胃泌素和生长抑素在大肠癌组织中的表达及其意义
作者：袁平 吴佩 林鸿民 张允贵
单位：241000 皖南医学院病理学教研室(袁平、林鸿民、张允贵)，附属弋矶山医院普外科(吴佩)
关键词：
摘要 目的 摘要 目的：应用免疫组织化学方法观察实验性兔腰髓缺血40 min、再灌流4 h的脊髓运动神经元胞体和轴突的病理学改变。方法：采用神经元特异性烯醇酶(NSE)抗体和神经中丝(NF)抗体分别特异标记神经元胞体和轴突，结果进行图象分析。结果：缺血40 min，前角运动神经元胞体和轴突内NSE和NF反应异常地增强，胞体内NSE和NF分布紊乱聚集。再灌流4 h，前角运动神经元胞体和轴突内反应阳性，胞体内分布散乱、稀疏、崩溃和溶解，轴突肿胀、扩大、消失。图象分析前角运动神经元胞体内NSE和NF的面积、灰度和前索内轴突的数量，其结果具有明显的统计学意义。结论：免疫组织化学方法能更清楚地显示脊髓运动神经元胞体和轴突的病理学改变。
, 百拇医药
The Immunohistochemical Evaluation in Experimental Ischemic Spinal Cord Injury
Li Changyou, Lin Guohong
Department of Orthopaedic Surgery,The First Clinical College,China Medical University,Shenyang,110001
ABSTRACT Objective:The paper was to evaluate possible significances of immunohistological method in assessing experimental ischemic damage on the spinal cord.Methods:Neuron specific endolase(NSE) and neurofilament(NF) antibody were used to specifically label cell bodies and axons of the neuron in the spinal cord,and results were analysed by the methods of the image pattern analyis.Results:The excessive misaccumulation of NSE and NF were observed in the cell bodies and axons of motorneurons in ventral horn after 40 min of ischemia, and the distributions of NSE and NF in the cell bodies were accumulative. The NSE and NF immunohistochemical reaction could be shown in the cell bodies and axons of motorneuorns after 4 h of reperfusion,and the distributions were divergent,rare and disintegrative,the axons were swollen and vanish. The areas,grey levels of NSE and NF in the cell bodies and the numbers of axons in the anterior funiculus were measured and the statistical analysis showed the significance difference.Conclusion:The pathological changes of cell bodies and axons of motorneurons were demonstrated clearly by immunohistochemical reaction.
, 百拇医药
KEY WORDS spinal cord; ischemia; immunohistochemistry
免疫组织化学方法在实验性脊髓损伤评价方面的报道较少。本实验应用神经元特异性烯醇酶(neuron specific endolase,NSE)和神经中丝(neurofilament,NF)抗体对实验性脊髓缺血损伤进行评价。
1 材料与方法
1.1 实验动物和手术
健康雄性日本大耳白兔23只，体重2.1～3.0 kg，平均(2.58±0.40)kg。全部动物均在同一实验室按相同饲养方法由专人饲养。实验动物手术和监测详见参考文献[1]。
1.2 免疫组织化学染色
缺血前、缺血40 min、再灌流4 h，分别在活体状态下，取同一伤段脊髓行病理学检查。标本固定于10%中性福尔马林液中。标本常规制样。HE、尼氏染色供一般病理学研究。
, http://www.100md.com
免疫组织化学染色方法如下：石蜡切片脱蜡和水化，0.3% H2O2和甲醇(1∶9)室温下孵育15 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。3%正常羊血清室温下孵育10 min，减少非特异性背景。应用多克隆神经元特异性烯醇酶(NSE)抗体和单克隆神经中丝(NF)抗体(70 kd+200 kd)(Maxim)室温下孵育60 min进行抗原抗体特异结合。生物素标记的羊抗鼠IgG(Maxim)室温下孵育10 min。加链霉菌抗生物素蛋白—过氧化酶室温下孵育10 min。新鲜DBA溶液显色，显微镜下观察3～5 min，中性树胶封固。每步之间均用PBS冲洗3次，每次3～5 min。阳性呈黄色，阴性对照片用PBS代替第一抗体。
