脐血分离、冷冻的实验研究△
作者：魏佳雪 廖灿 刘斌 辜少玲
单位：广州市妇婴医院 广州市脐血库*
关键词：脐血分离；冷冻；复温
临床血液学杂志990510 1 材料和方法
①标本来源：47份脐血广州市妇婴医院提供，产妇为健康、足月分娩。标本采集方法按文献〔1〕，采用50 ml以上脐血，<50 ml的标本弃置不用。②分离方法：按1∶5加入6%羟乙基淀粉到脐血袋中，以500 r/min倒置离心5 min，垂挂挤出红细胞部分。混匀后正置1 200 r/min离心13 min，以分浆夹去除血浆部分。③血液分析：应用美国Coulter JT-Ⅱ血细胞计数仪检测分离前后的白细胞数及白细胞分类计数。④台盼蓝拒染法测定细胞活力。⑤祖细胞分析：CFU-GM,BFU-E，CFU-GEMM混合培养体系按文献〔2〕配制，包含粒系刺激因子(G-CSF，100 ng/ml,Kirin公司)，红细胞生成素(EPO，1 U/ml,Sigma公司)，白细胞介素3(IL-3，100 ng/ml，Sigma公司)以及干细胞因子(SCF，50 ng/ml,Sigma公司)，MNC终浓度为2×105。配好的培养体系各2 ml接种于2个35 mm培养皿中，37℃，5% CO2条件下培养14 d计数。⑥CD+34细胞的检测〔5〕：抗体为PE标记的抗人CD+34抗体(美国，Pharmigen公司)，采用FACS流式细胞仪(美国，Becton Dickinshon公司)检测。将100 μl脐血与20 μl抗体混匀后置于4℃孵育30 min，用氯化胺裂解红细胞30 min，PBS洗涤2次，最后经多聚甲醛固定后进行检测，开淋巴细胞窗。⑦冷冻及复温：在冰水浴中向处理后的脐血袋内中入1/8体积的50% DMSO及1/8体积的20%白蛋白做冷冻保护剂(DMSO终浓度为10%，白蛋白为2%)，在4℃水浴中平衡半小时，置程序降温仪(KYRO10 Control-led Rate Freezers,planer co)按说明书中的脐血程序降温至-80℃后，放入液氮中保存。3个月后取出放入37℃水浴中反复摇动1 min复温，复温后立即缓慢加入1/2体积的Dextran及1/2体积的白蛋白，静置平衡5 min后以400G×10 min在10℃条件下离心洗涤。洗涤后如有细胞成团现象，加入100 UDNAse打散。
, http://www.100md.com
2 结果
HES分离脐血：47份脐血体积为50.0～191.1 ml，分离前平均86.3±26.9 ml。应用6% HES沉降RBC，去除血浆，脐血回收20.6±11.7 ml。有核细胞数分离前12.5±4.5，分离后11.1±3.3，回修率90.8±11.2%。其中32份脐血分离后用于冷冻，做各系祖细胞培养，粒系分离前后集落数分别为137.9±30.1，150.3±28.4(P>0.05)；混合系分离前后为6.9±2.6，8.9±3.1(P<0.01)，二者均无明显统计学差别。红系因分离前红细胞较多，未计集落数，分离后集落数为141.1±32(附表)。证实HES分离脐血未造成有核细胞及各系祖细胞的明显损失。
附表 分离脐血冷冻前后集落数及祖细胞回收率(n=32)(
±s) 脐血
分离前
, 百拇医药
分离后
冷冻后
回收率(%)
CFU-G 2×105
137.9±30.1
150.3±28.4
150.8±28.7
100.2±10.4
BFU-E 2×105
141.1±32.0
, http://www.100md.com 134.9±29.0
96.4±10.2
CFU-Mix 2×105
6.9±2.6
8.9±3.10
7.4±2.2
87.1±23.5
CD+34
8.9±1.9
8.7±1.9
8.5±1.6
, 百拇医药
97.4±5.5
