乙型肝炎病毒C基因启动子变异的意义
作者：郭亚兵 骆抗先 卢桥生 侯金林 P.Karayiannis
单位：郭亚兵 骆抗先 卢桥生 侯金林 第一军医大学南方医院感染内科，广州，510515；P.Karayiannis Department of Medicine, St Mary’s Hospital Medical School, London W2 1NY，UK
关键词：乙型肝炎病毒；C基因启动子；变异；氯霉素乙酰转移酶
第一军医大学学报990501 摘要：目的 了解C基因启动子区T1762A1764变异对其启动子的影响。方法 PCR产物直接测序，检测重症乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)前C和C基因调节序列的T1762A1764变异；并将该调节序列插入到氯霉素乙酰转移酶(CAT)表达质粒中，转染HepG2细胞并瞬时表达，比较T1762A1764野株及变异株的C基因启动小区序列及CAT表达水平。结果 T1762A1764变异在使CAT表达下调中起主要作用。结论 T1762A1764变异使C基因启动子活性下调中起重要作用。
, 百拇医药
中图分类号：R512.62
Significance of core promoter mutation of hepatitis B virus
Guo Yabing1, Luo Kangxian1, Lu Qiaosheng1, P. Karayiannis2, Hou Jinlin1
1Department of Infectious Diseases, Nanfang Hospital, Guangzhou, 510515; 2Department of Medicine, St Mary’s Hospital Medical School, London, W2 1NY, UK
, 百拇医药
Abstract: Objective To determine the effect of T1762A1764 mutation in regulatory sequence of core gene of hepatitis B virus on core promoter. Methods Patients with fulminant hepatitis were investigated for T1762A1764 mutation by direct sequencing of PCR products. PCR products containing HBV precore/core gene regulatory sequences were directly cloned into chloramphenicol acetyl-transferase (CAT) expressing plasmid. Sequences of core promoter of T1762A1764 mutant were compared with that of wild type strain. CAT assay was done to compare the CAT expression level after transfection of the sequences into HepG2 cells and transient expression. Results It was revealed that T1762A1764 mutation was a main factor that repressed CAT expression in vitro. Conclusion T1762A1764 mutation may play a main role in repressing the activity of core promoter of hepatitis B virus.
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Key words: hepatitis B virus; core promoter; mutation; chloramphenicol acetyl-transferase
乙型肝炎病毒C基因调节序列替代(nt 1762 A→T, nt 1764 G→A, T1762A1764)联合变异在慢性HBV感染过程中是变异的热点 [1～3]。但在该变异点之外还存在其它变异，在这些诸多变异中，T1762A1764变异究竟起何作用？本文检测T1762A1764变异，并应用CAT表达质粒及转染方法对该变异株的启动子作用改变及其生物学意义进行探讨。
1 材料和方法
1.1 研究对象 2例亚急性重症乙型肝炎患者(F1，F2)为我科1993～1996年间收治的住院患者，1例东北地区HBV慢性携带者(C5)，均为男性。诊断符合1994年全国上海肝炎会议确定的诊断标准。酶联免疫法监测HBV感染血清标志物(HBVM)，2例重型肝炎(重肝)为HBsAg(+)、抗HBs(-)、HBeAg(-)、HBeAb(+)、HBcAb(+)；C5为HBsAg(+)、抗HBs(-)、HBeAg(+)、HBeAb(-)、HBcAb(+)。
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1.2 PCR扩增 常规方法提取血清DNA，用巢式PCR扩增HBV 前C/C基因调节序列。外引物对为Pol-6a与2C, 内引物对为Reg1和Reg2。PCR及测序用引物见表1。
