Marneffei青霉致病性动物实验研究
作者：韦兴国
单位：广西民族医院病理科
关键词：Marneffei青霉；Marneffei青霉病；条件致病菌；变色菌株致病；动物实验
广西医学990524
摘要 通过5批动物实验首次证明Marneffei青霉的致病性是1、Marneffei青霉是条件致病菌；2、在不同条件下该菌可以引起(1)局限性自愈性良性型Marneffei青霉病(或感染)；(2)进行性播散型Marneffei青霉病，可致死；3、该菌在体内易早期播散全身；4、菌株变色仍能致病；5、要证明所分离出的菌株是否是Marneffei青霉较敏感的实验动物是小白鼠、罗赛鼠、褐家鼠、幼龄板齿鼠，接种菌量要多，以酵母样型为好，剖验的最适宜时间是接种后第14±7天，否则可因动物自身免疫力增强自愈而失败。
, 百拇医药 由于1980年的病理发现，作者即对当时所谓“组织胞浆菌病”进行研究(1)，至1981年4月首次发现、证明我国存在Marneffei青霉病(Penicilliosis marneffei)；所谓“组织胞浆菌病”就是Marneffei青霉病而不是组织胞浆菌病(Histoplasmosis)(2)；1986年作者在原南宁地区的13个县、市郊购买得179只竹鼠，63.69%分离培养出Marneffei青霉(Penicillium marneffei, PM),证明PM在本地区广泛、普遍存在于自在界(3)，但至今还未见有对PM致病性和发病机理的实验研究报告，为此作者选用鼠类70只，分5批实验研究，现将初步研究结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 菌种：《我国首例马内青霉病报告》病人菌株(5395号)，《179只竹鼠(RP)马内青霉带菌率调查研究》的RP4，RP60，RP173号分离出的菌株(3)；第1，5批用菌丝型，第2～4批用于37℃培养出的酵母样型，第5批用变色菌株。
, 百拇医药
1.2 接种动物：(1)小白鼠，都是昆明品系；(2)在野外和家里捕捉得的鼠，已证明这些鼠不带Marneffei青霉(3)；(3)豚鼠。
1.3 接种方法：分5批，腹腔接种，常规进行，对照组用生理盐水。动物由作者饲养、观察。
第1批：小白鼠5只，用2个铂金耳5395号菌株的菌丝型菌放入2.5ml生理盐水内，混匀后各注射0.5ml；对照组5只，各注射生理盐水0.5ml；两只豚鼠，1只用2个铂金耳前述菌株放入2ml生理盐水内接种，另1只用2ml生理盐水注射做对照组。
第2批：罗赛鼠6只，黄胸鼠4只，褐家鼠4只，板齿鼠4只(幼龄1只)，小家鼠2只，臭?1只，各对照组用同种鼠1只。用5395号菌株于37℃在麦芽汁琼脂斜面培养的1试管酵母样型菌，用生理盐水洗脱制成10.5ml混悬液，每只实验鼠注射0.5ml。对照组注射生理盐水0.5ml。
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第3批：褐家鼠3只，罗赛鼠5只，对照组各同种鼠1只，用RP4菌株培养的酵母样型菌，菌量是第2批的2倍。
第4批：小白鼠5只，对照组5只，接种菌株、菌量、菌型同第3批。
第5批：分两组进行：(1)小白鼠3只，对照组3只。实验用RP60菌株，1994年1月复查培养时发现该菌的菌丝型菌落已由原来灰青色变成淡红色，部分为黄色菌落，取6个铂金耳菌丝型菌放入3ml生理盐水，每只注射1ml；(2)小白鼠3只，对照组3只。实验组用RP173号菌株，1994年1月复查培养菌丝型菌落由灰青色已变成朱砂红色菌落的菌丝型菌，接种菌量同前组。
1.4 剖验：有病濒死时即时处死剖验，轻病或无病鼠杀验，按常规进行，取各鼠肺、心、脾、肝、胃、肠、睾丸和淋巴结等组织培养分离原来接种动物的菌株(原菌，下同)和用HE、GMSH染色切片或涂片做病理检查。
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2 结果
