造血系统恶性肿瘤WT1基因表达△
作者：王嵘 郁知非 张洹 李菊湘 波西雁
单位：广州暨南大学医学院血液病研究室*
关键词：WT1基因；肿瘤/造血系
临床血液学杂志990503 摘要 目的：了解WT1基因在各造血系统肿瘤中的表达。方法：应用筑巢式RT-PCR检测63例血液系肿瘤WT1基因表达。结果：急性白血病初诊时WT1基因的表达率81.9%，完全缓解期的表达率60.0%；慢性白血病慢性期或加速期并不表达WT1基因，但慢粒进展至原始细胞危象期，均表达WT1基因。造血系统的其它恶性病，如恶性组织细胞病和骨髓增生异常综合征的表达率分别为60.0%和58.3%。正常人外周血并不表达WT1基因，造血系统非肿瘤性疾病的骨髓有核细胞WT1基因表达率极低(1/10)。结论：WT1基因的异常高表达可能与造血系统的恶性肿瘤发病有关。WT1基因的RT-PCR检测可作用白血病残留细胞病检测的一个有用的辅助指标。
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Expression of the WT1 Gene in Hematopoietic Malignancies
Wang Rong,Yu Zhifei,Zhang Yuan,et al
Dept of Hematology,Medical College,Jinan University,Guangzhou,510632
Abstract Objective:Expression of the WT1 gene was studied in hematopioetic malignancies.Method:Nest RT-PCR technique was used to examine the expression of the WT1 gene in 63 patients with various hematopoietic malignancies.Result:Twenty-two out of 27 patients with acute leukemia at diagnosis showed evidence of WT1 gene expression.Chronic leukemia patients with chronic or accelerative phase didn′t express WT1,but when CML patients progressed to blastic crisis,all of them did.WT1 gene expression was also detected in other hematopioetic malignancies,such as malignant histocytosis and MDS (respectively 60% and 58.3%) WT1 expression was absent in normal peripheral blood cell or very infrequent in non-malignant hematologic diseases.Conclusion:Aberant overexpression of the WT1 gene may contribute to hematopoietic neopasia.Monitoring of the WT1 mRNA by RT-PCR would be a suseful marker for the detection of minimal residual disease (MRD) in acute leukemia.
, 百拇医药
Key words WT1 gene Hematopioetic malignancy
对遗传性肾胚胎肿瘤(Wilms′ tumour)的分子遗传学研究导致了WT1基因的发现。WT1基因定位于人类染色体11P13，编码的蛋白质为一转录因子〔1〕。WT1基因除了在wilms′肿瘤上呈功能缺失外，还在多种其它恶性肿瘤上呈异常高表达。本研究应用筑巢式RT-PCR检测63例各种造血系统肿瘤WT1基因的表达，探讨WT1基因在血液系肿瘤发病中所起的作用，及WT1基因的RT-PCR方法检测造血系恶性肿瘤WT1基因的表达，并探讨其在白血病微小残留病检测中的意义。
1 材料与方法
1.1 病例 63例各种血液系统肿瘤病人的外周血和骨髓标本由本校附属华侨医院和广州市各大医院提供。其中急性白血病27例，包括急性髓性白血病(AML)14例，急性淋巴细胞白血病(ALL)13例；慢性白血病14例，包括慢性粒细胞白血病慢性期(CML-CP)或加速期(CML-AP)6例，原始细胞危象期(CML-BC)4例，慢性淋巴细胞白血病(CLL)4例；骨髓增生异常综合征(MDS)12例，恶性组织细胞病10例。另外采集10个正常人外周血和10例造血系非肿瘤性疾病的骨髓有核细胞作为对照。10例造血系非肿瘤性疾病包括溶血性贫血4例，缺铁性贫血3例，感染引起的类白血病反应3例。
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1.2 RNA提取 新鲜外周血或骨髓标本分离细胞后，采用异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取RNA〔2〕。贮存骨髓细胞涂片标本的RNA提取采用改良的异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法。
1.3 cDNA的合成 反应总体积为20 μl，包含1 μgRNA模板、0.2 mM dNTP、500 ng六聚寡核苷酸引物、200 mM DTT、100 U MMLV逆转录酶和1×缓冲液(50 mM Tris HCL，pH 8.3、7.5 mM KCl、3 mM MgCl2)，37℃孵育90 min。