1.3 DNA序列分析 用PCR产物直接测序试剂盒(Sequenase Version2, USB,美国)，按产品说明书方法对PCR产物进行直接测序，应用同位素(α)35S-dATP (Amersham,美国)。测序结果用DNASIS软件分析处理。
1.4 克隆CAT表达质粒 首先将PCR产物克隆入pCR质粒。应用TA 克隆试剂盒(Invitrogen, 美国)，参照产品说明书方法进行。再将pCAT3-Basic质粒(Promega,美国)用Sac及Sma酶切，凝胶电泳纯化。重组pCR质粒预先Hind酶切，然后用Klenow大片段酶使Hind粘性末端补齐为平末端，再用Sac酶切下PCR产物全长片段，纯化后，用T4 DNA连接酶与pCAT3-Basic质粒连接。连接产物转化大肠杆菌JM109菌株。
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表1 PCR和序列分析引物序列
Tab.1 Oligonucleotide sequences of primers for PCR and DNA sequencing
Primers
Position
nucleotide sequences
Pol-6a
nt 781--797
5’-GTGAGTCCCTTTATACC
2C
nt 2308--2291
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5’-TTGGTGGTCTATAGGCTG
Reg1
nt 942--960
5’-CTCGAGCTCTGCTTTAGAAAACTTCCT
Reg2’
nt 1876--1859
5’-AGAAAGCTTAACTTGGAGGCTTGAACAGT
X1
nt 1298--1319
5’-GCTCGCAGCAGGTCTGGAGCA
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Po3’a
nt 1676--1662
5’-GGAGTCCCAAGAGTCC
M3
nt 1781--1791
5’-CTGGGAGGAGTTGGGGGA
GAGCTC is Sac site, AAGCTT is Hind site
1.5 转染HepG2细胞及CAT活性定量检测 用脂质体(Lipofectin, GIBCO-BRL公司)介导将克隆的CAT质粒转染HepG2细胞，转染方法按产品说明书方法进行。即HepG2细胞( 5×105)接种于35 mm直径六孔细胞培养板，经含10%胎牛血清RPMI 1640(GIBCO-BRL产品)过夜培养。质粒DNA 5 μg及脂质体10 μl混合后，室温置15 min，用无血清RPMI1640稀释至1 ml，缓滴入用PBS液冲洗过的细胞孔中，37℃培养20 h后裂解细胞。60℃10 min灭活内源性非特异去乙酰酶活性，离心后每个样品取上清100 μl ，加3 μl 〔14C〕氯霉素及5 μl丁酰辅酶A，0.25 mol Tris-HCl , pH8.0 17 μl使终体积达125 μl, 37℃反应20 h，用300 μl二甲苯抽提，离心后小心取200 μl上液相(二甲苯)至闪烁瓶内，计数r/min值。每次实验均以pCAT3-promoter (Promega，CAT基因前含有SV40启动子)和pCAT3-Basic为对照。
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2 结果
2.1血清HBV C区调节序列比较 2例重肝中有1例为T1762A1764变异株，为联合变异，未见单一T1762或A1764变异，血清型未检测。在其它位点上亦有散在或集束变异(图1)。标本C5为我国东北地区慢性无症状携带者，其HBV基因型为C型，血清型为adr。
图1 HBV C基因调节序列区变异
Fig.1 Mutations in core gene regulatory region of HBV
The top line is the consensus sequence of genotype C of HBV. The numbers on the sequence indicate the nucleotide position in HBV genome. Dashes refer to the identical nucleotide to the consensus.2.2 CAT测定结果(图2) CAT 相对活性是以对照质粒cpm值为1，其余标本CAT的相对活性是将各标本的cpm与对照质粒的 cpm之比值。pCATaw是标本C5的克隆，pCATfw及pCATfm分别为重肝标本F1、F2的克隆；F2为T1762A1764变异株。C5、F1与F2克隆间的CAT水平相差5～7倍，而C5与F1间无明显差异。
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图2 HepG2细胞表达CAT相对活性比较
Fig. 2 Comparison of the relative activity of CAT expression in HepG2 cell linepCATaw, pCATfw, and pCATfm have HBV core promoter sequences amplified by PCR from case C5, F1 and F2 respectively. PCAT3- and pCAT3+ referr to pCAT3-Basic and pCAT-Promoter plasmid respectively , acting as blank and positive control.
