宫内膜低分化腺癌伴印戒细胞癌一例
作者：马捷 印洪林
单位：210002 南京军区南京总医院 病理科
关键词：
中国医科990522 摘要 目的：探讨辅酶Q10及山莨菪碱对培养心肌细胞缺氧复氧的作用机制。方法：观察培养液中LDH和CPK-MB含量，细胞内MDA、SOD和GSH-PX的活性变化。结果：辅酶Q10和山莨菪碱可减少氧自由基产生。结论：氧自由基是造成心肌细胞缺氧复氧损伤的重要原因；辅酶Q10和山莨菪碱能保护心肌细胞内SOD及GSH-PX的活性。
The Protective Effects of Coenzyme Q10 and Anisodamine Against Myocardial Hypoxia/Reperfusion Injury in Cultured Rat Myocardial Cells
, http://www.100md.com
Yan Demin, Tian Xin
Department of Cardiosurgery, The First Clinical College, China Medical University, Shenyang, 110001
ABSTRACT Objective:Mechanism of coenzyme Q10& antisodamine against myocardial hypoxia/reperfusion injury was studied by using hypoxic model of cultured rat myocardial cell.Methods: Changes in concentrations of LDH, CPK-MB, MDA,SOD, and GSH-PX activity of the cultured myocardial cell were observed during the process of experiment. Results: Oxygen free radical was one of the main causes of hypoxia/reoxygenation injury. Conclusion:Anisodamin & coenzyme Q10 can lessen the rate of the oxygen free radical generation and protect the activity of SOD and GSH-PX.
, 百拇医药
KEY WORDS hypoxia/reoxygenation; coenzyme Q10; anisodamine; myocardial cell culture
七十年代初Harary首先提出再灌注对缺血的心肌是有害的，能加重心肌缺血损伤[1]。本实验应用培养乳鼠心肌细胞缺氧复氧模型为实验模型，观察辅酶Q10(CoQ10)和山莨菪碱(654—2)对缺氧复氧心肌细胞的影响，以探讨CoQ10和654—2对缺氧复氧心肌细胞的保护机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物：Wistar种，出生2～4 d的乳鼠(由中国医科大学实验动物部提供)，雌雄不拘，共计80只。
1.2 主要药品：CoQ10注射液(广州明兴制药厂，批号950105-1)：654-2注射液(上海第一制药厂，批号940902)。
, http://www.100md.com
1.3 方法：
1.3.1 Wistar种乳鼠心肌细胞培养技术：取生后2～4 d的乳鼠，迅速开胸，切取心室部分，按着Harary建立的培养方法[1]，将各次消化制备的细胞悬液集中制成5×105/ml的心肌细胞悬液，接种至32 cm3玻璃培养液中作单层培养。
1.3.2 缺氧复氧模型的建立：将培养6 d的心肌细胞换以无糖的Hanks液，(预先用99.9%高纯氮气饱合15 min)，并充入99.99%高纯氮气(1 h/min流量，30 s)以置换瓶内空气造成缺氧，塞紧瓶塞后放入孵箱内培养120 min，然后换入含糖的Hanks液，于有氧环境中培养，复氧 20 min、40 min 采取标本检测， 用药组于同样条件下分别加 CoQ10 0.25mg/ml、654-2 0.125mg/ml，正常组不充氮气，换入Hanks液培养。
, 百拇医药
1.3.3 观察指标及实验分组：将培养6 d的心肌细胞以瓶计随机分为4组，每组8瓶。正常组(A组)、对照组(B组)、CoQ10组(C组)、654-2组(D组)。各组在缺氧后复氧前、复氧20 min、40 min测定心肌细胞培养液中的乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CPK-MB)含量。用改良的TBA法测定各时点心肌细胞内的丙二醛(MDA)的含量、超氧化物岐化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性变化。