第1批：小白鼠无病态，从第22天起每7天杀验1组和对照组，都无PM病灶，除从1只鼠肠系膜的1个淋巴结和1只鼠的肝组织各培养出原菌1个菌落外已都无原菌生长；豚鼠始终无病态，于第120天杀验无病灶，培养无原菌生长。
第2批：小家鼠和臭?不到48小时死亡，丢弃；其余各鼠分别于接种后第3、5、7、10、14(病濒死杀验)，21、28、30、45、87、97、107、115、130天杀验。接种的18只鼠中9只康复，无病灶，培养无原菌生长，另外9只鼠(其中1只为幼龄板齿鼠)都有PM病灶，其中60天以内8只，60～130天1只(107天)；60天内的8只鼠中5天的1只，7～14天4只，30～60天3只。第5天杀验的那只鼠已见少数小病灶，第7天杀验的那只鼠大网膜、肠系膜、肾被膜表面及其淋巴结已出现多个病灶，产生大量PM组织型诊断性细胞；第10天杀验的那只鼠少数器官已出现少数小播散病灶；第14天杀验的那只濒死黄胸鼠有全身播散的大量病灶，针尖至玉米粒大，病灶内有大量PM组织型细胞，培养出大量原菌。第30天后的4只鼠除腹膜及其个别淋巴结残存个别正在愈复的微小病灶外，病灶已趋完全愈复，可有多少不等的多核巨噬细胞反应性增生，初时数量多，其细胞内有大量PM组织型细胞，随后那些PM组织型细胞大量坏死，形成碎片，数量逐渐减少，残存个别至完全消失，病灶纤维化，无或极少培养出原菌。
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第3批：6个实验鼠有不同程度病态，第15～20天杀验，各器官都有大量针尖至黄豆大病灶，5号鼠第20天濒死，剖验各鼠都有大量PM组织型细胞，培养出大量原菌。
第4批：实验鼠都出现病态，第10～15天濒死；第10天起每天杀1组濒死鼠，各鼠前述器官都有大量病灶，内有大量PM组织型细胞，培养都有大量原菌生长。
第5批：实验鼠无病态，分别于接种后第5、7、14、21天杀验。于第7天已见PM分生孢子很厚的孢壁已裂开，释放出酵母样型细胞，第14、21天已形成小病灶。
以上各批实验动物的对照组都无Marneffei青霉。
实验鼠组织病理变化：实验结果表明Marneffei青霉病急性进行期主要是组织细胞和毛细血管增生，形成组织细胞肉芽组织，组织细胞浆内有大量PM组织型细胞，组织可坏死，中性粒细胞浸润形成脓肿，中性粒细胞可吞噬有PM组织型细胞，PM组织型细胞能在中性粒细胞浆内生长、繁殖，此期病菌易早期向全身播散形成大量播散病灶。慢性恢复局限期主要是出现多核巨噬细胞，PM组织型细胞大量坏死，减少、消失，肉芽组织形成，纤维化，病灶逐渐缩小，消失，器官恢复正常或近似正常，或残存瘢痕组织。PM在动物体内与在人体内形态相同。涂片或组织切片用GMSH染色显示菌体和组织，细胞及它们之间的关系较理想，即使菌很少或菌的坏死碎片也能清楚显示。
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3 讨论
3.1 Marneffei青霉致病性：
3.1.1 PM是条件致病菌。这方面未见有实验研究报告。本实验结果表明用不同PM菌型、菌量，接种不同种、不同龄鼠结果不同，出现无病、有病、自愈、局限、播散、死亡。致病有两型：实验组鼠全部或部分康复，病灶逐渐消失，无或极少培养出原菌；少数或全部实验鼠有病，病情逐渐进行性加重，早期向全身播散，病灶多、大、致病性强，致死，易培养出大量原菌，从而首次实验证明PM是条件致病菌，作者的另一实验结果也支持这点(3)。
3.1.2 该菌在不同条件下可以引起两型疾病：自愈、良性、局限型或进行性播散型Marneffei青霉病。部分实验鼠表现为无病、自愈、病灶逐渐局限，消失，纤维化；部分鼠则表现为进行性播散全身，致死，首次用动物实验证明这两型疾病的存在。