3 讨论
HBV前C和C调节序列可分为基本C区启动子(BCP)和其上游调节序列(CURS)、负调节子(NRE)[4]，它们调节前C mRNA 和C mRNA(前基因组mRNA)的转录。 BCP区无TATA盒(TATA box)，但含有3个TA富含区(TA1～TA3)，分别位于nt 1752-1755, nt 1758-1762, nt 1788-1795。第3个AT富含区(TA3)决定前C mRNA及前基因组mRNA的精确转录起始[5]。T1762A1764位于TA2区。日本学者[6]研究表明，该变异使前C mRNA转录下调，而使前基因组mRNA转录上调。
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我国是HBV感染高流行区，从仅有的几例中国人感染的HBV全基因序列初步分析，中国人感染的HBV株基因型多为C型和B型，与其它国家和地区HBV流行株有较大的差异。由于尚无根据我国流行株建立的HBV基因库和标准序列。本文以国外HBV流行株为标准序列，通过对齐比较显示，无论是重症肝炎标本还是无症状携带者标本，HBV CP区与标准序列在多个位点上存有差异(图1)。可能我国流行的HBV毒株在CP区序列有其独有的特点。
由于实际存在的HBV变异并非为单一位点发生的，而是多位点同时存在的。BCP区的变异同样如此(图2)。 本研究用重肝患者血清HBV优势株含BCP区的序列直接克隆CAT表达质粒，更能反映变异的综合作用；同时也能通过比较各序列变异的不同来推定各变异的生物学意义。
比较A1、F1(野株)与F2(变异株)间的BCP序列，除T1762A1764外，其它变异点对BCP并无大影响。因为F2在T1762A1764变异以外的变异多可同时存在于F1或C5序列中；而F1与C5间也有些与F2不同的变异，这些变异并不改变CAT表达水平。既往研究在T1762A1764变异外并未发现BCP区新的变异“热点”。故即使T1762A1764以外的非热点变异可影响HBV转录，其临床意义及对乙肝防治作用意义也并不大,，因为所谓“热点”变异是特指流行率较高的变异。
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T1762A1764变异未在急性肝炎患者中检出而主要发生在HBV慢性感染过程中[7,8]，可能是宿主免疫筛选结果。本研究及其它报道显示，T1762A1764变异既大量存在于无症状携带者(无活动肝病理损伤)、慢性肝炎、肝硬化患者中，又存在于重症肝炎患者中；推测该变异株的致病性主要决定于宿主因素。
注：国家自然科学重点课题基金(3963028)和全军医药卫生科研基金资助
作者简介：郭亚兵，男，1963年出生；博士：电话85141945
参考文献
1 Takahashi K, Aoyama K, Ohno N et al. The precore/core promoter mutant (T1762A1764) of hepatitis B virus: clinical significance and an easy method for detection. J Gen Virol, 1995, 76:3159
, 百拇医药
2 Chu CH, Hao Y, Tabor E. Hot-spot mutation in hepatitis B virus X gene in hepatocellular carcinoma. Lancet, 1996, 348:625
3 Sato S, Suzuki K, Akahane Y et al. Hepatitis B virus strains with mutations in the core promoter in patients with fulminant hepatitis. Ann Inter Med, 1995, 122(4):241
4 Lo WY, Ting LP. Repression of enhancer II activity by a negative regulatory element in the hepatitis B virus genome. J Virol, 1994, 68(3):1758
, 百拇医药
5 Chen IH, Huang CJ, Ting LP. Overlapping initiator and TATA box functions in the basal core promoter of hepatitis B virus. J Virol, 1995, 69(6):3647
6 Moriyama K, Okamoto H, Tsuda F et al. Reduced precore transcription and enhanced core-pregenome transcription of hepatitis B virus DNA after replacement of the precore-core promoter with sequences associated with e antigen-seronegative persistent infections. Virology, 1996,226:269
7 郭亚兵，戴 炜， 卢桥生等. 重型乙型肝炎病毒C基因启动子变异. 中华传染病杂志，1999，17(1):108
8 侯金林，陈金军，王占会等. 乙型肝炎病毒毒株X基因/C基因启动子的热点变异. 中华医学杂志,1998, 76(2):107
(收稿日期：1998-12-06), 百拇医药
