HSV1-TK基因转导人肺腺癌细胞A549体内外表达的研究
作者：何祥梁 郭先健 黄桂君
单位：第三军医大学附属新桥医院呼吸内科研究所 重庆，400037
关键词：肺肿瘤；基因转移；基因表达；丙氧鸟苷
提 要 目的
提 要 目的：观察TK基因转导A549细胞后在体外和体内的表达。方法：将已构建的逆转录病毒表达载体PLXSN-TK用电穿孔法转化A549细胞，原位杂交检测TKmRNA在A549-TK细胞和由它接种裸鼠形成肿瘤组织中的表达。斑点杂交检测外源基因在细胞中整合。并体外观察A549-TK细胞对GCV的敏感性。结果：原位杂交表明A549-TK细胞及由其所形成的肿瘤组织中TKmRNA表达阳性，对照细胞无表达，斑点杂交证明A549-TK细胞中有TK基因整合。A549-TK细胞对GCV的敏感性是亲代细胞的46倍。结论：TK基因在A549-TK细胞中表达阳性，转基因细胞对GCV敏感。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R734.2
Studies on the expression of HSV1-TK gene in vitro and in vivo after transduction into human pulmonary carcinoma cell line A549
He Xiangliang, Guo Xianjian, Huang Guijun (Department of Respiratory Diseases,Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400037)
Abstract Objective: To observe the expression of TK gene in vitro and in vivo after it being transduced into A549 cells. Methods: The constructed retroviral vector PLXSN-TK was transduced into A549 cells by electro-transformation. The TK mRNA expression in A549-TK cells and tumor tissue formed by itself in nude mice was determined with in situ hybridization. Recombination of TK gene into cells is examined with blot hybridization. Sensitivity of A549-TK cells to GCV was also observed in vitro. Results: In situ hybridization showed that A549-TK cells and tumor tissue positively expressed TK mRNA while the control cells did not. Blot hybridization showed that TK gene was recombined in A549-TK cells. The sensitivity of A549-TK cells to GCV was 46 times higher than that of parental cells. Conclusion: TK gene is positively expressed in A549-TK cells and the sensitivity to GCV is also obtained by A549-TK cells.
, 百拇医药
Key words pulmonary tumor; gene transfer; gene expression; ganciclovir
HSV1-TK基因是一个药敏基因，已被广泛用于多种肿瘤的治疗研究，我们将该基因导入人肺腺癌A549细胞，观察了体内外转基因细胞对TK的表达情况，并观察了对抗病毒药GCV(丙氧鸟苷)的敏感性，现报告如下。
1 材料与方法
主要试剂及来源：重组逆转录病毒表达载体PLXSN-TK由本人构建，A549肺癌细胞由呼吸所保存，G418购自Sigma公司，GCV购自瑞士Reche公司。
TKCDNA探针用地高辛标记，裸小鼠购自学校动物中心。电穿孔仪Bio-Red公司产品。
5×106培养细胞悬液0.8ml+10μgPLXSN-TK质粒混匀，电击条件1250v，25μF,0.7ms，电击前后冰浴10min，然后培养，G418筛选数周得到抗性克隆。另外按相同条件电转化空载体作为对照。
, 百拇医药
A549、A549-PLXSN、A549-TK 3种细胞与TK探针原位杂交检测TKmRNA表达，参照姜伯等[1]方法；3种细胞常法提取DNA后与探针作斑点杂交。
设GCV(0,0.1,1,10,100,1000，2000，4500μmol/L 8个浓度点)，A549、A549-PLXSN、A549-TK 3种细胞接种在96孔板上，2500cell/孔，每个浓度点每种细胞设三复孔，细胞贴壁后培养1～2d，然后加入不同浓度GCV，2d换一次液作用5 d用MTT法测活细胞数。
A549-TK、A549二种细胞分别接种于裸鼠腹部皮下左右侧，共3只裸鼠，每点接种细胞数为107/0.2ml，2周后取瘤组织低温冰冻切片，用TK探针检测两种组织片中TKmRNA表达。
2 结果
电击结果见表1。
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表1 PLXSN-TK、PLXSN电击转化A549细胞效率
Tab 1 The efficiency of transformation of plamsids PLXSN-TK、PLXSN into A549 cells by electroporation resistant colony number
Number of resistant colony
Condition of electro-transfor mation
A549-TK
A-PLXSN
800v
25μF
, 百拇医药
0.8ms
0
0
1250v
25μF
0.8ms
14
11
1650v
25μF
0.7ms
10
9
, 百拇医药
2200v
25μF
0.7ms
6
7