3.1.3 PM在体内易早期播散。这方面未见有文献报告。本实验第10天杀验的那只鼠已见少数小散病灶；第14天濒死而杀验的那只鼠已有播散全身大量病灶；第3、4批实验鼠于接种后第10～20天都已有大量播散病灶，濒死，首次以动物实验证明PM在体内易早期播散全身，作者的另实验也支持这点(3)。易早期播散的原因很可能是(1)已经证明该菌在体内易被组织细胞和中性粒细胞吞入其胞浆内，该菌能在这两种细胞浆内生长、繁殖(后者是作者于1983年5月4日从病人脓液涂片内首次发现和证实，未见有文献报告)；(2)早期机体免疫功能未增强到高峰期(接种后第21天)就易在上述两种细胞内和外寄生、大量繁殖；(3)前述这两种细胞具有游走性和随淋巴液、血液流入各种器官的能力；(4)临床应用免疫抑制剂，肾上腺皮质激素和广谱抗菌药物也易促进其播散。
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3.1.4 变色的PM菌株仍可致病。未见有PM菌株变色和变色后菌株致病性研究报告。本实验用RP60和PM173号因长期保存的菌种复查培养发现其变色的菌株的菌丝型孢子接种小白鼠，可见它们的分生孢子的孢壁裂开，释放出酵母样型细胞，并形成病灶，证明它们仍可致病，首次证明PM菌株可以变色，变色后的菌株仍可致病。
3.2 敏感动物和最适宜检验时间
3.2.1 实验结果表明在本实验中对PM较敏感的实验鼠类是小白鼠、罗赛鼠、褐家鼠和幼龄板齿鼠。
3.2.2 接种动物第5天内该菌仅有少数变成组织型，病灶小、少，未见有播散病灶，而第7～14～21天则有大量病灶，病灶内有大量PM组织型细胞，具有典型诊断性特征细胞；第30天后病灶逐渐缩小，减少，消失或纤维化，PM组织型细胞大量坏死、减少，所形成碎片，消失，不易培养出原菌，所以要证明所分离出的菌是否是PM的动物实验剖验最适宜时间是接种的第14±7天，否则可因动物自身免疫力增强自愈而失败；要观察病灶的愈复过程和该菌在体内消失过程则以第30～60天以后为好。
本科农勤高主管技师协助做组织病理制片；南宁地区防疫站流行病科凌胤民副主任医师协助捕取野外鼠和做鼠种类鉴定，特此感谢。
参考文献
1 黎而介，韦兴国.马内青霉病4例报告.中国人兽共患病杂志 1987；3(6)：28
2 韦兴国，周力特，张庆三，等.我国首例马内青霉病报告.中华医学杂志 1985；65(9)：533
3 韦兴国，凌胤民，李 臣，等.179只竹鼠马内青霉带菌率调查研究.中国人兽共患病杂志 1987；3(4)：34, http://www.100md.com
单位：广西民族医院病理科
关键词：Marneffei青霉；Marneffei青霉病；条件致病菌；变色菌株致病；动物实验
广西医学990524
摘要 通过5批动物实验首次证明Marneffei青霉的致病性是1、Marneffei青霉是条件致病菌；2、在不同条件下该菌可以引起(1)局限性自愈性良性型Marneffei青霉病(或感染)；(2)进行性播散型Marneffei青霉病，可致死；3、该菌在体内易早期播散全身；4、菌株变色仍能致病；5、要证明所分离出的菌株是否是Marneffei青霉较敏感的实验动物是小白鼠、罗赛鼠、褐家鼠、幼龄板齿鼠，接种菌量要多，以酵母样型为好，剖验的最适宜时间是接种后第14±7天，否则可因动物自身免疫力增强自愈而失败。
, 百拇医药 由于1980年的病理发现，作者即对当时所谓“组织胞浆菌病”进行研究(1)，至1981年4月首次发现、证明我国存在Marneffei青霉病(Penicilliosis marneffei)；所谓“组织胞浆菌病”就是Marneffei青霉病而不是组织胞浆菌病(Histoplasmosis)(2)；1986年作者在原南宁地区的13个县、市郊购买得179只竹鼠，63.69%分离培养出Marneffei青霉(Penicillium marneffei, PM),证明PM在本地区广泛、普遍存在于自在界(3)，但至今还未见有对PM致病性和发病机理的实验研究报告，为此作者选用鼠类70只，分5批实验研究，现将初步研究结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 菌种：《我国首例马内青霉病报告》病人菌株(5395号)，《179只竹鼠(RP)马内青霉带菌率调查研究》的RP4，RP60，RP173号分离出的菌株(3)；第1，5批用菌丝型，第2～4批用于37℃培养出的酵母样型，第5批用变色菌株。