1.3.4 统计学处理：实验结果均以
±s表示，应用t检验各组均值的显著性。
2 结果
2.1 各时点LDH的漏出量 对照组明显升高，CoQ10组、654-2组较对照组明显降低(P<0.01)(表1)。
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表1 各组LDH漏出量(单位U/L) 分组
缺氧120min
复氧
20min
40min
对照组
44.13±3.31
57.50±2.45
54.88±1.36
辅酶Q10组
31.25±2.71*
, http://www.100md.com
28.12±1.96*
35.00±5.07*
654—2组
38.88±2.48*
32.25±1.98*
30.88±2.17*
*与对照组相比P<0.01
2.2 各时点CPK-MB的漏出量 对照组明显升高，CoQ10组、654-2组较对照组明显降低(P<0.01)(表2)。
表2 各组CPK-MB漏出量(单位U/L) 分组
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缺氧120min
复氧
20min
40min
对照组
3.63±0.74
4.63±0.92
6.00±0.76
辅酶Q10组
1.75±0.71*
1.50±0.75*
, 百拇医药
1.88±0.64*
654—2组
1.50±0.75*
1.88±0.83*
1.88±0.64*
*与对照组相比P<0.01
2.3 各时点细胞内MDA含量 对照组复氧20 min、40 min极显著升高；CoQ10组、654-2组缺氧120 min比对照组降低、复氧20 min、40 min则十分显著(P<0.01)(表3)。
表3 各组细胞内MDA含量(单位nmol/105细胞) 分组
, http://www.100md.com
缺氧120min
复氧
20min
40min
对照组
0.0695±0.0581
0.5180±0.0324
0.3742±0.0161
辅酶Q10组
0.0660±0.0281*
0.2521±0.0161**
, http://www.100md.com
0.1890±0.0089**
654—2组
0.0651±0.033*
0.3653±0.80111**
0.1952±0.0981**
*与对照组相比P<0.01；**与对照组相比，P<0.01
2.4 各时点细胞内SOD活性 CoQ10组、654-2组与对照组比明显 升高(P<0.01)，CoQ10组与654-2组间无差异(表4)。
, 百拇医药 表4 各组细胞内SOD活性(单位U/105细胞) 分组
缺氧120min
复氧
20min
40min
对照组
9.428±0.244
7.519±0.271
7.631±0.262
辅酶
Q10
, 百拇医药 11.034±0.141*
10.918±0.182*
10.306±0.223*
654—2组
10.992±0.074*
11.006±0.106*
10.255±0.193*
*与对照组相比P<0.01
2.5 各时点细胞内GSH—PX活性 对照组比正常组明显降低，CoQ10组、654—2组比对照组明显升高(P<0.01)。
, 百拇医药
表5 各组细胞内GSH—PX活性(单位U/105细胞) 分组
缺氧120min
复氧
20min
40min
对照组
9.096±0.142
7.318±0.165
7.578±0.202
辅酶
Q10
, 百拇医药
10.056±0.089*
10.960±0.130*
10.450±0.089*
654-2组
11.040±0.244*
10.994±0.169*
10.383±0.273*
*与对照组相比P<0.01
3 讨论
, 百拇医药 缺血再灌注损伤问题一直是心脏外科研究的重要课题[2，3]。氧自由基导致细胞损伤的主要环节为：作用于细胞外基质，使胶原和透明质酸崩解；使膜磷脂结构内的多聚不饱合脂肪酸过氧化而直接损伤细胞膜；肌浆网和线粒体破溃[4，5]。氧自由基的产生主要是在恢复灌注后，本实验测定对照组在缺氧120 min细胞内MDA含量无明显升高(P>0.05)，而在给氧20 min、40 min MDA含量明显升高(P>0.01)，这表明复氧后氧自由基的产生与清除这个平衡系统被破坏，则细胞内MDA含量明显升高。
CoQ10是组织细胞重要的活性酶，在心脏、肝、肾等器官中含量较高，在细胞内主要分布在线粒体，在电子传递系统中起到递氢体作用，同时也是细胞代谢细胞呼吸的激活剂，具有天然的抗自由基能力[6]。本实验证实CoQ10能使LDH、CPK-MB在缺氧后及复氧后明显减少，也使MDA的产生减少，对SOD和GSH-PX两种酶有良好的保护作用，机制可能为：促进心肌氧化磷酸化过程，提高氧利用率，提高ATP产生的效率；保持细胞膜的完整性，减轻线粒体损伤，保护线粒体的各种酶系统。
, http://www.100md.com