1.3 图象分析处理
应用日本Luzex-F型图像分析系统，在20倍物镜下随机测定缺血前、缺血40 min、再灌流4 h各组脊髓前角30个有核细胞神经丝的平均面积和平均灰度。同时测定各切片脊髓前索内轴突数量。
, 百拇医药
1.4 统计学处理
所有测定值以平均值±标准差表示。统计学意义通过F检验和t检验进行评价，P<0.05为具有显著性差异。
2 结果
2.1 NSE和NF免疫组织化学改变
免去第一抗体的所有标本都呈NF阴性反应。
缺血前组：前角运动神经元轮廓清楚，多极形，细胞核轮廓清晰可见。NSE和NF染色呈丝网状均匀分布于胞浆中。前索轴突分布均匀，轴突NSE和NF染色均匀一致。
缺血40 min组：前角运动神经元肿胀，胞核轮廓尚清楚。NSE和NF呈强阳性不均匀分布于胞质中，排列紊乱聚集。前索轴突散乱分布，NSE和NF染色强阳性。
, 百拇医药
再灌流4 h组：前角运动神经元固缩，变小，大致呈三角形。胞核结构大多萎缩消失。NSE和NF染色阳性，分布紊乱、稀疏、溶解、消失。前索轴突分布明显紊乱，轴突肿胀、扩大、消失，轴突内NSE和NF染色阳性。
2.2 图象分析结果
缺血40 min组前角运动细胞NSE和NF平均灰度明显低于缺血前组(P<0.01)，再灌流4 h组平均灰度低于缺血前组(P<0.05)，且与缺血40 min组比较P<0.01。结果见表1。
表1 脊髓缺血再灌流NSE和NF图像分析结果(
±s)
指标
, http://www.100md.com
组别
平均灰度
平均面积(μm2)
轴突平均数量
NSE
缺血前
121.75±20.02
1009.43±232.58
1435.10±297.88
缺血40min
58.92±7.68**
, http://www.100md.com 986.95±190.53Δ
1196.52±250.12*
再灌流4h
98.53±16.74*
560.72±132.18**
790.95±140.32**
NF
缺血前
106.95±17.83
1093.88±207.65
, http://www.100md.com
1563.72±336.51
缺血40min
53.32±8.92**
1005.96±186.72Δ
1237.38±243.55*
再灌流4h
89.56±13.61*
590.82±157.62**
842.76±126.58**
, http://www.100md.com **P<0.01 *P<0.05 ΔP>0.05
3 讨论
脊髓损伤的基础研究方法很多，但免疫组织化学方法在实验性脊髓损伤方面研究很少。本实验采用NSE和NF抗体分别特异地显示运动神经元胞体和轴突缺血损伤的病理改变。神经元特异性烯醇酶(neuron specific enolase,NSE)是哺乳动物5种烯醇酶同工酶之一。其胞浆二聚体由γγ亚基组成。因其主要存在于神经元和神经内分泌细胞[2]而得名。已知NSE是成熟神经元的标志酶，也是分化神经元的一种分子标记物。目前NSE主要应用于神经系统和神经内分泌细胞肿瘤的标记研究中[3]。Royds等[4]报道了NSE在脑内神经元损伤中的改变，通过检查212例各种神经系统疾病病人CSF中的NSE水平，指明NSE是神经系统疾病和神经元损伤的敏感标志物，NSE水平可作为神经元损伤及其程度的指标。在细胞骨架结构中，神经丝(Neurofilaments,NF)是神经元特异中间丝，由神经丝蛋白构成，对于维持细胞的特定形状及多种细胞生理功能具有重要的意义。它广泛分布于神经元的胞体和突起内，这种特异性组织学分布是胚胎发育过程中获得并一直维持下来的。神经丝由3种主要多肽类亚单位(70 kd,160 kd,200 kd)组成[5]，本抗体能与70 kd及200 kd亚单位起反应，特异性标记脊髓运动神经元和神经突起[6]。
, 百拇医药
脊髓损伤后病理生理机制非常复杂，各种原因均可引起神经元胞体和轴突病变。烯醇酶是一种糖酵解酶，脊髓缺血损伤后代谢紊乱，NSE发生改变。NSE在胞体合成并通过突起运输至终末，所以脊髓损伤后胞体和轴突内NSE均有改变。脊髓缺血再灌时胞体和轴突内脂质过氧化水平增高，钙激活的中性蛋白酶(CANP)活化，分解NF成小片断，导致NF降解，细胞骨架解体，形成轴突空泡样变性和Waller溃变[7]。
本实验证实缺血40 min神经元胞体NSE和NF呈强阳性反应，NSE和NF紊乱聚集，分布不均匀。说明了缺血40min神经元胞体和轴突有明确的免疫组织化学方面病理学损伤。再灌流4h NSE和NF反应阳性，分布紊乱、稀疏、崩溃、溶解，轴突肿胀、扩大、消失，病理性损伤进一步加重。上述结果用图象分析，经统计学比较而证实。这与作者用脊髓血流(SCBF)、超微结构、自由基观察到的缺血后再灌注损伤结果一致[1]。本实验证实免疫组织化学方法较一般病理组织学方法能更清楚地显示脊髓神经元胞体和轴突病变。NSE可作为脊髓神经元损伤及其程度的指标，细胞骨架紊乱在脊髓损伤后神经元的病理发病机制中起重要作用。
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参考文献
1 李长有，王星铎，金明熙，等.应用激光多普勒血流仪监测兔急性脊髓缺血损伤后腰髓血流动力学变化及病理学观察的研究.中华骨科杂志，1997，5：299—303
2 Schmechel DE,Marangos PJ,Zis AP,et al. Brain enolases as specific markers of neuronal and glial cells. Science,1978,199:313-317