单位：郭亚兵 骆抗先 卢桥生 侯金林 第一军医大学南方医院感染内科，广州，510515；P.Karayiannis Department of Medicine, St Mary’s Hospital Medical School, London W2 1NY，UK
关键词：乙型肝炎病毒；C基因启动子；变异；氯霉素乙酰转移酶
第一军医大学学报990501 摘要：目的 了解C基因启动子区T1762A1764变异对其启动子的影响。方法 PCR产物直接测序，检测重症乙型肝炎患者乙型肝炎病毒(HBV)前C和C基因调节序列的T1762A1764变异；并将该调节序列插入到氯霉素乙酰转移酶(CAT)表达质粒中，转染HepG2细胞并瞬时表达，比较T1762A1764野株及变异株的C基因启动小区序列及CAT表达水平。结果 T1762A1764变异在使CAT表达下调中起主要作用。结论 T1762A1764变异使C基因启动子活性下调中起重要作用。
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中图分类号：R512.62
Significance of core promoter mutation of hepatitis B virus
Guo Yabing1, Luo Kangxian1, Lu Qiaosheng1, P. Karayiannis2, Hou Jinlin1
1Department of Infectious Diseases, Nanfang Hospital, Guangzhou, 510515; 2Department of Medicine, St Mary’s Hospital Medical School, London, W2 1NY, UK
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Abstract: Objective To determine the effect of T1762A1764 mutation in regulatory sequence of core gene of hepatitis B virus on core promoter. Methods Patients with fulminant hepatitis were investigated for T1762A1764 mutation by direct sequencing of PCR products. PCR products containing HBV precore/core gene regulatory sequences were directly cloned into chloramphenicol acetyl-transferase (CAT) expressing plasmid. Sequences of core promoter of T1762A1764 mutant were compared with that of wild type strain. CAT assay was done to compare the CAT expression level after transfection of the sequences into HepG2 cells and transient expression. Results It was revealed that T1762A1764 mutation was a main factor that repressed CAT expression in vitro. Conclusion T1762A1764 mutation may play a main role in repressing the activity of core promoter of hepatitis B virus.
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Key words: hepatitis B virus; core promoter; mutation; chloramphenicol acetyl-transferase
乙型肝炎病毒C基因调节序列替代(nt 1762 A→T, nt 1764 G→A, T1762A1764)联合变异在慢性HBV感染过程中是变异的热点 [1～3]。但在该变异点之外还存在其它变异，在这些诸多变异中，T1762A1764变异究竟起何作用？本文检测T1762A1764变异，并应用CAT表达质粒及转染方法对该变异株的启动子作用改变及其生物学意义进行探讨。
1 材料和方法
1.1 研究对象 2例亚急性重症乙型肝炎患者(F1，F2)为我科1993～1996年间收治的住院患者，1例东北地区HBV慢性携带者(C5)，均为男性。诊断符合1994年全国上海肝炎会议确定的诊断标准。酶联免疫法监测HBV感染血清标志物(HBVM)，2例重型肝炎(重肝)为HBsAg(+)、抗HBs(-)、HBeAg(-)、HBeAb(+)、HBcAb(+)；C5为HBsAg(+)、抗HBs(-)、HBeAg(+)、HBeAb(-)、HBcAb(+)。
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1.2 PCR扩增 常规方法提取血清DNA，用巢式PCR扩增HBV 前C/C基因调节序列。外引物对为Pol-6a与2C, 内引物对为Reg1和Reg2。PCR及测序用引物见表1。