654-2也有大量研究证实具有保护缺血心肌作用[7]。本实验提示654-2能减少LDH和CPK-MB的释放及MDA的产生，特别值得一提的是654-2对SOD和GSH-PX这两种细胞内抗氧化酶的作用，缺氧120 min后复氧前654-2对GSH-PX活性保护作用较CoQ10为好。本实验说明 CoQ10及 654-2 对培养心肌细胞有较强的保护作用，随着进一步研究的开展，将应用于心脏外科临床。
参考文献
1 Harary I，Barbara F. In vitro studies of single isolated beating heart cell. Science, 1960, 131: 1674-1675
2 Gideon C, Toshzumi S, Richard D, et al. Optimal myocardial preconditioning in human model of ischemia and reperfusion. Circulation, 1998, 98(19): Ⅱ185—Ⅱ196
, http://www.100md.com
3 Motohisa T, Calolin M, Jianyi Li, et al. Effects of ischemic preconditioning on microvascular regulation. Circulaion, 1998, 98(19): Ⅱ197—Ⅱ205
4 Acosta D, Ramos R, Li Goldman CP. Cell injury of cultured rat myocardiol cells after reoxygenation of hypoxia cultures in the presence and absence of calcium. In vitro, 1984, 20: 642-646
5 Del Mastro RF. An approach to free radical in medicine and biology. Acta Physiol Scand, 1980, 492 (Supp) :153-168
6 高尚志，姚霞，李房树，等.辅酶Q10对犬心肌缺血后再灌注损伤的保护作用的实验研究.中华胸心血管外科杂志，1990，6(增刊): 96—97
7 陈长志，王一山，冯卓荣，等.山莨菪碱(654—2)防治心肌再灌注损伤的实验研究.中华胸心血管外科杂志，1990，6(增刊)：98—101
1998-09-02收稿, 百拇医药
单位：210002 南京军区南京总医院 病理科
关键词：
中国医科990522 摘要 目的：探讨辅酶Q10及山莨菪碱对培养心肌细胞缺氧复氧的作用机制。方法：观察培养液中LDH和CPK-MB含量，细胞内MDA、SOD和GSH-PX的活性变化。结果：辅酶Q10和山莨菪碱可减少氧自由基产生。结论：氧自由基是造成心肌细胞缺氧复氧损伤的重要原因；辅酶Q10和山莨菪碱能保护心肌细胞内SOD及GSH-PX的活性。
The Protective Effects of Coenzyme Q10 and Anisodamine Against Myocardial Hypoxia/Reperfusion Injury in Cultured Rat Myocardial Cells
, http://www.100md.com
Yan Demin, Tian Xin
Department of Cardiosurgery, The First Clinical College, China Medical University, Shenyang, 110001
ABSTRACT Objective:Mechanism of coenzyme Q10& antisodamine against myocardial hypoxia/reperfusion injury was studied by using hypoxic model of cultured rat myocardial cell.Methods: Changes in concentrations of LDH, CPK-MB, MDA,SOD, and GSH-PX activity of the cultured myocardial cell were observed during the process of experiment. Results: Oxygen free radical was one of the main causes of hypoxia/reoxygenation injury. Conclusion:Anisodamin & coenzyme Q10 can lessen the rate of the oxygen free radical generation and protect the activity of SOD and GSH-PX.
