小动物眼球冰冻切片技巧
作者：郑湖玲
单位：510060 广州，中山医科大学中山眼科中心病理室
关键词：
摘要 目的 摘要 目的：观察胎鼠宫内缺血缺氧后脑组织Bcl-2、Bax表达的动态变化。方法：钳夹一侧供应子宫的血管 10 min造成宫内缺血缺氧模型，分别再灌注 0，1，4，8，15，24 h，进行半定量 RT-PCR检测 Bcl-2与 BaxmRNA的表达。结果：Bax的表达在缺血缺氧当时即开始增强， 4 h已有显著性(P<0.01)， 8 h达高峰， 15 h有所降低， 24 h又出现升高(P<0.01)；而 Bcl-2的变化无显著性(P>0.05);Bcl-2与 Bax的比值在8 h达最低。结论：在轻度宫内缺血缺氧后4 h，Bax发生显著变化。
Bcl-2 and Bax Genes Expression in Intrauterus Cerebral Ischemia and Hypoxia of Rats
, http://www.100md.com
Song Weiwei, Han Yukun, Shang Tao
Department of Obstetric and Gynecology, The Second Clinical College，China Medical University, Shenyang， 110003
ABSTRACT Objecive:We examined the expression of apoptosis-related genes, Bcl-2 and Bax, in intrauterus cerebral ischemia and hypoxia of rats.Methods: Ischemic-hypoxic brain model was made in fetal rats by clamping the vessels supplied to one-side corn of uterus. The vessels to the other side was used as sham control. Then observed fetal brains at reperfusion for 0, 1,4,8,15 and 24 hours after clamping 10 minutes. Semiquantitative reverse transcription-polymerase chain reaction was used to reveal the expression of Bcl-2 mRNA and Bax mRMA. Results:Bcl-2 mRNA increased gradualy during reperfusion periods, but there were no significant changes (P>0.05). Bax mRNA increased unobviously after clamping 10 minutes, (P>0.05), but after 4 hours of reperfusion, it presented significant change (P<0.01), reached the peak level at about 8 hours, following a decreasing, it increased again at about 24 hours of reperfusin. The ratioes of Bcl-2/ Bax reached the lowest level during 8 hours. Conclusion:After mild hypoxia and ischemia, the changes of apoptosis-rehated genes were already onset perhaps at about 4 hours of reperfusion, which provided the proof and also the clue for early treatment in newborns of intrauterus fetal distress.
, http://www.100md.com
KEY WORDS intrauterus cerebral ischemia; Bcl-2; Bax
新生儿期缺氧缺血性脑损伤，始终是围产领域的研究热点。临床调查表明缺氧缺血性脑损伤主要源于围产期窒息，但关于损伤开始的确切时间目前研究甚少。故本文以胎大白鼠为模型，研究宫内缺血缺氧后脑组织凋亡相关基因Bcl-2与Bax在24 h内的变化，国内外尚未见此方面的报导。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1动物模型的建立Wistar雌性大白鼠,平均体重(250±10)g,以阴道涂片精液阳性为妊娠第1d，于妊娠21d以5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(0.1～0.15ml/100g)后,下腹正中开腹，暴露出双角子宫供应子宫、卵巢的动静脉血管，以动脉夹钳夹一侧动静脉血管10 min造成一侧宫角内胎鼠完全缺血缺氧，以对侧为对照组(即假手术组),各组胎鼠5 只。缺血缺氧时间符合后取下动脉夹，分别再灌注0 min,1、4、8、15及24 h。
, http://www.100md.com
1.1.2试剂： Bax、Bcl-2、内参照β-actin引物及Takara试剂盒均由大连宝生物工程有限公司提供。
1.2方法
1.2.1取材：上述各组条件满足后立即剖宫断头，无菌条件下取脑组织，立即置于去RNA酶的试管中液氮保存。