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1.2 接种动物：(1)小白鼠，都是昆明品系；(2)在野外和家里捕捉得的鼠，已证明这些鼠不带Marneffei青霉(3)；(3)豚鼠。
1.3 接种方法：分5批，腹腔接种，常规进行，对照组用生理盐水。动物由作者饲养、观察。
第1批：小白鼠5只，用2个铂金耳5395号菌株的菌丝型菌放入2.5ml生理盐水内，混匀后各注射0.5ml；对照组5只，各注射生理盐水0.5ml；两只豚鼠，1只用2个铂金耳前述菌株放入2ml生理盐水内接种，另1只用2ml生理盐水注射做对照组。
第2批：罗赛鼠6只，黄胸鼠4只，褐家鼠4只，板齿鼠4只(幼龄1只)，小家鼠2只，臭?1只，各对照组用同种鼠1只。用5395号菌株于37℃在麦芽汁琼脂斜面培养的1试管酵母样型菌，用生理盐水洗脱制成10.5ml混悬液，每只实验鼠注射0.5ml。对照组注射生理盐水0.5ml。
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第3批：褐家鼠3只，罗赛鼠5只，对照组各同种鼠1只，用RP4菌株培养的酵母样型菌，菌量是第2批的2倍。
第4批：小白鼠5只，对照组5只，接种菌株、菌量、菌型同第3批。
第5批：分两组进行：(1)小白鼠3只，对照组3只。实验用RP60菌株，1994年1月复查培养时发现该菌的菌丝型菌落已由原来灰青色变成淡红色，部分为黄色菌落，取6个铂金耳菌丝型菌放入3ml生理盐水，每只注射1ml；(2)小白鼠3只，对照组3只。实验组用RP173号菌株，1994年1月复查培养菌丝型菌落由灰青色已变成朱砂红色菌落的菌丝型菌，接种菌量同前组。
1.4 剖验：有病濒死时即时处死剖验，轻病或无病鼠杀验，按常规进行，取各鼠肺、心、脾、肝、胃、肠、睾丸和淋巴结等组织培养分离原来接种动物的菌株(原菌，下同)和用HE、GMSH染色切片或涂片做病理检查。
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2 结果
第1批：小白鼠无病态，从第22天起每7天杀验1组和对照组，都无PM病灶，除从1只鼠肠系膜的1个淋巴结和1只鼠的肝组织各培养出原菌1个菌落外已都无原菌生长；豚鼠始终无病态，于第120天杀验无病灶，培养无原菌生长。
第2批：小家鼠和臭?不到48小时死亡，丢弃；其余各鼠分别于接种后第3、5、7、10、14(病濒死杀验)，21、28、30、45、87、97、107、115、130天杀验。接种的18只鼠中9只康复，无病灶，培养无原菌生长，另外9只鼠(其中1只为幼龄板齿鼠)都有PM病灶，其中60天以内8只，60～130天1只(107天)；60天内的8只鼠中5天的1只，7～14天4只，30～60天3只。第5天杀验的那只鼠已见少数小病灶，第7天杀验的那只鼠大网膜、肠系膜、肾被膜表面及其淋巴结已出现多个病灶，产生大量PM组织型诊断性细胞；第10天杀验的那只鼠少数器官已出现少数小播散病灶；第14天杀验的那只濒死黄胸鼠有全身播散的大量病灶，针尖至玉米粒大，病灶内有大量PM组织型细胞，培养出大量原菌。第30天后的4只鼠除腹膜及其个别淋巴结残存个别正在愈复的微小病灶外，病灶已趋完全愈复，可有多少不等的多核巨噬细胞反应性增生，初时数量多，其细胞内有大量PM组织型细胞，随后那些PM组织型细胞大量坏死，形成碎片，数量逐渐减少，残存个别至完全消失，病灶纤维化，无或极少培养出原菌。
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第3批：6个实验鼠有不同程度病态，第15～20天杀验，各器官都有大量针尖至黄豆大病灶，5号鼠第20天濒死，剖验各鼠都有大量PM组织型细胞，培养出大量原菌。
第4批：实验鼠都出现病态，第10～15天濒死；第10天起每天杀1组濒死鼠，各鼠前述器官都有大量病灶，内有大量PM组织型细胞，培养都有大量原菌生长。