A549、A549-PLXSN、A549-TK对GCV敏感性用IC50表示，分别为4157.24、4176.17、90.82μmol/L,从IC50看A549TK细胞比A549细胞对GCV敏感性提高46倍。每个浓度点对细胞生长抑制率见图1。
图1 GCV对三种细胞生长抑制率
, 百拇医药
Fig 1 Inhibition of proliferation rate of three kinds of cells by GCV
原位杂交结果表明A549-TK细胞及由其形成肿瘤组织杂交均呈强阳性，对照细胞及组织均阴性，见图2、3。斑点杂交，A549-TK细胞中有TKCNA整合，对照细胞无整合，见图4。
图2 A549-TK细胞原位杂交 (NBT染色×400)
, 百拇医药
Fig 2 In situ hyhridization in A549-TK cell (NBT stain×400)
图3 A549-TK细胞接种裸鼠肿瘤组织原位杂交 (NBT染色×400)
Fig 3 In situ hyhridization in tumor tissue formed by inoclulation A549-TK cells (NBT stain×400)
图4 三种细胞DNA与TK基因特异探针斑点杂交
1A：50 μg A549-TK细胞DNA； 1B：3 μg PLXSN-TK质粒DNA阳性对照； 2、3：为A549、A549-PLXSN细胞DNA
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Fig 4 Dot blot hybridization of DNA from three kinds of cells with TK gene specific probe
1A：50 μg A549-TK cells DNA; 1B:3 μg PLXSN-TK plasmids DNA positive control; 2、3:A459, A549-PLXSN cells DNA
3 讨论
自从1986年Moolten[2]首先研究用TK基因转导纤维肉瘤并使之获得GCV敏感性后，国内外许多学者用TK基因对几乎遍及各系统的肿瘤都进行了广泛的研究，都不同程度地获得了对GCV的敏感性[3，4]。HSV1-TK基因治疗肿瘤机理为该基因表达产物TK酶能将GCV磷酸化为一磷丙氧鸟苷，后者被体内磷酸酶继续磷酸化为二、三磷酸核苷，后者为细胞毒药物，能抑制细胞DNA聚合酶活性，使DNA合成受阻，导致细胞死亡，因此TK基因被称为自杀基因。哺乳动物也存在TK基因，但序列和表达产物完全不同。我们用HSV1-TK转导A549肺腺癌细胞，不但转导成功，也获得了对GCV的敏感性，虽然与Osaki等[5]报道提高1000倍，Kumgai[6]报道提高500倍有差距，但比亲代细胞提高了46倍。本试验也提示电转化效率并不随电压增高而增高，每种细胞有适合自己的最适电转化电压。G418筛选抗性克隆一般对照细胞5d全部死亡，而抗性细胞经过全量筛选7～9d后改维持量，维持了二周细胞既不增长又不死亡，然后撤去G418改为普通培养基细胞增殖很快，这种细胞再加G418就不再被杀死，也就是得到了抗性克隆。从细胞和组织原位杂交看，A549-TK细胞有强阳性表达，对照细胞无表达，这说明外源基因已稳定整合入细胞基因组中，Zhang等[7]发现TK基因转染仅对离体细胞有效，而当细胞接种到了活体后敏感性就丢失，所谓基因沉默(Gene silence)。我们的结果与大多数作者一样TK基因在体外都有表达，这为以后进行动物实验和进入临床试验提供了证据。
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作者简介：何祥梁，男，36岁，主治医师，博士研究生
参考文献
1 姜伯，张来历，周殿元.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996.137～139
2 Moolten F L.Tumor chemosensitivity conferred by inserted TK gene:paradigm for a prospective cancer control strategy.Cancer Res,1986,46(10):5276
3 Caruso M,Panis Y,Gagandeep S,et al.Regression of established macroscopic liver metastases after in situ transduciton of a suicide gene.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90(15):7024
, 百拇医药
4 Eric A,Beverly L,Scott M,et al.Adenovirus-mediated genetherapy for head and neck squemous cell carcinomas. Ann Otol Rhinol Laryngal,1996,105(5):562
5 Osaki T,Tanio Y,Tachibana I,et al.Gene therapy for carcino-embryonic antigen-producing human lung cancer cells by cell type-specific expression of HSV1-TK gene.Cancer Res,1994,54(20):5258
6 Kumgai T,Tario Y,Osqki T,et al.Eradication of myc-over expressing small-cell lung cells transfected with HSV-TK gene containing myc-max response elements.Cancer Res,1996,56(2):354
7 Zhang L,Wikenheiser K A,Whitsett J A,et al.Limitations of retroviral-mediated HSV-TK gene transfer to pulmonary adenocarcinoma cells in vitro and in vivo.Hum Gene Ther,1997,8(5):563
(收稿：1999-02-24；修回：1999-04-12), 百拇医药
单位：第三军医大学附属新桥医院呼吸内科研究所 重庆，400037
关键词：肺肿瘤；基因转移；基因表达；丙氧鸟苷
提 要 目的