1.2.2半定量RT-PCR测Bcl-2, Bax mRNA的表达
1.2.2.1 总RNA的提取 取脑组织标本置于冰上的平皿中，剪碎、研磨，加1 ml RNA提取液(TRIZOL Reagent)，用注射器抽吸10次左右成乳状。用氯仿、异丙醇、酒精等处理提取总RNA。
1.2.2.2 逆转录合成cDNA第一链 反应体积为20 μl，加入总RNA0.5 μg，7 U AMV，Oligol(dT)1525 pmol,20 μl RNasin,1 mmol/L dNTPs,进行逆转录。
, 百拇医药
1.2.2.3 PCR扩增 引物序列参照文献1。反应总体积为50 μl,cDNA 3 μl，引物均为50 pmol,dNTPs 0.4 mmol/L,10 × buffer 5 μl,Taq聚合酶2.5 u，进行PCR扩增。
扩增条件：变性温度是94℃，3 min，退火温度是55℃，1 min，延伸温度是72℃，2 min，35个循环。
产物分析：于2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后紫外灯下观察RT-PCR扩增产物(拍照)，用Kodak,1D型凝胶成像系统输入计算机，以该软件进行扩增产物的半定量分析。
1.3.统计学处理 所有数据均采用均值±标准差表示，差异比较采用t检验及方差分析。
2 结果
假手术组胎鼠脑组织中Bax与 Bcl-2 mRNA均有一定程度的表达。缺血缺氧当时Bax表达即有所增加，再灌注后1 h继续增加，至再灌注4 h 发生显著变化(P<0.01)；再灌注8 h，Bax的表达达高峰， 此后有所下降， 但 24 h 后再次显著升高(P<0.01)。而 Bcl-2的表达在缺血当时不明显降低，再灌注后15 h内持续增加，15 h左右达高峰，24 h略有降低，但无显著性(P>0.05)；各组间方差分析也无显著差异(P>0.05)。因而Bcl-2与Bax的比值8 h达最低水平，15 h有所回升，但24 h又降低。因为是一种半定量检测方法，比值未做检验。具体数值见表1;选取与均值最接近的Bax,Bcl-2 mRNA电泳见图1、2。
, http://www.100md.com
表1 宫内缺氧缺血后脑组织Bcl-2、Bax基因表达的变化(
±s)
基因
对照组
缺血氧10 min
再灌注1 h
再灌注4 h
再灌注8 h
再灌注15 h
再灌注24 h
, http://www.100md.com
Bcl-2
0.2628±0.0541
0.1876±0.0951
0.2010±0.0569
0.2540±0.0834
0.2952±0.1085
0.3686±0.1690
0.3330±0.7113
Bax
0.1936±0.0650
0.3892±0.0593
, http://www.100md.com
0.4150±0.0325
0.7652±0.3452**
1.4852±0.3976**
0.4740±0.2800
0.7744±0.2698**
Bcl-2/Bax
1.3574
0.4820
0.4843
0.3319
0.1988
, 百拇医药
0.7776
0.4300
**P<0.01
图1 缺血10 min Bcl-2 mRNA电泳结果
图2 缺血10 min Bax mRNA电泳结果
3 讨论
, http://www.100md.com 3.1 Bcl-2基因家族与凋亡
许多研究表明原癌基因 Bcl-2是抑制凋亡过程中重要的调节因子， Bax是 Bcl-2的同源基因，是与Bcl-2结合产生效应的同源分子，其能与Bcl-2形成异源二聚体分子，促进细胞的凋亡。细胞内Bcl-2和Bax的量决定了细胞对凋亡信号的易感性[2]。因此，Bcl-2与Bax被认为是目前研究凋亡调节机制的最重要的基因之一。
3.2 宫内缺血缺氧后脑组织 Bcl-2、Bax的变化
Scott RJ等人[3]通过形态学的研究证实脑组织的凋亡与坏死均可能在宫内已经开始发生，但其机制目前还不清楚。探讨凋亡的调节机制已成为研究热点。我们通过半定量 RT-PCR技术，观察了宫内缺血缺氧后脑组织 Bcl-2与 Bax的动态变化：发现在宫内缺血缺氧当时 Bax的表达即开始增强，4 h已很明显，高峰在8 h，Bcl-2缺血缺氧后降低，再灌注后升高，但不显著，故 Bcl-2 与 Bax的比值也在4～8 h左右发生显著变化，此时的凋亡程度值得我们进一步研究。24 h左右Bax的再次升高可能与迟发性脑损伤密切相关。
, 百拇医药
总之，轻度宫内缺血缺氧后4 h，脑组织凋亡相关基因的变化已明显，因此，新生儿缺氧缺血性脑损伤的防治应尽早开始。本研究为缺氧缺血性脑损伤的治疗提供了时机与线索。
国家“九五”科技攻关项目，969020904
参考文献
1 Fumiko KN,Toshiyuki Y,Yoshiko K,et al.Down-regulation of c-myc and Bcl-2gene expression in PU.1 induced apoptosis in murine erythroleukemia cells. Ine J Cancer,1998;76:523-530
2 Oltval ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerzes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death. Cell, 1993;74:609-611.
3 Scott RJ, Hegyi L. Cell death in perinatal hypoxic-ischemic brain injury. Neuropathol Appl Neurobiol, 1997 ;23:307-314.