*与同系祖细胞分离前集落数比较P>0.05 **冷冻前后各系祖细胞回收率 取32份脐血冷冻，3个月后复温计细胞活率，及各系祖细胞产率、CD34回收率(附表)。复温后的细胞活率为93.6±3.4%，最低亦>87%，而粒系、红系、混合系应用相同的培养体系，在同样条件下培养集落数分别为134.9±29，7.4±2.2。红系及混合系的细胞回收率为87.1%～96.4%，粒系的细胞回收率由于培养条件存在系统误差和计数等原因甚至达到100%，CD+34的回收率为97.43%左右，结果显示祖细胞无明显损失。
3 讨论
目前应用最多的脐血分离方法是Ficoll分离，其操作步骤简单，但应用试管每次分离的脐血量少、回收率只有6%～40%〔3〕，而本实验中所应用的脐血全部>50 ml，最高可达191.1 ml，且有核细胞的回收率远高于Ficoll分离法，可大大提高工作效率。应用HES诱导红细胞沉降加速分离脐血，可将脐血内几乎全部的白细胞浓缩于20 ml左右的体积内，减少每份脐血冷冻所占用的空间，提高单位液氮体积内储存脐血的数量。有助于保持冷冻及复温过程中脐血各部分的均一性，减少造血干祖细胞损伤。此种分离方法与目前实验室中广泛应用的其它分离方法比较，不仅分离效率高，且可以在密闭的系统内进行，不易污染，易于操作，成本较低，是建立脐血库的理想技术。作为冷冻保护剂的DMSO，在常温下有细胞渗透毒性作用。Bucker等〔4〕记载冷冻脐血复温后必须立即回输，否则其造血干祖细胞活力及集落形成能力均显著降低。本项实验中，复温后的脐血立即缓慢加入1/2体积的10% Dextran及1/2体积5%白蛋白，能够迅速降低渗透压差造成的细胞损伤，洗涤后可大大减少DMSO的毒性，提高造血干细胞的活率，利于掌握临床移植的时间。分离后的脐血经冷冻复温后的活力均保持在90%左右；红系、混合系祖细胞的集落回收率87%～94%，与纽约脐血库发表的结果相似〔5〕。由于实验条件和计数等系统、非系统误差原因，冷冻细胞粒系的集落产率高于未冷冻细胞，证实本实验采用的方法对造血干祖细胞的损伤很小，同时说明未成熟细胞较成熟细胞的损伤耐受性更强，能够更好地经历冷冻和复温的过程。冷冻过程中应用50% DMSO可以达到传统应用的20% DMSO同样的效果，而脐血冷冻的终体积(20 ml+5 ml)少于传统的终体积，连同脐血分离减少的体积，可将单位冷冻空间储存的脐血数量较传统方法提高5～10倍(如150 ml脐血，按传统方法冷冻，终体积为300 ml，本方法终体积仅为25 ml)，节省液氮消耗量，降低了贮存费用，利于脐血移植的推广。
, 百拇医药
*邮政编码：广州市，510180
△ 本课题为广东省科委、广州市科委重点课题，广东省卫生厅“五个一”工程
参考文献
[1] Camposs L,Roubin N,Guyotae D,et al.Defination of optimal conditions for collection and cryopreservation of umbilical cord blood heamatopoietic cells.Cryobiology,1995,32:511～516
[2] 裴雪涛，王力生，徐黎，等.造血生长因子对脐血CD+34细胞的体外扩增作用.中华血液学杂志，1996，17：304～305
, 百拇医药
[3] Broxmeyer ME,et al.Cord blood transplantion:an update.EXP Hematol,1994,22:675～679
[4] Bucker CD,Petersen FB,Bolonesi BA.BoneMarrow Transplantion,1994,259～269
[5] Rubinstein P,et al.Processing and cryopreservation of plactal/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution.Proc Natl Acd Sci,1995,92:10119～10122
1998-12-17 收稿 1999-04-26 修回, 百拇医药
单位：广州市妇婴医院 广州市脐血库*
关键词：脐血分离；冷冻；复温
临床血液学杂志990510 1 材料和方法