1.4 PCR反应 PCR引物委托中国科学院上海细胞生物研究所合成，其核苷酸序列为：P1：5′-GGC-ATC-TGA-GAC-CAG-TGA-GAA-
3′，P2：5′-GAG-AGT-CAG-ACT-TGA-AAG
, 百拇医药
-CAG-T-3′，P3：5′-GCT-GTC-CCA-CTT-AC
A-GAT-GCA-3′，P4：5′-TCA-AAG-CGC-CA
G-CTG-GAG-TTT-3′。先以cDNA为模板，P1和P2为引物进行第1轮PCR反应，如琼脂糖电泳未见扩增带，再以第1轮PCR反应产物为模板，P3和P4为引物，进行第2轮PCR反应。PCR的反应总体积20 μl，包含0.125 mM dNTP、100 pM引物、3 U Taq DNA聚合酶。PCR的变性、复性、延伸的温度和时间，第1轮分别为94℃×60 s，64℃×60 s，72℃×120 s，循环周期35个；第2轮分别为94℃×40 s，62℃×60 s，72℃×70 s，循环周期32个。
2 结果
2.1 筑巢式RT-PCR检测WT1基因表达的敏感性 用蒸馏水以10倍比例连续稀释K562细胞的cDNA产物，以100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5和10-6共7个浓度梯度，筑巢式PCR检测，结果提示本实验的敏感性约10-4，见附图。
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附图 筑巢式RT-PCR检测WT1基因表达
M：分子量标志，1～3号样本见343 bp的
扩增带，4号样本为阴性对照
2.2 正常人外周血和造血系非肿瘤性疾病病人的骨髓WT1基因表达 10个正常人外周血未见WT1表达，10例造血系非肿瘤性疾病病人中有1人表达WT1基因，这1例病人为感染致类白血病反应者。
2.3 血液系统各种肿瘤WT1基因表达 急性白血病的WT1基因表达率为81.9%(22/27)，与正常人外周血和造血系非肿瘤性疾病比较，差异具有显著性(P<0.01)。其中急性髓系白血病的表达率85.7%，急性淋巴系白血病的表达率76.9%。似乎髓系白血病中的表达率高于淋系，但统计学处理两者并无显著意义。造血系其它恶性疾病，恶组和MDS也表达WT1基因，表达率分别为60.0%和58.3%，与正常人外周血和造血系非肿瘤性疾病比较，差异也具有显著性(P<0.05)。见附表。
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3 讨论
研究结果提示，WT1基因在正常外周血中并不表达，在造血系统非肿瘤性疾病中表达率极低，如在包括溶血性贫血、缺铁性贫血和感染所致的类白血病反应的10例中，仅发现1例表达WT1基因。Baird等〔3〕曾把正常单个核细胞用荧光激活的细胞分离器(FACS)分为CD+34和CD-34细胞群，结果发现CD+34的早期造血前体细胞表达WT1基因，而成熟的CD-34细胞则不表达。本研究在1例类白血病反应中，发现表达WT1基因。这可能与类白血病反应时，粒系反应性增生、CD+34细胞也同时增殖加快有关。本研究提示WT1基因在急性白血病中表达率81.9%，与国外报道的80%～90%的表达率基本相似〔4，5〕。值得注意的是急性白血病完全缓解后，WT1基因的表达率仍高达60%，提示WT1基因的RT-PCR检测可作为白血病残留细胞病检测的一个有用指标。本研究在10例慢性粒细胞白血病的慢性期和加速期，均未检测到WT1基因的表达，但慢粒进展到原始细胞危象期，则都表达WT1基因，提示WT1基因的表达与慢粒白血病的进展有关。
, 百拇医药
附表 WT1基因在造血系统各肿瘤中的表达 肿瘤的类型
阳性例数
总数
阳性(%)
急性白血病
22
27
81.9
ALL初诊
10
13
76.9
AML初诊
, 百拇医药
12
14
85.7
CR期
6
10
60.0
慢性白血病
CML-CP或AP
0
6
0
CML-BC
, 百拇医药
4
4
100.0
CLL
0
4
0
MDS
7
12
58.3
恶组
6
10
, 百拇医药
60.0
除了在白血病中发现WT1外基因表达，本研究还在单核-巨噬细胞系统的恶性病恶组以及干细胞的恶性克隆性疾病MDS中，发现WT1基因也异常高表达。有关WT1基因在MDS和恶性组织细胞病中的表达，尚未有报道。本研究提示在大多数的造血系统恶性肿瘤中，WT1基因呈异常高表达，WT1基因的高表达与造血系统肿瘤的发病有关，但被归类为抑瘤基因的WT1是如何地参与造血系统恶性肿瘤的发病环节?具体的机理仍不清楚。多数的文献报道，应用PCR-SSCP技术并未发现WT1基因突变，WI的反义寡核苷酸阻抑白血病细胞的WT1基因表达后，可引起细胞增殖抑制，并诱导凋亡〔6〕。这些现象提示，在白血病发病过程中，WT1基因起癌基因的作用。但King-Underwood等〔7〕用PCR产物自动荧光测序的方法，在67例急性白血病中，发现8例有WT1基因的突变。对WT1基因的突变、甲基化、作用的调节，以及作用的靶基因等的进一步研究，将有助于更深入而全面地理解WT1基因与白血病发病的关系。
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△广东省卫生厅科学基金资助课题
*邮政编码：广州市，510632
参考文献
[1] Huff V and Saunders GF.Wilms tumor genes.Biochem Biophys Acta,1993,1155:295～306
[2] Chomczynski P and Sacchi N.Single-step of RNA isolation by acid guanidium-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem,1987,162:156～159