, 百拇医药
KEY WORDS hypoxia/reoxygenation; coenzyme Q10; anisodamine; myocardial cell culture
七十年代初Harary首先提出再灌注对缺血的心肌是有害的，能加重心肌缺血损伤[1]。本实验应用培养乳鼠心肌细胞缺氧复氧模型为实验模型，观察辅酶Q10(CoQ10)和山莨菪碱(654—2)对缺氧复氧心肌细胞的影响，以探讨CoQ10和654—2对缺氧复氧心肌细胞的保护机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物：Wistar种，出生2～4 d的乳鼠(由中国医科大学实验动物部提供)，雌雄不拘，共计80只。
1.2 主要药品：CoQ10注射液(广州明兴制药厂，批号950105-1)：654-2注射液(上海第一制药厂，批号940902)。
, http://www.100md.com
1.3 方法：
1.3.1 Wistar种乳鼠心肌细胞培养技术：取生后2～4 d的乳鼠，迅速开胸，切取心室部分，按着Harary建立的培养方法[1]，将各次消化制备的细胞悬液集中制成5×105/ml的心肌细胞悬液，接种至32 cm3玻璃培养液中作单层培养。
1.3.2 缺氧复氧模型的建立：将培养6 d的心肌细胞换以无糖的Hanks液，(预先用99.9%高纯氮气饱合15 min)，并充入99.99%高纯氮气(1 h/min流量，30 s)以置换瓶内空气造成缺氧，塞紧瓶塞后放入孵箱内培养120 min，然后换入含糖的Hanks液，于有氧环境中培养，复氧 20 min、40 min 采取标本检测， 用药组于同样条件下分别加 CoQ10 0.25mg/ml、654-2 0.125mg/ml，正常组不充氮气，换入Hanks液培养。
, 百拇医药
1.3.3 观察指标及实验分组：将培养6 d的心肌细胞以瓶计随机分为4组，每组8瓶。正常组(A组)、对照组(B组)、CoQ10组(C组)、654-2组(D组)。各组在缺氧后复氧前、复氧20 min、40 min测定心肌细胞培养液中的乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CPK-MB)含量。用改良的TBA法测定各时点心肌细胞内的丙二醛(MDA)的含量、超氧化物岐化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性变化。
1.3.4 统计学处理：实验结果均以
±s表示，应用t检验各组均值的显著性。2 结果
2.1 各时点LDH的漏出量 对照组明显升高，CoQ10组、654-2组较对照组明显降低(P<0.01)(表1)。
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表1 各组LDH漏出量(单位U/L) 分组
缺氧120min
复氧
20min
40min
对照组
44.13±3.31
57.50±2.45
54.88±1.36
辅酶Q10组
31.25±2.71*
, http://www.100md.com
28.12±1.96*
35.00±5.07*
654—2组
38.88±2.48*
32.25±1.98*
30.88±2.17*
*与对照组相比P<0.01
2.2 各时点CPK-MB的漏出量 对照组明显升高，CoQ10组、654-2组较对照组明显降低(P<0.01)(表2)。
表2 各组CPK-MB漏出量(单位U/L) 分组
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缺氧120min
复氧
20min
40min
对照组
3.63±0.74
4.63±0.92
6.00±0.76
辅酶Q10组
1.75±0.71*
1.50±0.75*
, 百拇医药
1.88±0.64*
654—2组
1.50±0.75*
1.88±0.83*
1.88±0.64*
*与对照组相比P<0.01
2.3 各时点细胞内MDA含量 对照组复氧20 min、40 min极显著升高；CoQ10组、654-2组缺氧120 min比对照组降低、复氧20 min、40 min则十分显著(P<0.01)(表3)。
表3 各组细胞内MDA含量(单位nmol/105细胞) 分组
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缺氧120min
复氧
20min
40min
对照组
0.0695±0.0581
0.5180±0.0324
0.3742±0.0161
辅酶Q10组
0.0660±0.0281*
0.2521±0.0161**
, http://www.100md.com
0.1890±0.0089**
654—2组
0.0651±0.033*
0.3653±0.80111**
0.1952±0.0981**
*与对照组相比P<0.01；**与对照组相比，P<0.01
