过量氟对实验大鼠血清一氧化氮含量及骨发育的影响
作者：许 鹏 张大勇 陈风石 郭 雄
单位：西安医科大学 地方性骨病研究所，陕西 西安 710061
关键词：氟性骨关节病；大鼠；过量氟；一氧化氮；骨发育
中国地方病学杂志990505 [摘要] 目的 为了探讨一氧化氮与氟性骨关节病骨软骨损伤的关系，进行了过量氟对实验性大鼠血清NO含量及骨发育影响的研究。方法 测定了3种不同剂量过量氟实验性大鼠血清的NO含量，对NO含量和大鼠胫骨纵径、横径进行了相关分析。结果 氟中毒大鼠血清NO含量明显升高(P<0.05)，且依氟剂量的增加而递增；血清中NO含量与胫骨纵径、横径呈负相关。结论 过量氟致实验性大鼠血清NO含量升高，依染氟剂量增加而增加；过量氟影响大鼠骨发育。
[中图分类号] O613.41;R336 [文献标识码] A [文章编号]1000-4955(1999)05-0331-03
, 百拇医药
Effect of the excess fluoride on nitric oxide content in serum and the bone development from the experimental rats
XU Peng,ZHANG Da-yong,CHEN Feng-shi,et al
(Institute Endemic Bone Diseases,Xi'an Medical University,Xi'an,710061,China)
[Abstract] Objective In order to understand the relationship between nitric oxide (NO) and the pathologic changes of bone and cartilage in skeletal fluorosis,the effect of the excess fluoride on NO content in serum and the bone development from the experimental rats was investigated in this paper.Methods The NO content in serum from the experimental rats treated with three doses fluoride was detected,and the correlation of the NO content and width and length of tibia was analysed.Results NO content in serum from rats treated with the excess fluoride was significantly increased with the increased dose of fluoride,and the relationship between the NO content and the width as well as length of rats tibias showed a negetive correlation.Conclusions Excess fluoride can increase the serum NO content in the experimental rats,and the more fluoride in drinking water the higher the sereum NO content;excess fluoride may impair the bone development of the experimental rats.
, 百拇医药
[Key words] Skeletal fluorosis;Rat;Excess fluoride;Nitric oxide;Bone development
人和动物从环境中摄入的过量氟可引起体内多种器官及系统的损伤，尤以氟性骨关节病(skeletal fluorosis)明显，表现为全身关节疼痛，关节活动受限，骨骼变形，以至瘫痪，严重地威害病区人民健康。一氧化氮(nitric oxide,NO)是近十几年医学界研究较热的生物信息分子，它在体内广泛参与多种生理病理过程，如调节血管张力、介导炎症和免疫反应等。有研究报道氟化钠可以增加人前髓细胞HL—60细胞NO产生，诱导诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达[1]。但是关于NO与氟性骨关节病的关系，尚未见报道。本文测定了低、中、高3种不同剂量过量氟实验大鼠血清中NO的含量，发现NO含量随染氟剂量的增加而增加，且与大鼠胫骨纵径、横径呈负相关。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 实验动物及分组 42只Wistar大鼠，出生后4～5周，体重50～90g,按体重均衡分组，组内雌雄各半。大鼠自由进食。第1组：对照组，10只，饮蒸馏水；第Ⅱ组：低氟组，12只，饮含氟化钠(NaF)110.5mg/L的蒸馏水；第Ⅲ组：中氟组，10只，饮含氟化钠165.5mg/L的蒸馏水；第Ⅳ组：高氟组，10只，饮含氟化钠221mg/L的蒸馏水。所有大鼠喂以低营养饲料，成份为面粉25%、麸皮20%、玉米粉52%、食盐1%、酵母1%、骨粉1%。动物喂养时间10周。