[3] Baird P and Simmons P.Expression of the Wilms′ tumor gene (WT1) in normal hematopoiesis.Experi Hematol,1997,25:312～320
, 百拇医药
[4] Menssen HD,Renkl HJ,Rodeck U,et al.Presence of Wilms′ tumor gene (WT1) transcripts and the WT1 nuclear protein in the majority of human acute leukemia.Leukemia,1995,9:1060～1067
[5] Bergmman L.Miething C,Maurer U,et al.High levels of Wilms′ tumor gene WT1 mRNA in AML are associated with worse long-term outcomc.Blood,1997,90:1217～1225
[6] Yamagami T,Sugiyama H,Inoue,et al.Growth inhibition of human leukermic cells by WT1 (wilms tumor gene) antisense oligodeoxynucleotides:Implications for the involvoment of WT1 in leukemogenesis.Blood,1996,87:2878～2884
[7] King-Underwood L,Pritchard-Jones K.Wilms′ tumor (WT1) gene mutations occur mainly in acute myeloid leukemia and may confer drug resistance.Blood,1998,91:2961～2968
1998-11-17 收稿, 百拇医药
单位：广州暨南大学医学院血液病研究室*
关键词：WT1基因；肿瘤/造血系
临床血液学杂志990503 摘要 目的：了解WT1基因在各造血系统肿瘤中的表达。方法：应用筑巢式RT-PCR检测63例血液系肿瘤WT1基因表达。结果：急性白血病初诊时WT1基因的表达率81.9%，完全缓解期的表达率60.0%；慢性白血病慢性期或加速期并不表达WT1基因，但慢粒进展至原始细胞危象期，均表达WT1基因。造血系统的其它恶性病，如恶性组织细胞病和骨髓增生异常综合征的表达率分别为60.0%和58.3%。正常人外周血并不表达WT1基因，造血系统非肿瘤性疾病的骨髓有核细胞WT1基因表达率极低(1/10)。结论：WT1基因的异常高表达可能与造血系统的恶性肿瘤发病有关。WT1基因的RT-PCR检测可作用白血病残留细胞病检测的一个有用的辅助指标。
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Expression of the WT1 Gene in Hematopoietic Malignancies
Wang Rong,Yu Zhifei,Zhang Yuan,et al
Dept of Hematology,Medical College,Jinan University,Guangzhou,510632
Abstract Objective:Expression of the WT1 gene was studied in hematopioetic malignancies.Method:Nest RT-PCR technique was used to examine the expression of the WT1 gene in 63 patients with various hematopoietic malignancies.Result:Twenty-two out of 27 patients with acute leukemia at diagnosis showed evidence of WT1 gene expression.Chronic leukemia patients with chronic or accelerative phase didn′t express WT1,but when CML patients progressed to blastic crisis,all of them did.WT1 gene expression was also detected in other hematopioetic malignancies,such as malignant histocytosis and MDS (respectively 60% and 58.3%) WT1 expression was absent in normal peripheral blood cell or very infrequent in non-malignant hematologic diseases.Conclusion:Aberant overexpression of the WT1 gene may contribute to hematopoietic neopasia.Monitoring of the WT1 mRNA by RT-PCR would be a suseful marker for the detection of minimal residual disease (MRD) in acute leukemia.