第5批：实验鼠无病态，分别于接种后第5、7、14、21天杀验。于第7天已见PM分生孢子很厚的孢壁已裂开，释放出酵母样型细胞，第14、21天已形成小病灶。
以上各批实验动物的对照组都无Marneffei青霉。
实验鼠组织病理变化：实验结果表明Marneffei青霉病急性进行期主要是组织细胞和毛细血管增生，形成组织细胞肉芽组织，组织细胞浆内有大量PM组织型细胞，组织可坏死，中性粒细胞浸润形成脓肿，中性粒细胞可吞噬有PM组织型细胞，PM组织型细胞能在中性粒细胞浆内生长、繁殖，此期病菌易早期向全身播散形成大量播散病灶。慢性恢复局限期主要是出现多核巨噬细胞，PM组织型细胞大量坏死，减少、消失，肉芽组织形成，纤维化，病灶逐渐缩小，消失，器官恢复正常或近似正常，或残存瘢痕组织。PM在动物体内与在人体内形态相同。涂片或组织切片用GMSH染色显示菌体和组织，细胞及它们之间的关系较理想，即使菌很少或菌的坏死碎片也能清楚显示。
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3 讨论
3.1 Marneffei青霉致病性：
3.1.1 PM是条件致病菌。这方面未见有实验研究报告。本实验结果表明用不同PM菌型、菌量，接种不同种、不同龄鼠结果不同，出现无病、有病、自愈、局限、播散、死亡。致病有两型：实验组鼠全部或部分康复，病灶逐渐消失，无或极少培养出原菌；少数或全部实验鼠有病，病情逐渐进行性加重，早期向全身播散，病灶多、大、致病性强，致死，易培养出大量原菌，从而首次实验证明PM是条件致病菌，作者的另一实验结果也支持这点(3)。
3.1.2 该菌在不同条件下可以引起两型疾病：自愈、良性、局限型或进行性播散型Marneffei青霉病。部分实验鼠表现为无病、自愈、病灶逐渐局限，消失，纤维化；部分鼠则表现为进行性播散全身，致死，首次用动物实验证明这两型疾病的存在。
3.1.3 PM在体内易早期播散。这方面未见有文献报告。本实验第10天杀验的那只鼠已见少数小散病灶；第14天濒死而杀验的那只鼠已有播散全身大量病灶；第3、4批实验鼠于接种后第10～20天都已有大量播散病灶，濒死，首次以动物实验证明PM在体内易早期播散全身，作者的另实验也支持这点(3)。易早期播散的原因很可能是(1)已经证明该菌在体内易被组织细胞和中性粒细胞吞入其胞浆内，该菌能在这两种细胞浆内生长、繁殖(后者是作者于1983年5月4日从病人脓液涂片内首次发现和证实，未见有文献报告)；(2)早期机体免疫功能未增强到高峰期(接种后第21天)就易在上述两种细胞内和外寄生、大量繁殖；(3)前述这两种细胞具有游走性和随淋巴液、血液流入各种器官的能力；(4)临床应用免疫抑制剂，肾上腺皮质激素和广谱抗菌药物也易促进其播散。
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3.2 敏感动物和最适宜检验时间
3.2.1 实验结果表明在本实验中对PM较敏感的实验鼠类是小白鼠、罗赛鼠、褐家鼠和幼龄板齿鼠。
3.2.2 接种动物第5天内该菌仅有少数变成组织型，病灶小、少，未见有播散病灶，而第7～14～21天则有大量病灶，病灶内有大量PM组织型细胞，具有典型诊断性特征细胞；第30天后病灶逐渐缩小，减少，消失或纤维化，PM组织型细胞大量坏死、减少，所形成碎片，消失，不易培养出原菌，所以要证明所分离出的菌是否是PM的动物实验剖验最适宜时间是接种的第14±7天，否则可因动物自身免疫力增强自愈而失败；要观察病灶的愈复过程和该菌在体内消失过程则以第30～60天以后为好。
本科农勤高主管技师协助做组织病理制片；南宁地区防疫站流行病科凌胤民副主任医师协助捕取野外鼠和做鼠种类鉴定，特此感谢。
参考文献
1 黎而介，韦兴国.马内青霉病4例报告.中国人兽共患病杂志 1987；3(6)：28
2 韦兴国，周力特，张庆三，等.我国首例马内青霉病报告.中华医学杂志 1985；65(9)：533
3 韦兴国，凌胤民，李 臣，等.179只竹鼠马内青霉带菌率调查研究.中国人兽共患病杂志 1987；3(4)：34, http://www.100md.com