1.2 血清NO的测定 处死动物前，从股动脉抽取血液，离心出血清。血清NO测定方法用硝酸还原酶法。NO试剂盒为南京聚力生物医学工程研究所生产。取血清样本、重蒸水、标准品各0.1ml,加0.1ml试剂1，靠近液面上方加50μl试剂2，用旋涡混合器充分混匀，置37℃水浴1小时；加0.5ml试剂3和0.5ml试剂4，混匀置室温10分钟，540nm波长测消光值，加试剂后的重蒸水调零；NO含量计算:NO(μmol/
, http://www.100md.com
1.3 胫骨纵径、横径的测量 动物处死后游离出后肢胫骨，用游标卡尺测量纵径及近端和中断的横径。
1.4 统计学分析 所测数据用SPSS 7.5 for Windows软件统计分析，血清NO含量及胫骨纵径、横径用均数加标准差(
±s)表示，组间显著性检验用F检验法，P<0.05，有显著性差异。
2 结果
2.1 过量氟对大鼠血清NO含量及胫骨纵径、横径的影响 表1中可以看出，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组过量氟实验性大鼠血清中NO的含量显著高于正常对照组，且随饮水中染氟剂量的增加而增加。中氟组大鼠血清NO虽高于低氟组，但组间无显著性差异。过量氟对大鼠胫骨的纵径、横径有负影响，依染氟剂量增加胫骨纵径、横径有逐渐缩小的趋势。高氟组胫骨纵径、横径与对照组相比均有显著性差异,但低氟、中氟两组胫骨横径与对照组无统计学差异。
, http://www.100md.com
表1 过量氟实验大鼠血清NO含量及胫骨纵径横径的测定结果 组别
例数
饮水中NaF
含量(mg/L)
NO含量
(μmol/L)
胫骨长度(mm)
胫骨近端宽
(mm)
胫骨中段宽
(mm)
Ⅰ组
, 百拇医药
Ⅱ组
Ⅲ组
Ⅳ组
10
12
10
10
0
110.50
165.50
221.00
59.17±8.71
89.89±16.97
, 百拇医药
94.67±12.20
122.97±20.13
38.33±1.90
36.42±1.08
35.10±0.88
32.22±1.00
6.99±0.27
6.88±0.40
6.85±0.32
6.14±0.55
2.44±0.13
, http://www.100md.com 2.38±0.21
2.32±0.13
2.18±0.14
注：NO、胫骨纵径各组间显著性检验 Ⅰ∶Ⅱ，Ⅰ∶Ⅲ，Ⅰ∶Ⅳ，P<0.05;Ⅱ∶Ⅲ，P>0.05；Ⅱ∶Ⅳ，Ⅲ∶Ⅳ，P<0.05；
胫骨近端横径、胫骨中段横径各组间显著性检验 Ⅰ∶Ⅳ，Ⅱ∶Ⅳ，Ⅲ∶Ⅳ，P<0.05;Ⅰ∶Ⅱ，Ⅰ∶Ⅲ，Ⅱ∶Ⅲ，P>0.05
2.2 大鼠血清NO含量和胫骨纵径、横径的相关分析 从图1-3可以看出，血清NO含量与胫骨纵径、横径呈负相关性趋势，其中以NO含量与胫骨纵径的相关性最显著。
, 百拇医药
图1 实验大鼠血清NO与胫骨纵径的相关分析
图2 实验大鼠血清NO与胫骨近端横径的相关分析
图3 实验大鼠血清NO与胫骨中段横径的相关分析
3 讨论
氟性骨关节病是由摄入过量氟而引起的一种慢性骨关节病，目前全国有270多万患者。摄入的过量氟是否引起体内NO的升高，以及是否损害骨发育及与氟性骨关节病发生发展有关，尚未见报道。正常人及动物体内血清中含有一定量的NO，此生理量的NO是由固有型一氧化氮合酶(cNOS)催化，通过L—精氨酸氧化合成。生理量的NO在体内广泛参与多种生理过程如调节血管张力、参与神经传递等。但在受到外界刺激时，体内多种细胞如巨噬细胞、肝细胞、软骨细胞、滑膜细胞等可表达iNOS，而产生比生理量大的多的NO，且持续时间更长[2]。本研究发现大鼠在给予过量氟时，其血清NO含量增高，并随染氟剂量增加而增加。推测氟进入机体内，刺激上述细胞iNOS的表达，产生NO，从而引起血清NO含量增高。本实验还进一步观察到过量氟对实验大鼠的胫骨纵径、横径有负影响，并依饮水中氟剂量增加胫骨纵径、横径有逐渐缩小趋势，其中高氟组大鼠胫骨纵径、横径的减少更为明显，反映出大鼠骨骼形态上的变化可能与饮水中的氟含量相关。通过对血清NO含量和胫骨纵径、横径的相关性分析，发现NO含量与胫骨纵径、横径呈负相关趋势，随血清NO含量的增高，胫骨纵径、横径减小。有研究表明，病理状态下体内增高的NO可引起组织损伤，并与疾病发展有关。在骨关节病(OA)和类风湿性关节炎(RA)的患者，血清和关节液中NO含量升高，升高的NO对关节软骨有明显的损伤作用，加重病情的发展[3]。动物实验及临床研究发现，NO可以抑制软骨细胞的增殖，促使软骨细胞的凋亡；抑制软骨细胞蛋白多糖的合成，增加关节中金属蛋白酶的产生；作用于脯氨酰羟化酶，抑制软骨细胞胶原的合成，增加关节中胶原酶的产生[4～8]。对于升高的NO是否有可能损伤实验大鼠的骺板软骨，影响软骨内成骨而致骨骼发育障碍，还须进一步研究验证。
, 百拇医药
综上所述，通过测定3种剂量过量氟实验性大鼠血清中NO含量，分析了NO含量和胫骨纵径、横径的相关性，发现过量氟可引起实验性大鼠血清中NO含量增高，且依给氟剂量的增加而增加，NO含量与胫骨纵径、横径呈负相关。
(致谢：地方性骨病研究所李广元教授、曾令霞讲师、耿 冬技士给予了实验方法上的帮助)
参考文献
[1] Shingu M,Isayama T,Yasutake C,et al.Role of oxygen radicals and IL-6 in IL-1-dependent cartilage matrix degradation[J].Inflammation,1994,18:613-623.