3 Vinores SA,Bonnin JM,Rubinstein LT,et al. Immunohisto-chemical demonstration of neuron-specific enolase in neoplasms of the CNS and other tissues. Arch Pathol Lab Med,1984,108:536—541
, 百拇医药
4 Royds JA,Davies-Jones GAB,Lewtas NA,et al. Enolase isoenzymes in the cerebrospinal fluid of patients with diseases of the nervous system. J Neurol Neurosurg Psychiatry,1983,46:1031-1038
5 Liem RK,Yen SH,Solomon GE,et al. Intermediate filaments in nervous tissues. J Cell Biol,1978,79:637-641
6 Dahl D. Immunohistochemical differences between neurofilam-ents in perilarya,dendrites and axon. Ext Cell Res,1983,149:379-400
7 Schlaepfer WW. Neurofilaments:structure,metabolosmand implications in disease. J Neuropathol Exp Neurol,1987,46:117-119
1998-06-29收稿, 百拇医药
单位：241000 皖南医学院病理学教研室(袁平、林鸿民、张允贵)，附属弋矶山医院普外科(吴佩)
关键词：
摘要 目的 摘要 目的：应用免疫组织化学方法观察实验性兔腰髓缺血40 min、再灌流4 h的脊髓运动神经元胞体和轴突的病理学改变。方法：采用神经元特异性烯醇酶(NSE)抗体和神经中丝(NF)抗体分别特异标记神经元胞体和轴突，结果进行图象分析。结果：缺血40 min，前角运动神经元胞体和轴突内NSE和NF反应异常地增强，胞体内NSE和NF分布紊乱聚集。再灌流4 h，前角运动神经元胞体和轴突内反应阳性，胞体内分布散乱、稀疏、崩溃和溶解，轴突肿胀、扩大、消失。图象分析前角运动神经元胞体内NSE和NF的面积、灰度和前索内轴突的数量，其结果具有明显的统计学意义。结论：免疫组织化学方法能更清楚地显示脊髓运动神经元胞体和轴突的病理学改变。
, 百拇医药
The Immunohistochemical Evaluation in Experimental Ischemic Spinal Cord Injury
Li Changyou, Lin Guohong
Department of Orthopaedic Surgery,The First Clinical College,China Medical University,Shenyang,110001
ABSTRACT Objective:The paper was to evaluate possible significances of immunohistological method in assessing experimental ischemic damage on the spinal cord.Methods:Neuron specific endolase(NSE) and neurofilament(NF) antibody were used to specifically label cell bodies and axons of the neuron in the spinal cord,and results were analysed by the methods of the image pattern analyis.Results:The excessive misaccumulation of NSE and NF were observed in the cell bodies and axons of motorneurons in ventral horn after 40 min of ischemia, and the distributions of NSE and NF in the cell bodies were accumulative. The NSE and NF immunohistochemical reaction could be shown in the cell bodies and axons of motorneuorns after 4 h of reperfusion,and the distributions were divergent,rare and disintegrative,the axons were swollen and vanish. The areas,grey levels of NSE and NF in the cell bodies and the numbers of axons in the anterior funiculus were measured and the statistical analysis showed the significance difference.Conclusion:The pathological changes of cell bodies and axons of motorneurons were demonstrated clearly by immunohistochemical reaction.