提 要 目的：观察TK基因转导A549细胞后在体外和体内的表达。方法：将已构建的逆转录病毒表达载体PLXSN-TK用电穿孔法转化A549细胞，原位杂交检测TKmRNA在A549-TK细胞和由它接种裸鼠形成肿瘤组织中的表达。斑点杂交检测外源基因在细胞中整合。并体外观察A549-TK细胞对GCV的敏感性。结果：原位杂交表明A549-TK细胞及由其所形成的肿瘤组织中TKmRNA表达阳性，对照细胞无表达，斑点杂交证明A549-TK细胞中有TK基因整合。A549-TK细胞对GCV的敏感性是亲代细胞的46倍。结论：TK基因在A549-TK细胞中表达阳性，转基因细胞对GCV敏感。
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中图法分类号 R734.2
Studies on the expression of HSV1-TK gene in vitro and in vivo after transduction into human pulmonary carcinoma cell line A549
He Xiangliang, Guo Xianjian, Huang Guijun (Department of Respiratory Diseases,Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400037)
Abstract Objective: To observe the expression of TK gene in vitro and in vivo after it being transduced into A549 cells. Methods: The constructed retroviral vector PLXSN-TK was transduced into A549 cells by electro-transformation. The TK mRNA expression in A549-TK cells and tumor tissue formed by itself in nude mice was determined with in situ hybridization. Recombination of TK gene into cells is examined with blot hybridization. Sensitivity of A549-TK cells to GCV was also observed in vitro. Results: In situ hybridization showed that A549-TK cells and tumor tissue positively expressed TK mRNA while the control cells did not. Blot hybridization showed that TK gene was recombined in A549-TK cells. The sensitivity of A549-TK cells to GCV was 46 times higher than that of parental cells. Conclusion: TK gene is positively expressed in A549-TK cells and the sensitivity to GCV is also obtained by A549-TK cells.
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Key words pulmonary tumor; gene transfer; gene expression; ganciclovir
HSV1-TK基因是一个药敏基因，已被广泛用于多种肿瘤的治疗研究，我们将该基因导入人肺腺癌A549细胞，观察了体内外转基因细胞对TK的表达情况，并观察了对抗病毒药GCV(丙氧鸟苷)的敏感性，现报告如下。
1 材料与方法
主要试剂及来源：重组逆转录病毒表达载体PLXSN-TK由本人构建，A549肺癌细胞由呼吸所保存，G418购自Sigma公司，GCV购自瑞士Reche公司。
TKCDNA探针用地高辛标记，裸小鼠购自学校动物中心。电穿孔仪Bio-Red公司产品。
5×106培养细胞悬液0.8ml+10μgPLXSN-TK质粒混匀，电击条件1250v，25μF,0.7ms，电击前后冰浴10min，然后培养，G418筛选数周得到抗性克隆。另外按相同条件电转化空载体作为对照。
, 百拇医药
A549、A549-PLXSN、A549-TK 3种细胞与TK探针原位杂交检测TKmRNA表达，参照姜伯等[1]方法；3种细胞常法提取DNA后与探针作斑点杂交。
设GCV(0,0.1,1,10,100,1000，2000，4500μmol/L 8个浓度点)，A549、A549-PLXSN、A549-TK 3种细胞接种在96孔板上，2500cell/孔，每个浓度点每种细胞设三复孔，细胞贴壁后培养1～2d，然后加入不同浓度GCV，2d换一次液作用5 d用MTT法测活细胞数。
A549-TK、A549二种细胞分别接种于裸鼠腹部皮下左右侧，共3只裸鼠，每点接种细胞数为107/0.2ml，2周后取瘤组织低温冰冻切片，用TK探针检测两种组织片中TKmRNA表达。
2 结果
电击结果见表1。
, 百拇医药
表1 PLXSN-TK、PLXSN电击转化A549细胞效率
Tab 1 The efficiency of transformation of plamsids PLXSN-TK、PLXSN into A549 cells by electroporation resistant colony number
Number of resistant colony
Condition of electro-transfor mation
A549-TK
A-PLXSN
800v
25μF
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0.8ms
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25μF
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2200v
25μF