[2] Robert M,Ashok R,Steven B.The role of nitric oxide in inflammation and immunity[J].Arthritis Rheum,1998,41:1141-1151.
, 百拇医药
[3] Miyasaka N,Hirata Y.Nitric oxide and inflammtory arthritides[J].Life Sci,1997,61:2073-2081.
[4] Blanco FJ,Lotz M.IL-1-induced nitric oxide inhibits chondrocyte proliferation via PGE2[J].Exp Cell Res,1995,318:319-325
[5] Blanco FJ,Galdo F,de Toro FJ,et al.Osteoarthritis chondrocytes die by apoptosis,a possible pathway for osteoarthritis pathology[J].Arthritis Rheum,1998,41:284-289.
[6] Hauselmann HJ,Evans CH,Michel DA,et al.Differences in nitric oxide product by superficial and deep human articular chondrocytes:implications for proteoglycan turnover in inflammatory joint disease[J].J Immunol,1998,160:1444-1448.
, http://www.100md.com
[7] Cao M,Evans CH,Stefanovic-Racic M,et al.Nitric oxide inhibits the synthesis of the Ⅱ collagen without altering Col2A1 mRNA abundance proly1 hydroxylase as a possible target[J].Biochem J,1997,324:305-310.
[8] Pelletier J-P,Jovanovic D,Julio C.Reduced progression of experimental osteoarthritis in vivo by selective inhibition of inducible nitric oxide synthase[J].Arthritis Rheum,1998,41:1275-1286., 百拇医药
单位：西安医科大学 地方性骨病研究所，陕西 西安 710061
关键词：氟性骨关节病；大鼠；过量氟；一氧化氮；骨发育
中国地方病学杂志990505 [摘要] 目的 为了探讨一氧化氮与氟性骨关节病骨软骨损伤的关系，进行了过量氟对实验性大鼠血清NO含量及骨发育影响的研究。方法 测定了3种不同剂量过量氟实验性大鼠血清的NO含量，对NO含量和大鼠胫骨纵径、横径进行了相关分析。结果 氟中毒大鼠血清NO含量明显升高(P<0.05)，且依氟剂量的增加而递增；血清中NO含量与胫骨纵径、横径呈负相关。结论 过量氟致实验性大鼠血清NO含量升高，依染氟剂量增加而增加；过量氟影响大鼠骨发育。
[中图分类号] O613.41;R336 [文献标识码] A [文章编号]1000-4955(1999)05-0331-03
, 百拇医药
Effect of the excess fluoride on nitric oxide content in serum and the bone development from the experimental rats
XU Peng,ZHANG Da-yong,CHEN Feng-shi,et al
(Institute Endemic Bone Diseases,Xi'an Medical University,Xi'an,710061,China)
[Abstract] Objective In order to understand the relationship between nitric oxide (NO) and the pathologic changes of bone and cartilage in skeletal fluorosis,the effect of the excess fluoride on NO content in serum and the bone development from the experimental rats was investigated in this paper.Methods The NO content in serum from the experimental rats treated with three doses fluoride was detected,and the correlation of the NO content and width and length of tibia was analysed.Results NO content in serum from rats treated with the excess fluoride was significantly increased with the increased dose of fluoride,and the relationship between the NO content and the width as well as length of rats tibias showed a negetive correlation.Conclusions Excess fluoride can increase the serum NO content in the experimental rats,and the more fluoride in drinking water the higher the sereum NO content;excess fluoride may impair the bone development of the experimental rats.