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Key words WT1 gene Hematopioetic malignancy
对遗传性肾胚胎肿瘤(Wilms′ tumour)的分子遗传学研究导致了WT1基因的发现。WT1基因定位于人类染色体11P13，编码的蛋白质为一转录因子〔1〕。WT1基因除了在wilms′肿瘤上呈功能缺失外，还在多种其它恶性肿瘤上呈异常高表达。本研究应用筑巢式RT-PCR检测63例各种造血系统肿瘤WT1基因的表达，探讨WT1基因在血液系肿瘤发病中所起的作用，及WT1基因的RT-PCR方法检测造血系恶性肿瘤WT1基因的表达，并探讨其在白血病微小残留病检测中的意义。
1 材料与方法
1.1 病例 63例各种血液系统肿瘤病人的外周血和骨髓标本由本校附属华侨医院和广州市各大医院提供。其中急性白血病27例，包括急性髓性白血病(AML)14例，急性淋巴细胞白血病(ALL)13例；慢性白血病14例，包括慢性粒细胞白血病慢性期(CML-CP)或加速期(CML-AP)6例，原始细胞危象期(CML-BC)4例，慢性淋巴细胞白血病(CLL)4例；骨髓增生异常综合征(MDS)12例，恶性组织细胞病10例。另外采集10个正常人外周血和10例造血系非肿瘤性疾病的骨髓有核细胞作为对照。10例造血系非肿瘤性疾病包括溶血性贫血4例，缺铁性贫血3例，感染引起的类白血病反应3例。
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1.2 RNA提取 新鲜外周血或骨髓标本分离细胞后，采用异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取RNA〔2〕。贮存骨髓细胞涂片标本的RNA提取采用改良的异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法。
1.3 cDNA的合成 反应总体积为20 μl，包含1 μgRNA模板、0.2 mM dNTP、500 ng六聚寡核苷酸引物、200 mM DTT、100 U MMLV逆转录酶和1×缓冲液(50 mM Tris HCL，pH 8.3、7.5 mM KCl、3 mM MgCl2)，37℃孵育90 min。
1.4 PCR反应 PCR引物委托中国科学院上海细胞生物研究所合成，其核苷酸序列为：P1：5′-GGC-ATC-TGA-GAC-CAG-TGA-GAA-
3′，P2：5′-GAG-AGT-CAG-ACT-TGA-AAG
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-CAG-T-3′，P3：5′-GCT-GTC-CCA-CTT-AC
A-GAT-GCA-3′，P4：5′-TCA-AAG-CGC-CA
G-CTG-GAG-TTT-3′。先以cDNA为模板，P1和P2为引物进行第1轮PCR反应，如琼脂糖电泳未见扩增带，再以第1轮PCR反应产物为模板，P3和P4为引物，进行第2轮PCR反应。PCR的反应总体积20 μl，包含0.125 mM dNTP、100 pM引物、3 U Taq DNA聚合酶。PCR的变性、复性、延伸的温度和时间，第1轮分别为94℃×60 s，64℃×60 s，72℃×120 s，循环周期35个；第2轮分别为94℃×40 s，62℃×60 s，72℃×70 s，循环周期32个。
2 结果
2.1 筑巢式RT-PCR检测WT1基因表达的敏感性 用蒸馏水以10倍比例连续稀释K562细胞的cDNA产物，以100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5和10-6共7个浓度梯度，筑巢式PCR检测，结果提示本实验的敏感性约10-4，见附图。
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附图 筑巢式RT-PCR检测WT1基因表达
M：分子量标志，1～3号样本见343 bp的
扩增带，4号样本为阴性对照
2.2 正常人外周血和造血系非肿瘤性疾病病人的骨髓WT1基因表达 10个正常人外周血未见WT1表达，10例造血系非肿瘤性疾病病人中有1人表达WT1基因，这1例病人为感染致类白血病反应者。
2.3 血液系统各种肿瘤WT1基因表达 急性白血病的WT1基因表达率为81.9%(22/27)，与正常人外周血和造血系非肿瘤性疾病比较，差异具有显著性(P<0.01)。其中急性髓系白血病的表达率85.7%，急性淋巴系白血病的表达率76.9%。似乎髓系白血病中的表达率高于淋系，但统计学处理两者并无显著意义。造血系其它恶性疾病，恶组和MDS也表达WT1基因，表达率分别为60.0%和58.3%，与正常人外周血和造血系非肿瘤性疾病比较，差异也具有显著性(P<0.05)。见附表。
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3 讨论