①标本来源：47份脐血广州市妇婴医院提供，产妇为健康、足月分娩。标本采集方法按文献〔1〕，采用50 ml以上脐血，<50 ml的标本弃置不用。②分离方法：按1∶5加入6%羟乙基淀粉到脐血袋中，以500 r/min倒置离心5 min，垂挂挤出红细胞部分。混匀后正置1 200 r/min离心13 min，以分浆夹去除血浆部分。③血液分析：应用美国Coulter JT-Ⅱ血细胞计数仪检测分离前后的白细胞数及白细胞分类计数。④台盼蓝拒染法测定细胞活力。⑤祖细胞分析：CFU-GM,BFU-E，CFU-GEMM混合培养体系按文献〔2〕配制，包含粒系刺激因子(G-CSF，100 ng/ml,Kirin公司)，红细胞生成素(EPO，1 U/ml,Sigma公司)，白细胞介素3(IL-3，100 ng/ml，Sigma公司)以及干细胞因子(SCF，50 ng/ml,Sigma公司)，MNC终浓度为2×105。配好的培养体系各2 ml接种于2个35 mm培养皿中，37℃，5% CO2条件下培养14 d计数。⑥CD+34细胞的检测〔5〕：抗体为PE标记的抗人CD+34抗体(美国，Pharmigen公司)，采用FACS流式细胞仪(美国，Becton Dickinshon公司)检测。将100 μl脐血与20 μl抗体混匀后置于4℃孵育30 min，用氯化胺裂解红细胞30 min，PBS洗涤2次，最后经多聚甲醛固定后进行检测，开淋巴细胞窗。⑦冷冻及复温：在冰水浴中向处理后的脐血袋内中入1/8体积的50% DMSO及1/8体积的20%白蛋白做冷冻保护剂(DMSO终浓度为10%，白蛋白为2%)，在4℃水浴中平衡半小时，置程序降温仪(KYRO10 Control-led Rate Freezers,planer co)按说明书中的脐血程序降温至-80℃后，放入液氮中保存。3个月后取出放入37℃水浴中反复摇动1 min复温，复温后立即缓慢加入1/2体积的Dextran及1/2体积的白蛋白，静置平衡5 min后以400G×10 min在10℃条件下离心洗涤。洗涤后如有细胞成团现象，加入100 UDNAse打散。
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2 结果
HES分离脐血：47份脐血体积为50.0～191.1 ml，分离前平均86.3±26.9 ml。应用6% HES沉降RBC，去除血浆，脐血回收20.6±11.7 ml。有核细胞数分离前12.5±4.5，分离后11.1±3.3，回修率90.8±11.2%。其中32份脐血分离后用于冷冻，做各系祖细胞培养，粒系分离前后集落数分别为137.9±30.1，150.3±28.4(P>0.05)；混合系分离前后为6.9±2.6，8.9±3.1(P<0.01)，二者均无明显统计学差别。红系因分离前红细胞较多，未计集落数，分离后集落数为141.1±32(附表)。证实HES分离脐血未造成有核细胞及各系祖细胞的明显损失。
附表 分离脐血冷冻前后集落数及祖细胞回收率(n=32)(
±s) 脐血分离前
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分离后
冷冻后
回收率(%)
CFU-G 2×105
137.9±30.1
150.3±28.4
150.8±28.7
100.2±10.4
BFU-E 2×105
141.1±32.0
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96.4±10.2
CFU-Mix 2×105
6.9±2.6
8.9±3.10
7.4±2.2
87.1±23.5
CD+34
8.9±1.9
8.7±1.9
8.5±1.6
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97.4±5.5