, 百拇医药
[Key words] Skeletal fluorosis;Rat;Excess fluoride;Nitric oxide;Bone development
人和动物从环境中摄入的过量氟可引起体内多种器官及系统的损伤，尤以氟性骨关节病(skeletal fluorosis)明显，表现为全身关节疼痛，关节活动受限，骨骼变形，以至瘫痪，严重地威害病区人民健康。一氧化氮(nitric oxide,NO)是近十几年医学界研究较热的生物信息分子，它在体内广泛参与多种生理病理过程，如调节血管张力、介导炎症和免疫反应等。有研究报道氟化钠可以增加人前髓细胞HL—60细胞NO产生，诱导诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达[1]。但是关于NO与氟性骨关节病的关系，尚未见报道。本文测定了低、中、高3种不同剂量过量氟实验大鼠血清中NO的含量，发现NO含量随染氟剂量的增加而增加，且与大鼠胫骨纵径、横径呈负相关。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 实验动物及分组 42只Wistar大鼠，出生后4～5周，体重50～90g,按体重均衡分组，组内雌雄各半。大鼠自由进食。第1组：对照组，10只，饮蒸馏水；第Ⅱ组：低氟组，12只，饮含氟化钠(NaF)110.5mg/L的蒸馏水；第Ⅲ组：中氟组，10只，饮含氟化钠165.5mg/L的蒸馏水；第Ⅳ组：高氟组，10只，饮含氟化钠221mg/L的蒸馏水。所有大鼠喂以低营养饲料，成份为面粉25%、麸皮20%、玉米粉52%、食盐1%、酵母1%、骨粉1%。动物喂养时间10周。
1.2 血清NO的测定 处死动物前，从股动脉抽取血液，离心出血清。血清NO测定方法用硝酸还原酶法。NO试剂盒为南京聚力生物医学工程研究所生产。取血清样本、重蒸水、标准品各0.1ml,加0.1ml试剂1，靠近液面上方加50μl试剂2，用旋涡混合器充分混匀，置37℃水浴1小时；加0.5ml试剂3和0.5ml试剂4，混匀置室温10分钟，540nm波长测消光值，加试剂后的重蒸水调零；NO含量计算:NO(μmol/
, http://www.100md.com
1.3 胫骨纵径、横径的测量 动物处死后游离出后肢胫骨，用游标卡尺测量纵径及近端和中断的横径。
1.4 统计学分析 所测数据用SPSS 7.5 for Windows软件统计分析，血清NO含量及胫骨纵径、横径用均数加标准差(
±s)表示，组间显著性检验用F检验法，P<0.05，有显著性差异。2 结果
2.1 过量氟对大鼠血清NO含量及胫骨纵径、横径的影响 表1中可以看出，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组过量氟实验性大鼠血清中NO的含量显著高于正常对照组，且随饮水中染氟剂量的增加而增加。中氟组大鼠血清NO虽高于低氟组，但组间无显著性差异。过量氟对大鼠胫骨的纵径、横径有负影响，依染氟剂量增加胫骨纵径、横径有逐渐缩小的趋势。高氟组胫骨纵径、横径与对照组相比均有显著性差异,但低氟、中氟两组胫骨横径与对照组无统计学差异。
, http://www.100md.com
表1 过量氟实验大鼠血清NO含量及胫骨纵径横径的测定结果 组别
例数
饮水中NaF
含量(mg/L)
NO含量
(μmol/L)
胫骨长度(mm)
胫骨近端宽
(mm)
胫骨中段宽
(mm)
Ⅰ组
, 百拇医药
Ⅱ组
Ⅲ组
Ⅳ组
10
12
10
10
0
110.50
165.50
221.00
59.17±8.71
89.89±16.97
, 百拇医药
94.67±12.20
122.97±20.13
38.33±1.90
36.42±1.08
35.10±0.88
32.22±1.00
6.99±0.27
6.88±0.40
6.85±0.32
6.14±0.55
2.44±0.13
, http://www.100md.com 2.38±0.21
2.32±0.13
2.18±0.14
注：NO、胫骨纵径各组间显著性检验 Ⅰ∶Ⅱ，Ⅰ∶Ⅲ，Ⅰ∶Ⅳ，P<0.05;Ⅱ∶Ⅲ，P>0.05；Ⅱ∶Ⅳ，Ⅲ∶Ⅳ，P<0.05；
胫骨近端横径、胫骨中段横径各组间显著性检验 Ⅰ∶Ⅳ，Ⅱ∶Ⅳ，Ⅲ∶Ⅳ，P<0.05;Ⅰ∶Ⅱ，Ⅰ∶Ⅲ，Ⅱ∶Ⅲ，P>0.05
2.2 大鼠血清NO含量和胫骨纵径、横径的相关分析 从图1-3可以看出，血清NO含量与胫骨纵径、横径呈负相关性趋势，其中以NO含量与胫骨纵径的相关性最显著。
, 百拇医药
图1 实验大鼠血清NO与胫骨纵径的相关分析
图2 实验大鼠血清NO与胫骨近端横径的相关分析
图3 实验大鼠血清NO与胫骨中段横径的相关分析
3 讨论