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A549、A549-PLXSN、A549-TK对GCV敏感性用IC50表示，分别为4157.24、4176.17、90.82μmol/L,从IC50看A549TK细胞比A549细胞对GCV敏感性提高46倍。每个浓度点对细胞生长抑制率见图1。
图1 GCV对三种细胞生长抑制率
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Fig 1 Inhibition of proliferation rate of three kinds of cells by GCV
原位杂交结果表明A549-TK细胞及由其形成肿瘤组织杂交均呈强阳性，对照细胞及组织均阴性，见图2、3。斑点杂交，A549-TK细胞中有TKCNA整合，对照细胞无整合，见图4。
图2 A549-TK细胞原位杂交 (NBT染色×400)
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Fig 2 In situ hyhridization in A549-TK cell (NBT stain×400)
图3 A549-TK细胞接种裸鼠肿瘤组织原位杂交 (NBT染色×400)
Fig 3 In situ hyhridization in tumor tissue formed by inoclulation A549-TK cells (NBT stain×400)
图4 三种细胞DNA与TK基因特异探针斑点杂交
1A：50 μg A549-TK细胞DNA； 1B：3 μg PLXSN-TK质粒DNA阳性对照； 2、3：为A549、A549-PLXSN细胞DNA
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Fig 4 Dot blot hybridization of DNA from three kinds of cells with TK gene specific probe
1A：50 μg A549-TK cells DNA; 1B:3 μg PLXSN-TK plasmids DNA positive control; 2、3:A459, A549-PLXSN cells DNA
3 讨论
自从1986年Moolten[2]首先研究用TK基因转导纤维肉瘤并使之获得GCV敏感性后，国内外许多学者用TK基因对几乎遍及各系统的肿瘤都进行了广泛的研究，都不同程度地获得了对GCV的敏感性[3，4]。HSV1-TK基因治疗肿瘤机理为该基因表达产物TK酶能将GCV磷酸化为一磷丙氧鸟苷，后者被体内磷酸酶继续磷酸化为二、三磷酸核苷，后者为细胞毒药物，能抑制细胞DNA聚合酶活性，使DNA合成受阻，导致细胞死亡，因此TK基因被称为自杀基因。哺乳动物也存在TK基因，但序列和表达产物完全不同。我们用HSV1-TK转导A549肺腺癌细胞，不但转导成功，也获得了对GCV的敏感性，虽然与Osaki等[5]报道提高1000倍，Kumgai[6]报道提高500倍有差距，但比亲代细胞提高了46倍。本试验也提示电转化效率并不随电压增高而增高，每种细胞有适合自己的最适电转化电压。G418筛选抗性克隆一般对照细胞5d全部死亡，而抗性细胞经过全量筛选7～9d后改维持量，维持了二周细胞既不增长又不死亡，然后撤去G418改为普通培养基细胞增殖很快，这种细胞再加G418就不再被杀死，也就是得到了抗性克隆。从细胞和组织原位杂交看，A549-TK细胞有强阳性表达，对照细胞无表达，这说明外源基因已稳定整合入细胞基因组中，Zhang等[7]发现TK基因转染仅对离体细胞有效，而当细胞接种到了活体后敏感性就丢失，所谓基因沉默(Gene silence)。我们的结果与大多数作者一样TK基因在体外都有表达，这为以后进行动物实验和进入临床试验提供了证据。
, http://www.100md.com
作者简介：何祥梁，男，36岁，主治医师，博士研究生
参考文献
1 姜伯，张来历，周殿元.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996.137～139
2 Moolten F L.Tumor chemosensitivity conferred by inserted TK gene:paradigm for a prospective cancer control strategy.Cancer Res,1986,46(10):5276
3 Caruso M,Panis Y,Gagandeep S,et al.Regression of established macroscopic liver metastases after in situ transduciton of a suicide gene.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90(15):7024
, 百拇医药
4 Eric A,Beverly L,Scott M,et al.Adenovirus-mediated genetherapy for head and neck squemous cell carcinomas. Ann Otol Rhinol Laryngal,1996,105(5):562
5 Osaki T,Tanio Y,Tachibana I,et al.Gene therapy for carcino-embryonic antigen-producing human lung cancer cells by cell type-specific expression of HSV1-TK gene.Cancer Res,1994,54(20):5258
6 Kumgai T,Tario Y,Osqki T,et al.Eradication of myc-over expressing small-cell lung cells transfected with HSV-TK gene containing myc-max response elements.Cancer Res,1996,56(2):354
7 Zhang L,Wikenheiser K A,Whitsett J A,et al.Limitations of retroviral-mediated HSV-TK gene transfer to pulmonary adenocarcinoma cells in vitro and in vivo.Hum Gene Ther,1997,8(5):563
(收稿：1999-02-24；修回：1999-04-12), 百拇医药