研究结果提示，WT1基因在正常外周血中并不表达，在造血系统非肿瘤性疾病中表达率极低，如在包括溶血性贫血、缺铁性贫血和感染所致的类白血病反应的10例中，仅发现1例表达WT1基因。Baird等〔3〕曾把正常单个核细胞用荧光激活的细胞分离器(FACS)分为CD+34和CD-34细胞群，结果发现CD+34的早期造血前体细胞表达WT1基因，而成熟的CD-34细胞则不表达。本研究在1例类白血病反应中，发现表达WT1基因。这可能与类白血病反应时，粒系反应性增生、CD+34细胞也同时增殖加快有关。本研究提示WT1基因在急性白血病中表达率81.9%，与国外报道的80%～90%的表达率基本相似〔4，5〕。值得注意的是急性白血病完全缓解后，WT1基因的表达率仍高达60%，提示WT1基因的RT-PCR检测可作为白血病残留细胞病检测的一个有用指标。本研究在10例慢性粒细胞白血病的慢性期和加速期，均未检测到WT1基因的表达，但慢粒进展到原始细胞危象期，则都表达WT1基因，提示WT1基因的表达与慢粒白血病的进展有关。
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附表 WT1基因在造血系统各肿瘤中的表达 肿瘤的类型
阳性例数
总数
阳性(%)
急性白血病
22
27
81.9
ALL初诊
10
13
76.9
AML初诊
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12
14
85.7
CR期
6
10
60.0
慢性白血病
CML-CP或AP
0
6
0
CML-BC
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4
4
100.0
CLL
0
4
0
MDS
7
12
58.3
恶组
6
10
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60.0
除了在白血病中发现WT1外基因表达，本研究还在单核-巨噬细胞系统的恶性病恶组以及干细胞的恶性克隆性疾病MDS中，发现WT1基因也异常高表达。有关WT1基因在MDS和恶性组织细胞病中的表达，尚未有报道。本研究提示在大多数的造血系统恶性肿瘤中，WT1基因呈异常高表达，WT1基因的高表达与造血系统肿瘤的发病有关，但被归类为抑瘤基因的WT1是如何地参与造血系统恶性肿瘤的发病环节?具体的机理仍不清楚。多数的文献报道，应用PCR-SSCP技术并未发现WT1基因突变，WI的反义寡核苷酸阻抑白血病细胞的WT1基因表达后，可引起细胞增殖抑制，并诱导凋亡〔6〕。这些现象提示，在白血病发病过程中，WT1基因起癌基因的作用。但King-Underwood等〔7〕用PCR产物自动荧光测序的方法，在67例急性白血病中，发现8例有WT1基因的突变。对WT1基因的突变、甲基化、作用的调节，以及作用的靶基因等的进一步研究，将有助于更深入而全面地理解WT1基因与白血病发病的关系。
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△广东省卫生厅科学基金资助课题
*邮政编码：广州市，510632
参考文献
[1] Huff V and Saunders GF.Wilms tumor genes.Biochem Biophys Acta,1993,1155:295～306
[2] Chomczynski P and Sacchi N.Single-step of RNA isolation by acid guanidium-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem,1987,162:156～159
[3] Baird P and Simmons P.Expression of the Wilms′ tumor gene (WT1) in normal hematopoiesis.Experi Hematol,1997,25:312～320
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[4] Menssen HD,Renkl HJ,Rodeck U,et al.Presence of Wilms′ tumor gene (WT1) transcripts and the WT1 nuclear protein in the majority of human acute leukemia.Leukemia,1995,9:1060～1067
[5] Bergmman L.Miething C,Maurer U,et al.High levels of Wilms′ tumor gene WT1 mRNA in AML are associated with worse long-term outcomc.Blood,1997,90:1217～1225
[6] Yamagami T,Sugiyama H,Inoue,et al.Growth inhibition of human leukermic cells by WT1 (wilms tumor gene) antisense oligodeoxynucleotides:Implications for the involvoment of WT1 in leukemogenesis.Blood,1996,87:2878～2884
[7] King-Underwood L,Pritchard-Jones K.Wilms′ tumor (WT1) gene mutations occur mainly in acute myeloid leukemia and may confer drug resistance.Blood,1998,91:2961～2968
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