1998-08-05收稿, http://www.100md.com
单位：510060 广州，中山医科大学中山眼科中心病理室
关键词：
摘要 目的 摘要 目的：观察胎鼠宫内缺血缺氧后脑组织Bcl-2、Bax表达的动态变化。方法：钳夹一侧供应子宫的血管 10 min造成宫内缺血缺氧模型，分别再灌注 0，1，4，8，15，24 h，进行半定量 RT-PCR检测 Bcl-2与 BaxmRNA的表达。结果：Bax的表达在缺血缺氧当时即开始增强， 4 h已有显著性(P<0.01)， 8 h达高峰， 15 h有所降低， 24 h又出现升高(P<0.01)；而 Bcl-2的变化无显著性(P>0.05);Bcl-2与 Bax的比值在8 h达最低。结论：在轻度宫内缺血缺氧后4 h，Bax发生显著变化。
Bcl-2 and Bax Genes Expression in Intrauterus Cerebral Ischemia and Hypoxia of Rats
, http://www.100md.com
Song Weiwei, Han Yukun, Shang Tao
Department of Obstetric and Gynecology, The Second Clinical College，China Medical University, Shenyang， 110003
ABSTRACT Objecive:We examined the expression of apoptosis-related genes, Bcl-2 and Bax, in intrauterus cerebral ischemia and hypoxia of rats.Methods: Ischemic-hypoxic brain model was made in fetal rats by clamping the vessels supplied to one-side corn of uterus. The vessels to the other side was used as sham control. Then observed fetal brains at reperfusion for 0, 1,4,8,15 and 24 hours after clamping 10 minutes. Semiquantitative reverse transcription-polymerase chain reaction was used to reveal the expression of Bcl-2 mRNA and Bax mRMA. Results:Bcl-2 mRNA increased gradualy during reperfusion periods, but there were no significant changes (P>0.05). Bax mRNA increased unobviously after clamping 10 minutes, (P>0.05), but after 4 hours of reperfusion, it presented significant change (P<0.01), reached the peak level at about 8 hours, following a decreasing, it increased again at about 24 hours of reperfusin. The ratioes of Bcl-2/ Bax reached the lowest level during 8 hours. Conclusion:After mild hypoxia and ischemia, the changes of apoptosis-rehated genes were already onset perhaps at about 4 hours of reperfusion, which provided the proof and also the clue for early treatment in newborns of intrauterus fetal distress.
, http://www.100md.com
KEY WORDS intrauterus cerebral ischemia; Bcl-2; Bax
新生儿期缺氧缺血性脑损伤，始终是围产领域的研究热点。临床调查表明缺氧缺血性脑损伤主要源于围产期窒息，但关于损伤开始的确切时间目前研究甚少。故本文以胎大白鼠为模型，研究宫内缺血缺氧后脑组织凋亡相关基因Bcl-2与Bax在24 h内的变化，国内外尚未见此方面的报导。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1动物模型的建立Wistar雌性大白鼠,平均体重(250±10)g,以阴道涂片精液阳性为妊娠第1d，于妊娠21d以5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(0.1～0.15ml/100g)后,下腹正中开腹，暴露出双角子宫供应子宫、卵巢的动静脉血管，以动脉夹钳夹一侧动静脉血管10 min造成一侧宫角内胎鼠完全缺血缺氧，以对侧为对照组(即假手术组),各组胎鼠5 只。缺血缺氧时间符合后取下动脉夹，分别再灌注0 min,1、4、8、15及24 h。
, http://www.100md.com
1.1.2试剂： Bax、Bcl-2、内参照β-actin引物及Takara试剂盒均由大连宝生物工程有限公司提供。
1.2方法
1.2.1取材：上述各组条件满足后立即剖宫断头，无菌条件下取脑组织，立即置于去RNA酶的试管中液氮保存。
1.2.2半定量RT-PCR测Bcl-2, Bax mRNA的表达
