下的包皮生理盐水冲洗，去真皮和皮下疏松组织制成2cm左右皮片，浸入消化液(0.05%胰酶+0.01%EDTA，1∶1)，4℃过夜。剥离表皮层，放入DMEM/F12培养液，胎盘兰染色，细胞计数，约20万/ml，接种于培养瓶内，贴壁48小时后，去除未附壁细胞，更换培养液，以后隔日换液，初化亚融合时间为12～15天。细胞长满贴壁后，加入0.1%胰酶和0.02%EDTA消化，台盼兰染色计数活细胞，调细胞浓度5×105/ml，每孔100ul。实验分三组：同上。
1.3 细胞增生的测定：待测液与细胞孵育48hr后，每孔培养皿中加入10ulMTT(5mg/ml)，37℃继续孵育4hr，再加入100ul10%SDS，37℃保温18hr后，在酶标仪(Bio-Rad450型)570nm波长处测定每孔溶液的光吸收值，每种待测液平行测定6个样品。
1.4 细胞总蛋白合成能力的测定：在每孔培养的细胞中加入2μCi的3H-亮氨酸，孵育18小时后除掉培养液，加入10%冷的TCA(三氯醋酸)液收集于玻璃纤维滤纸上，用5%TCA液洗涤滤纸两次，滤纸于80℃烘干15分钟，投入闪烁液中于液闪仪上测定放射性，以3H-亮氨酸掺入的cpm多少表示细胞总蛋白合成能力的大小。
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2.结 果
2.1 不同浓度的Solcoseryl和AHSP对伤口修复细胞增殖作用的影响：由图1.2可知，当Solcoseryl和AHSP的浓度低于7%时，其对伤口修复细胞和人离体培养的表皮细胞的增殖能力随浓度增加而增强，与相应浓度的小牛血清对照组相比均有不同程度的差异，以浓度为5%时最为明显。浓度为5%时，Solcoseryl组、AHSP组的OD值明显高于对照组，P<0.01，而Solcoseryl组、AHSP组之间虽绝对值有差异，但无统计学意义。浓度为5%的Solcoseryl和AHSP与10%的小牛血清对照组相比无明显差异(P>0.05)。Solcoseryl和AHSP的浓度为5%～7%时，曲线变化较为平缓，当浓度上升为10～12%时，出现抑制现象，与相应浓度的小牛血清对照组相比有明显差异，提示高浓度的Solcoseryl和AHSP可抑制伤口修复细胞和人表皮细胞的生长。
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图1 不同浓度的Solcoseryl和AHSP对伤口修复细胞的增殖作用
图2 不同浓度的Solcoseryl和AHSP对人表皮细胞的影响
2.2 不同浓度Solcoseryl和AHSP对伤口修复细胞蛋白合成能力的影响：不同浓度的 Solcoseryl和AHSP对伤口修复细胞蛋白合成能力与其对伤口修复细胞增殖作用明显相关，浓度为5%时，Solcoseryl组、AHSP组的cpm值明显高于5%FCS对照组，而与10%的小牛血清对照组相比无明显差异(P>0.05)，Solcoseryl组、AHSP组之间也无明显差异(见表1)。
表1 5%的Solcoseryl和AHSP对伤口组织细胞蛋白合成能力的影响(cpm)值 组别
伤口成纤维细胞
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人表皮细胞
SOLCOSERYL
8720±1040**
7645±1483*
AHSP
9400±1525**
7458±1197*
5%FCS对照组
3704±1241
4189±954
10%FCS对照组
6178±1703
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6923±1632
**与5%FCS对照组比较，P<0.01，*与5%FCS对照组比较，P<0.053.讨 论
近年来研究证实，Solcoseryl具有多种生长因子样活性，可直接刺激伤口修复细胞的迁移、增生，刺激单核细胞的生长和分化，刺激内皮细胞生长，有利于新血管生长，改善伤口局部微循环和营养物质的供应[6，7，8]，进而促进伤口愈合。我们从猪血清中分离出一组对酸热稳定的多肽(AHSP)，其化学成分与Solcoseryl相似。本研究发现当Solcoseryl和AHSP的浓度低于7%时，其对伤口修复细胞和人离体培养的表皮细胞的增殖和蛋白合成能力随浓度增加而增加，与相应浓度的小牛血清对照组相比，均有不同程度的差异，浓度为5%时，两者对伤口修复细胞和人表皮细胞的增殖能力及细胞蛋白合成的促进作用明显强于相应浓度的对照组；而与10%的小牛血清对照组相比无明显差异。Solcoseryl和AHSP的浓度为5%～7%时，曲线变化较为平缓，当浓度上升为10～12%时，Solcoseryl和AHSP的相应浓度的小牛血清对照组相比明显降低，提示高浓度的Solcoseryl和AHSP可抑制伤口修复细胞和人表皮细胞的生长。以往文献报导，生长因子与创伤修复作用有一定的剂量、效应相关性，即低浓度时能刺激细胞增殖，高浓度时则抑制细胞生长[9]。AHSP和Solcoseryl与其它生长因子类似，Solcoseryl和AHSP的剂量与其对伤口组织细胞的增殖能力呈双相性反应，与文献报道相符。AHSP能提高细胞的酶活性，促进细胞的蛋白合成，进而促进细胞的增殖能力。提示AHSP在伤口愈合过程中可能是通过发挥其多种生长因子样活性，刺激伤口组织细胞增生，进而促进伤口愈合的。但有关其在伤口愈合中的作用及机理还有待进一步研究。
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参考文献
1 Niinikoski J,Renvall S,Laato M.Effect of the hemodialysate Solcosery on experiment granulation tissue.Eur Surg Res,1986，18:58
2 Buckley A,Jeffrey M.Sustained release of epidermal growth factor accelerates wound repair.Proc Natl Acad Sci USA，1985，142(3):28
3 Miltenburger HG,Baschong W,Horner V.Cooperative effects in vitro on fibroblast and keratinoncyte functions related to wound healing by transforming growth factor-beta and a low molecular weight fraction from hemodialyzed blood.Arzneimittelforschung.1994，44(7):872
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4 朱旭东，张艳.血清源酸热稳定多肽促伤口愈合的研究.中国修复重建外科杂志，1997，11(2)：113
5 朱旭东，张艳.伤口修复细胞的简易培养方法.中国修复重建外科杂志，1993，3：157
6 Schreier T,Denge E,Baschong W.Fibroblast migration and proliferation during in vitro wound healing.A quantitative comparison between various growth factors and a low molecular weight blood dialysate used in the clinic impaired wound healing Res Exp.Med Berl.1993，193(4):195
7 Konturek SJ,Brzozowski T,Denbinski A.Comparison of Solcosery and epidermal growth factor in healing of chronc gastroduodenal ulceration and mucosal growth in rats.Hapatogastroenterology，1988，35(1):25
8 Spessotto P,Dri P,Baschong W。Effect of protein-free dialysate from calf blood on human monocyte differentiation in vitro.Arzneimittelfor-schung.1993，43(7):747
9 傅小兵编著.生长因子与修复.北京：人民军医出版社，1991；30, 百拇医药