2.4 各时点细胞内SOD活性 CoQ10组、654-2组与对照组比明显 升高(P<0.01)，CoQ10组与654-2组间无差异(表4)。
, 百拇医药 表4 各组细胞内SOD活性(单位U/105细胞) 分组
缺氧120min
复氧
20min
40min
对照组
9.428±0.244
7.519±0.271
7.631±0.262
辅酶
Q10
, 百拇医药 11.034±0.141*
10.918±0.182*
10.306±0.223*
654—2组
10.992±0.074*
11.006±0.106*
10.255±0.193*
*与对照组相比P<0.01
2.5 各时点细胞内GSH—PX活性 对照组比正常组明显降低，CoQ10组、654—2组比对照组明显升高(P<0.01)。
, 百拇医药
表5 各组细胞内GSH—PX活性(单位U/105细胞) 分组
缺氧120min
复氧
20min
40min
对照组
9.096±0.142
7.318±0.165
7.578±0.202
辅酶
Q10
, 百拇医药
10.056±0.089*
10.960±0.130*
10.450±0.089*
654-2组
11.040±0.244*
10.994±0.169*
10.383±0.273*
*与对照组相比P<0.01
3 讨论
, 百拇医药 缺血再灌注损伤问题一直是心脏外科研究的重要课题[2，3]。氧自由基导致细胞损伤的主要环节为：作用于细胞外基质，使胶原和透明质酸崩解；使膜磷脂结构内的多聚不饱合脂肪酸过氧化而直接损伤细胞膜；肌浆网和线粒体破溃[4，5]。氧自由基的产生主要是在恢复灌注后，本实验测定对照组在缺氧120 min细胞内MDA含量无明显升高(P>0.05)，而在给氧20 min、40 min MDA含量明显升高(P>0.01)，这表明复氧后氧自由基的产生与清除这个平衡系统被破坏，则细胞内MDA含量明显升高。
CoQ10是组织细胞重要的活性酶，在心脏、肝、肾等器官中含量较高，在细胞内主要分布在线粒体，在电子传递系统中起到递氢体作用，同时也是细胞代谢细胞呼吸的激活剂，具有天然的抗自由基能力[6]。本实验证实CoQ10能使LDH、CPK-MB在缺氧后及复氧后明显减少，也使MDA的产生减少，对SOD和GSH-PX两种酶有良好的保护作用，机制可能为：促进心肌氧化磷酸化过程，提高氧利用率，提高ATP产生的效率；保持细胞膜的完整性，减轻线粒体损伤，保护线粒体的各种酶系统。
, http://www.100md.com
654-2也有大量研究证实具有保护缺血心肌作用[7]。本实验提示654-2能减少LDH和CPK-MB的释放及MDA的产生，特别值得一提的是654-2对SOD和GSH-PX这两种细胞内抗氧化酶的作用，缺氧120 min后复氧前654-2对GSH-PX活性保护作用较CoQ10为好。本实验说明 CoQ10及 654-2 对培养心肌细胞有较强的保护作用，随着进一步研究的开展，将应用于心脏外科临床。
参考文献
1 Harary I，Barbara F. In vitro studies of single isolated beating heart cell. Science, 1960, 131: 1674-1675
2 Gideon C, Toshzumi S, Richard D, et al. Optimal myocardial preconditioning in human model of ischemia and reperfusion. Circulation, 1998, 98(19): Ⅱ185—Ⅱ196
, http://www.100md.com
3 Motohisa T, Calolin M, Jianyi Li, et al. Effects of ischemic preconditioning on microvascular regulation. Circulaion, 1998, 98(19): Ⅱ197—Ⅱ205
4 Acosta D, Ramos R, Li Goldman CP. Cell injury of cultured rat myocardiol cells after reoxygenation of hypoxia cultures in the presence and absence of calcium. In vitro, 1984, 20: 642-646
5 Del Mastro RF. An approach to free radical in medicine and biology. Acta Physiol Scand, 1980, 492 (Supp) :153-168
6 高尚志，姚霞，李房树，等.辅酶Q10对犬心肌缺血后再灌注损伤的保护作用的实验研究.中华胸心血管外科杂志，1990，6(增刊): 96—97
7 陈长志，王一山，冯卓荣，等.山莨菪碱(654—2)防治心肌再灌注损伤的实验研究.中华胸心血管外科杂志，1990，6(增刊)：98—101
1998-09-02收稿, 百拇医药