氟性骨关节病是由摄入过量氟而引起的一种慢性骨关节病，目前全国有270多万患者。摄入的过量氟是否引起体内NO的升高，以及是否损害骨发育及与氟性骨关节病发生发展有关，尚未见报道。正常人及动物体内血清中含有一定量的NO，此生理量的NO是由固有型一氧化氮合酶(cNOS)催化，通过L—精氨酸氧化合成。生理量的NO在体内广泛参与多种生理过程如调节血管张力、参与神经传递等。但在受到外界刺激时，体内多种细胞如巨噬细胞、肝细胞、软骨细胞、滑膜细胞等可表达iNOS，而产生比生理量大的多的NO，且持续时间更长[2]。本研究发现大鼠在给予过量氟时，其血清NO含量增高，并随染氟剂量增加而增加。推测氟进入机体内，刺激上述细胞iNOS的表达，产生NO，从而引起血清NO含量增高。本实验还进一步观察到过量氟对实验大鼠的胫骨纵径、横径有负影响，并依饮水中氟剂量增加胫骨纵径、横径有逐渐缩小趋势，其中高氟组大鼠胫骨纵径、横径的减少更为明显，反映出大鼠骨骼形态上的变化可能与饮水中的氟含量相关。通过对血清NO含量和胫骨纵径、横径的相关性分析，发现NO含量与胫骨纵径、横径呈负相关趋势，随血清NO含量的增高，胫骨纵径、横径减小。有研究表明，病理状态下体内增高的NO可引起组织损伤，并与疾病发展有关。在骨关节病(OA)和类风湿性关节炎(RA)的患者，血清和关节液中NO含量升高，升高的NO对关节软骨有明显的损伤作用，加重病情的发展[3]。动物实验及临床研究发现，NO可以抑制软骨细胞的增殖，促使软骨细胞的凋亡；抑制软骨细胞蛋白多糖的合成，增加关节中金属蛋白酶的产生；作用于脯氨酰羟化酶，抑制软骨细胞胶原的合成，增加关节中胶原酶的产生[4～8]。对于升高的NO是否有可能损伤实验大鼠的骺板软骨，影响软骨内成骨而致骨骼发育障碍，还须进一步研究验证。
, 百拇医药
综上所述，通过测定3种剂量过量氟实验性大鼠血清中NO含量，分析了NO含量和胫骨纵径、横径的相关性，发现过量氟可引起实验性大鼠血清中NO含量增高，且依给氟剂量的增加而增加，NO含量与胫骨纵径、横径呈负相关。
(致谢：地方性骨病研究所李广元教授、曾令霞讲师、耿 冬技士给予了实验方法上的帮助)
参考文献
[1] Shingu M,Isayama T,Yasutake C,et al.Role of oxygen radicals and IL-6 in IL-1-dependent cartilage matrix degradation[J].Inflammation,1994,18:613-623.
[2] Robert M,Ashok R,Steven B.The role of nitric oxide in inflammation and immunity[J].Arthritis Rheum,1998,41:1141-1151.
, 百拇医药
[3] Miyasaka N,Hirata Y.Nitric oxide and inflammtory arthritides[J].Life Sci,1997,61:2073-2081.
[4] Blanco FJ,Lotz M.IL-1-induced nitric oxide inhibits chondrocyte proliferation via PGE2[J].Exp Cell Res,1995,318:319-325
[5] Blanco FJ,Galdo F,de Toro FJ,et al.Osteoarthritis chondrocytes die by apoptosis,a possible pathway for osteoarthritis pathology[J].Arthritis Rheum,1998,41:284-289.
[6] Hauselmann HJ,Evans CH,Michel DA,et al.Differences in nitric oxide product by superficial and deep human articular chondrocytes:implications for proteoglycan turnover in inflammatory joint disease[J].J Immunol,1998,160:1444-1448.
, http://www.100md.com
[7] Cao M,Evans CH,Stefanovic-Racic M,et al.Nitric oxide inhibits the synthesis of the Ⅱ collagen without altering Col2A1 mRNA abundance proly1 hydroxylase as a possible target[J].Biochem J,1997,324:305-310.
[8] Pelletier J-P,Jovanovic D,Julio C.Reduced progression of experimental osteoarthritis in vivo by selective inhibition of inducible nitric oxide synthase[J].Arthritis Rheum,1998,41:1275-1286., 百拇医药