1.3 DNA序列分析 用PCR产物直接测序试剂盒(Sequenase Version2, USB,美国)，按产品说明书方法对PCR产物进行直接测序，应用同位素(α)35S-dATP (Amersham,美国)。测序结果用DNASIS软件分析处理。
1.4 克隆CAT表达质粒 首先将PCR产物克隆入pCR质粒。应用TA 克隆试剂盒(Invitrogen, 美国)，参照产品说明书方法进行。再将pCAT3-Basic质粒(Promega,美国)用Sac及Sma酶切，凝胶电泳纯化。重组pCR质粒预先Hind酶切，然后用Klenow大片段酶使Hind粘性末端补齐为平末端，再用Sac酶切下PCR产物全长片段，纯化后，用T4 DNA连接酶与pCAT3-Basic质粒连接。连接产物转化大肠杆菌JM109菌株。
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表1 PCR和序列分析引物序列
Tab.1 Oligonucleotide sequences of primers for PCR and DNA sequencing
Primers
Position
nucleotide sequences
Pol-6a
nt 781--797
5’-GTGAGTCCCTTTATACC
2C
nt 2308--2291
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5’-TTGGTGGTCTATAGGCTG
Reg1
nt 942--960
5’-CTCGAGCTCTGCTTTAGAAAACTTCCT
Reg2’
nt 1876--1859
5’-AGAAAGCTTAACTTGGAGGCTTGAACAGT
X1
nt 1298--1319
5’-GCTCGCAGCAGGTCTGGAGCA
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Po3’a
nt 1676--1662
5’-GGAGTCCCAAGAGTCC
M3
nt 1781--1791
5’-CTGGGAGGAGTTGGGGGA
GAGCTC is Sac site, AAGCTT is Hind site
1.5 转染HepG2细胞及CAT活性定量检测 用脂质体(Lipofectin, GIBCO-BRL公司)介导将克隆的CAT质粒转染HepG2细胞，转染方法按产品说明书方法进行。即HepG2细胞( 5×105)接种于35 mm直径六孔细胞培养板，经含10%胎牛血清RPMI 1640(GIBCO-BRL产品)过夜培养。质粒DNA 5 μg及脂质体10 μl混合后，室温置15 min，用无血清RPMI1640稀释至1 ml，缓滴入用PBS液冲洗过的细胞孔中，37℃培养20 h后裂解细胞。60℃10 min灭活内源性非特异去乙酰酶活性，离心后每个样品取上清100 μl ，加3 μl 〔14C〕氯霉素及5 μl丁酰辅酶A，0.25 mol Tris-HCl , pH8.0 17 μl使终体积达125 μl, 37℃反应20 h，用300 μl二甲苯抽提，离心后小心取200 μl上液相(二甲苯)至闪烁瓶内，计数r/min值。每次实验均以pCAT3-promoter (Promega，CAT基因前含有SV40启动子)和pCAT3-Basic为对照。
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2 结果
2.1血清HBV C区调节序列比较 2例重肝中有1例为T1762A1764变异株，为联合变异，未见单一T1762或A1764变异，血清型未检测。在其它位点上亦有散在或集束变异(图1)。标本C5为我国东北地区慢性无症状携带者，其HBV基因型为C型，血清型为adr。
图1 HBV C基因调节序列区变异
Fig.1 Mutations in core gene regulatory region of HBV
The top line is the consensus sequence of genotype C of HBV. The numbers on the sequence indicate the nucleotide position in HBV genome. Dashes refer to the identical nucleotide to the consensus.2.2 CAT测定结果(图2) CAT 相对活性是以对照质粒cpm值为1，其余标本CAT的相对活性是将各标本的cpm与对照质粒的 cpm之比值。pCATaw是标本C5的克隆，pCATfw及pCATfm分别为重肝标本F1、F2的克隆；F2为T1762A1764变异株。C5、F1与F2克隆间的CAT水平相差5～7倍，而C5与F1间无明显差异。
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图2 HepG2细胞表达CAT相对活性比较
Fig. 2 Comparison of the relative activity of CAT expression in HepG2 cell linepCATaw, pCATfw, and pCATfm have HBV core promoter sequences amplified by PCR from case C5, F1 and F2 respectively. PCAT3- and pCAT3+ referr to pCAT3-Basic and pCAT-Promoter plasmid respectively , acting as blank and positive control.