, 百拇医药
KEY WORDS spinal cord; ischemia; immunohistochemistry
免疫组织化学方法在实验性脊髓损伤评价方面的报道较少。本实验应用神经元特异性烯醇酶(neuron specific endolase,NSE)和神经中丝(neurofilament,NF)抗体对实验性脊髓缺血损伤进行评价。
1 材料与方法
1.1 实验动物和手术
健康雄性日本大耳白兔23只，体重2.1～3.0 kg，平均(2.58±0.40)kg。全部动物均在同一实验室按相同饲养方法由专人饲养。实验动物手术和监测详见参考文献[1]。
1.2 免疫组织化学染色
缺血前、缺血40 min、再灌流4 h，分别在活体状态下，取同一伤段脊髓行病理学检查。标本固定于10%中性福尔马林液中。标本常规制样。HE、尼氏染色供一般病理学研究。
, http://www.100md.com
免疫组织化学染色方法如下：石蜡切片脱蜡和水化，0.3% H2O2和甲醇(1∶9)室温下孵育15 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。3%正常羊血清室温下孵育10 min，减少非特异性背景。应用多克隆神经元特异性烯醇酶(NSE)抗体和单克隆神经中丝(NF)抗体(70 kd+200 kd)(Maxim)室温下孵育60 min进行抗原抗体特异结合。生物素标记的羊抗鼠IgG(Maxim)室温下孵育10 min。加链霉菌抗生物素蛋白—过氧化酶室温下孵育10 min。新鲜DBA溶液显色，显微镜下观察3～5 min，中性树胶封固。每步之间均用PBS冲洗3次，每次3～5 min。阳性呈黄色，阴性对照片用PBS代替第一抗体。
1.3 图象分析处理
应用日本Luzex-F型图像分析系统，在20倍物镜下随机测定缺血前、缺血40 min、再灌流4 h各组脊髓前角30个有核细胞神经丝的平均面积和平均灰度。同时测定各切片脊髓前索内轴突数量。
, 百拇医药
1.4 统计学处理
所有测定值以平均值±标准差表示。统计学意义通过F检验和t检验进行评价，P<0.05为具有显著性差异。
2 结果
2.1 NSE和NF免疫组织化学改变
免去第一抗体的所有标本都呈NF阴性反应。
缺血前组：前角运动神经元轮廓清楚，多极形，细胞核轮廓清晰可见。NSE和NF染色呈丝网状均匀分布于胞浆中。前索轴突分布均匀，轴突NSE和NF染色均匀一致。
缺血40 min组：前角运动神经元肿胀，胞核轮廓尚清楚。NSE和NF呈强阳性不均匀分布于胞质中，排列紊乱聚集。前索轴突散乱分布，NSE和NF染色强阳性。
, 百拇医药
再灌流4 h组：前角运动神经元固缩，变小，大致呈三角形。胞核结构大多萎缩消失。NSE和NF染色阳性，分布紊乱、稀疏、溶解、消失。前索轴突分布明显紊乱，轴突肿胀、扩大、消失，轴突内NSE和NF染色阳性。
2.2 图象分析结果
缺血40 min组前角运动细胞NSE和NF平均灰度明显低于缺血前组(P<0.01)，再灌流4 h组平均灰度低于缺血前组(P<0.05)，且与缺血40 min组比较P<0.01。结果见表1。
表1 脊髓缺血再灌流NSE和NF图像分析结果(
±s)指标
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组别
平均灰度
平均面积(μm2)
轴突平均数量
NSE
缺血前
121.75±20.02
1009.43±232.58
1435.10±297.88
缺血40min
58.92±7.68**
, http://www.100md.com 986.95±190.53Δ
1196.52±250.12*
再灌流4h
98.53±16.74*
560.72±132.18**
790.95±140.32**
NF
缺血前
106.95±17.83
1093.88±207.65
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1563.72±336.51
缺血40min
53.32±8.92**
1005.96±186.72Δ
1237.38±243.55*
再灌流4h
89.56±13.61*
590.82±157.62**
842.76±126.58**
, http://www.100md.com **P<0.01 *P<0.05 ΔP>0.05
3 讨论