*与同系祖细胞分离前集落数比较P>0.05 **冷冻前后各系祖细胞回收率 取32份脐血冷冻，3个月后复温计细胞活率，及各系祖细胞产率、CD34回收率(附表)。复温后的细胞活率为93.6±3.4%，最低亦>87%，而粒系、红系、混合系应用相同的培养体系，在同样条件下培养集落数分别为134.9±29，7.4±2.2。红系及混合系的细胞回收率为87.1%～96.4%，粒系的细胞回收率由于培养条件存在系统误差和计数等原因甚至达到100%，CD+34的回收率为97.43%左右，结果显示祖细胞无明显损失。
3 讨论
目前应用最多的脐血分离方法是Ficoll分离，其操作步骤简单，但应用试管每次分离的脐血量少、回收率只有6%～40%〔3〕，而本实验中所应用的脐血全部>50 ml，最高可达191.1 ml，且有核细胞的回收率远高于Ficoll分离法，可大大提高工作效率。应用HES诱导红细胞沉降加速分离脐血，可将脐血内几乎全部的白细胞浓缩于20 ml左右的体积内，减少每份脐血冷冻所占用的空间，提高单位液氮体积内储存脐血的数量。有助于保持冷冻及复温过程中脐血各部分的均一性，减少造血干祖细胞损伤。此种分离方法与目前实验室中广泛应用的其它分离方法比较，不仅分离效率高，且可以在密闭的系统内进行，不易污染，易于操作，成本较低，是建立脐血库的理想技术。作为冷冻保护剂的DMSO，在常温下有细胞渗透毒性作用。Bucker等〔4〕记载冷冻脐血复温后必须立即回输，否则其造血干祖细胞活力及集落形成能力均显著降低。本项实验中，复温后的脐血立即缓慢加入1/2体积的10% Dextran及1/2体积5%白蛋白，能够迅速降低渗透压差造成的细胞损伤，洗涤后可大大减少DMSO的毒性，提高造血干细胞的活率，利于掌握临床移植的时间。分离后的脐血经冷冻复温后的活力均保持在90%左右；红系、混合系祖细胞的集落回收率87%～94%，与纽约脐血库发表的结果相似〔5〕。由于实验条件和计数等系统、非系统误差原因，冷冻细胞粒系的集落产率高于未冷冻细胞，证实本实验采用的方法对造血干祖细胞的损伤很小，同时说明未成熟细胞较成熟细胞的损伤耐受性更强，能够更好地经历冷冻和复温的过程。冷冻过程中应用50% DMSO可以达到传统应用的20% DMSO同样的效果，而脐血冷冻的终体积(20 ml+5 ml)少于传统的终体积，连同脐血分离减少的体积，可将单位冷冻空间储存的脐血数量较传统方法提高5～10倍(如150 ml脐血，按传统方法冷冻，终体积为300 ml，本方法终体积仅为25 ml)，节省液氮消耗量，降低了贮存费用，利于脐血移植的推广。
, 百拇医药
*邮政编码：广州市，510180
△ 本课题为广东省科委、广州市科委重点课题，广东省卫生厅“五个一”工程
参考文献
[1] Camposs L,Roubin N,Guyotae D,et al.Defination of optimal conditions for collection and cryopreservation of umbilical cord blood heamatopoietic cells.Cryobiology,1995,32:511～516
[2] 裴雪涛，王力生，徐黎，等.造血生长因子对脐血CD+34细胞的体外扩增作用.中华血液学杂志，1996，17：304～305
, 百拇医药
[3] Broxmeyer ME,et al.Cord blood transplantion:an update.EXP Hematol,1994,22:675～679
[4] Bucker CD,Petersen FB,Bolonesi BA.BoneMarrow Transplantion,1994,259～269
[5] Rubinstein P,et al.Processing and cryopreservation of plactal/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution.Proc Natl Acd Sci,1995,92:10119～10122
1998-12-17 收稿 1999-04-26 修回, 百拇医药