3 讨论
HBV前C和C调节序列可分为基本C区启动子(BCP)和其上游调节序列(CURS)、负调节子(NRE)[4]，它们调节前C mRNA 和C mRNA(前基因组mRNA)的转录。 BCP区无TATA盒(TATA box)，但含有3个TA富含区(TA1～TA3)，分别位于nt 1752-1755, nt 1758-1762, nt 1788-1795。第3个AT富含区(TA3)决定前C mRNA及前基因组mRNA的精确转录起始[5]。T1762A1764位于TA2区。日本学者[6]研究表明，该变异使前C mRNA转录下调，而使前基因组mRNA转录上调。
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我国是HBV感染高流行区，从仅有的几例中国人感染的HBV全基因序列初步分析，中国人感染的HBV株基因型多为C型和B型，与其它国家和地区HBV流行株有较大的差异。由于尚无根据我国流行株建立的HBV基因库和标准序列。本文以国外HBV流行株为标准序列，通过对齐比较显示，无论是重症肝炎标本还是无症状携带者标本，HBV CP区与标准序列在多个位点上存有差异(图1)。可能我国流行的HBV毒株在CP区序列有其独有的特点。
由于实际存在的HBV变异并非为单一位点发生的，而是多位点同时存在的。BCP区的变异同样如此(图2)。 本研究用重肝患者血清HBV优势株含BCP区的序列直接克隆CAT表达质粒，更能反映变异的综合作用；同时也能通过比较各序列变异的不同来推定各变异的生物学意义。
比较A1、F1(野株)与F2(变异株)间的BCP序列，除T1762A1764外，其它变异点对BCP并无大影响。因为F2在T1762A1764变异以外的变异多可同时存在于F1或C5序列中；而F1与C5间也有些与F2不同的变异，这些变异并不改变CAT表达水平。既往研究在T1762A1764变异外并未发现BCP区新的变异“热点”。故即使T1762A1764以外的非热点变异可影响HBV转录，其临床意义及对乙肝防治作用意义也并不大,，因为所谓“热点”变异是特指流行率较高的变异。
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T1762A1764变异未在急性肝炎患者中检出而主要发生在HBV慢性感染过程中[7,8]，可能是宿主免疫筛选结果。本研究及其它报道显示，T1762A1764变异既大量存在于无症状携带者(无活动肝病理损伤)、慢性肝炎、肝硬化患者中，又存在于重症肝炎患者中；推测该变异株的致病性主要决定于宿主因素。
注：国家自然科学重点课题基金(3963028)和全军医药卫生科研基金资助
作者简介：郭亚兵，男，1963年出生；博士：电话85141945
参考文献
1 Takahashi K, Aoyama K, Ohno N et al. The precore/core promoter mutant (T1762A1764) of hepatitis B virus: clinical significance and an easy method for detection. J Gen Virol, 1995, 76:3159
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2 Chu CH, Hao Y, Tabor E. Hot-spot mutation in hepatitis B virus X gene in hepatocellular carcinoma. Lancet, 1996, 348:625
3 Sato S, Suzuki K, Akahane Y et al. Hepatitis B virus strains with mutations in the core promoter in patients with fulminant hepatitis. Ann Inter Med, 1995, 122(4):241
4 Lo WY, Ting LP. Repression of enhancer II activity by a negative regulatory element in the hepatitis B virus genome. J Virol, 1994, 68(3):1758
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5 Chen IH, Huang CJ, Ting LP. Overlapping initiator and TATA box functions in the basal core promoter of hepatitis B virus. J Virol, 1995, 69(6):3647
6 Moriyama K, Okamoto H, Tsuda F et al. Reduced precore transcription and enhanced core-pregenome transcription of hepatitis B virus DNA after replacement of the precore-core promoter with sequences associated with e antigen-seronegative persistent infections. Virology, 1996,226:269
7 郭亚兵，戴 炜， 卢桥生等. 重型乙型肝炎病毒C基因启动子变异. 中华传染病杂志，1999，17(1):108
8 侯金林，陈金军，王占会等. 乙型肝炎病毒毒株X基因/C基因启动子的热点变异. 中华医学杂志,1998, 76(2):107
(收稿日期：1998-12-06), 百拇医药