脊髓损伤的基础研究方法很多，但免疫组织化学方法在实验性脊髓损伤方面研究很少。本实验采用NSE和NF抗体分别特异地显示运动神经元胞体和轴突缺血损伤的病理改变。神经元特异性烯醇酶(neuron specific enolase,NSE)是哺乳动物5种烯醇酶同工酶之一。其胞浆二聚体由γγ亚基组成。因其主要存在于神经元和神经内分泌细胞[2]而得名。已知NSE是成熟神经元的标志酶，也是分化神经元的一种分子标记物。目前NSE主要应用于神经系统和神经内分泌细胞肿瘤的标记研究中[3]。Royds等[4]报道了NSE在脑内神经元损伤中的改变，通过检查212例各种神经系统疾病病人CSF中的NSE水平，指明NSE是神经系统疾病和神经元损伤的敏感标志物，NSE水平可作为神经元损伤及其程度的指标。在细胞骨架结构中，神经丝(Neurofilaments,NF)是神经元特异中间丝，由神经丝蛋白构成，对于维持细胞的特定形状及多种细胞生理功能具有重要的意义。它广泛分布于神经元的胞体和突起内，这种特异性组织学分布是胚胎发育过程中获得并一直维持下来的。神经丝由3种主要多肽类亚单位(70 kd,160 kd,200 kd)组成[5]，本抗体能与70 kd及200 kd亚单位起反应，特异性标记脊髓运动神经元和神经突起[6]。
, 百拇医药
脊髓损伤后病理生理机制非常复杂，各种原因均可引起神经元胞体和轴突病变。烯醇酶是一种糖酵解酶，脊髓缺血损伤后代谢紊乱，NSE发生改变。NSE在胞体合成并通过突起运输至终末，所以脊髓损伤后胞体和轴突内NSE均有改变。脊髓缺血再灌时胞体和轴突内脂质过氧化水平增高，钙激活的中性蛋白酶(CANP)活化，分解NF成小片断，导致NF降解，细胞骨架解体，形成轴突空泡样变性和Waller溃变[7]。
本实验证实缺血40 min神经元胞体NSE和NF呈强阳性反应，NSE和NF紊乱聚集，分布不均匀。说明了缺血40min神经元胞体和轴突有明确的免疫组织化学方面病理学损伤。再灌流4h NSE和NF反应阳性，分布紊乱、稀疏、崩溃、溶解，轴突肿胀、扩大、消失，病理性损伤进一步加重。上述结果用图象分析，经统计学比较而证实。这与作者用脊髓血流(SCBF)、超微结构、自由基观察到的缺血后再灌注损伤结果一致[1]。本实验证实免疫组织化学方法较一般病理组织学方法能更清楚地显示脊髓神经元胞体和轴突病变。NSE可作为脊髓神经元损伤及其程度的指标，细胞骨架紊乱在脊髓损伤后神经元的病理发病机制中起重要作用。
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参考文献
1 李长有，王星铎，金明熙，等.应用激光多普勒血流仪监测兔急性脊髓缺血损伤后腰髓血流动力学变化及病理学观察的研究.中华骨科杂志，1997，5：299—303
2 Schmechel DE,Marangos PJ,Zis AP,et al. Brain enolases as specific markers of neuronal and glial cells. Science,1978,199:313-317
3 Vinores SA,Bonnin JM,Rubinstein LT,et al. Immunohisto-chemical demonstration of neuron-specific enolase in neoplasms of the CNS and other tissues. Arch Pathol Lab Med,1984,108:536—541
, 百拇医药
4 Royds JA,Davies-Jones GAB,Lewtas NA,et al. Enolase isoenzymes in the cerebrospinal fluid of patients with diseases of the nervous system. J Neurol Neurosurg Psychiatry,1983,46:1031-1038
5 Liem RK,Yen SH,Solomon GE,et al. Intermediate filaments in nervous tissues. J Cell Biol,1978,79:637-641
6 Dahl D. Immunohistochemical differences between neurofilam-ents in perilarya,dendrites and axon. Ext Cell Res,1983,149:379-400
7 Schlaepfer WW. Neurofilaments:structure,metabolosmand implications in disease. J Neuropathol Exp Neurol,1987,46:117-119
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