1.2.2.1 总RNA的提取 取脑组织标本置于冰上的平皿中，剪碎、研磨，加1 ml RNA提取液(TRIZOL Reagent)，用注射器抽吸10次左右成乳状。用氯仿、异丙醇、酒精等处理提取总RNA。
1.2.2.2 逆转录合成cDNA第一链 反应体积为20 μl，加入总RNA0.5 μg，7 U AMV，Oligol(dT)1525 pmol,20 μl RNasin,1 mmol/L dNTPs,进行逆转录。
, 百拇医药
1.2.2.3 PCR扩增 引物序列参照文献1。反应总体积为50 μl,cDNA 3 μl，引物均为50 pmol,dNTPs 0.4 mmol/L,10 × buffer 5 μl,Taq聚合酶2.5 u，进行PCR扩增。
扩增条件：变性温度是94℃，3 min，退火温度是55℃，1 min，延伸温度是72℃，2 min，35个循环。
产物分析：于2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后紫外灯下观察RT-PCR扩增产物(拍照)，用Kodak,1D型凝胶成像系统输入计算机，以该软件进行扩增产物的半定量分析。
1.3.统计学处理 所有数据均采用均值±标准差表示，差异比较采用t检验及方差分析。
2 结果
假手术组胎鼠脑组织中Bax与 Bcl-2 mRNA均有一定程度的表达。缺血缺氧当时Bax表达即有所增加，再灌注后1 h继续增加，至再灌注4 h 发生显著变化(P<0.01)；再灌注8 h，Bax的表达达高峰， 此后有所下降， 但 24 h 后再次显著升高(P<0.01)。而 Bcl-2的表达在缺血当时不明显降低，再灌注后15 h内持续增加，15 h左右达高峰，24 h略有降低，但无显著性(P>0.05)；各组间方差分析也无显著差异(P>0.05)。因而Bcl-2与Bax的比值8 h达最低水平，15 h有所回升，但24 h又降低。因为是一种半定量检测方法，比值未做检验。具体数值见表1;选取与均值最接近的Bax,Bcl-2 mRNA电泳见图1、2。
, http://www.100md.com
表1 宫内缺氧缺血后脑组织Bcl-2、Bax基因表达的变化(
±s)基因
对照组
缺血氧10 min
再灌注1 h
再灌注4 h
再灌注8 h
再灌注15 h
再灌注24 h
, http://www.100md.com
Bcl-2
0.2628±0.0541
0.1876±0.0951
0.2010±0.0569
0.2540±0.0834
0.2952±0.1085
0.3686±0.1690
0.3330±0.7113
Bax
0.1936±0.0650
0.3892±0.0593
, http://www.100md.com
0.4150±0.0325
0.7652±0.3452**
1.4852±0.3976**
0.4740±0.2800
0.7744±0.2698**
Bcl-2/Bax
1.3574
0.4820
0.4843
0.3319
0.1988
, 百拇医药
0.7776
0.4300
**P<0.01
图1 缺血10 min Bcl-2 mRNA电泳结果
图2 缺血10 min Bax mRNA电泳结果
3 讨论
, http://www.100md.com 3.1 Bcl-2基因家族与凋亡
许多研究表明原癌基因 Bcl-2是抑制凋亡过程中重要的调节因子， Bax是 Bcl-2的同源基因，是与Bcl-2结合产生效应的同源分子，其能与Bcl-2形成异源二聚体分子，促进细胞的凋亡。细胞内Bcl-2和Bax的量决定了细胞对凋亡信号的易感性[2]。因此，Bcl-2与Bax被认为是目前研究凋亡调节机制的最重要的基因之一。
3.2 宫内缺血缺氧后脑组织 Bcl-2、Bax的变化
Scott RJ等人[3]通过形态学的研究证实脑组织的凋亡与坏死均可能在宫内已经开始发生，但其机制目前还不清楚。探讨凋亡的调节机制已成为研究热点。我们通过半定量 RT-PCR技术，观察了宫内缺血缺氧后脑组织 Bcl-2与 Bax的动态变化：发现在宫内缺血缺氧当时 Bax的表达即开始增强，4 h已很明显，高峰在8 h，Bcl-2缺血缺氧后降低，再灌注后升高，但不显著，故 Bcl-2 与 Bax的比值也在4～8 h左右发生显著变化，此时的凋亡程度值得我们进一步研究。24 h左右Bax的再次升高可能与迟发性脑损伤密切相关。
, 百拇医药
总之，轻度宫内缺血缺氧后4 h，脑组织凋亡相关基因的变化已明显，因此，新生儿缺氧缺血性脑损伤的防治应尽早开始。本研究为缺氧缺血性脑损伤的治疗提供了时机与线索。
国家“九五”科技攻关项目，969020904
参考文献
1 Fumiko KN,Toshiyuki Y,Yoshiko K,et al.Down-regulation of c-myc and Bcl-2gene expression in PU.1 induced apoptosis in murine erythroleukemia cells. Ine J Cancer,1998;76:523-530
2 Oltval ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerzes in vivo with a conserved homolog, Bax, that accelerates programmed cell death. Cell, 1993;74:609-611.
3 Scott RJ, Hegyi L. Cell death in perinatal hypoxic-ischemic brain injury. Neuropathol Appl Neurobiol, 1997 ;23:307-314.
1998-08-05收稿, http://www.100md.com