卵巢上皮性癌肿瘤浸润淋巴细胞的增殖、表型及细胞毒活性研究
作者：吴小华 范金兰 宋俊芬 王素君 刘辉
单位：河北医科大学第四医院妇产科石家庄050011；刘辉：中国人民解放军第二军医大学博士生
关键词：卵巢肿瘤；淋巴细胞，肿瘤浸润；免疫表型分型/淋巴细胞；细胞毒性，免疫
河北医科大学学报990510 摘 要 目的 探讨卵巢上皮性癌(简称卵巢癌)肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TIL)的生物学特性。方法 用机械法和酶法消化实体瘤后,采用分步低速离心后行连续密度梯度法分离卵巢癌TIL,在有IL-2、PHA或OKT3条件下培养,表型分析采用间接免疫荧光染色法,细胞毒性检测采用MTT法。结果 15份卵巢癌TIL中,得率范围106～107/g,13份TIL活化(另2份污染),最大扩增倍数523倍,其中7份TIL经培养达治疗量(109个细胞);初分离的卵巢癌TIL处于功能抑制状态,抑制期5～15天,随着活化后体外培养,CD3、CD8、CD25(IL-2R)和HLA-DR表达显著增多;初分离的卵巢癌TIL对K562和自体瘤细胞杀伤力均低下,随着体外培养,细胞毒性增加,尤以对自体瘤的特异性杀伤力增加最显著。结论 卵巢癌TIL体外易分离及活化,特异性杀伤力较强,适于肿瘤的生物学治疗
, 百拇医药
中图号 R737.31
STUDY OF CULTURE,PHENOTYPE,AND CYTOTOXICITY
OF TUMOR-INFILTRATING LYMPHOCYTES IN
OVARIAN EPITHELIAL CARCINOMA
Wu Xiaohua Fan Jinlan Song Junfen Wang Sujun Liu Hui
Department of Gynecology,the Fourth Hospital of Hebei Medical University
(Shijiazhuang 050011)
, 百拇医药
ABSTRACT Objective To explore the biological characteristics of tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) in ovarian epithelial carcinoma (OVEC).Methods Ovarian cancer tissues were digested enzymatically or mechanically,then cultured in the presence of IL-2,PHA and OKT3 mAb.The changes in phenotypes and cytotoxicities of TIL in OVEC were examined by indirect immunofluorescence method and MTT method separately.Results All TIL in OVEC were activated and proliferated after 5～15 days' supression,during that peroid the abilities both in proliferatioin and cytotoxicity were poor.The most expanding flod was 532.OKT3mAb+IL-2 could induce higher expanding folds of TIL.The cytotoxities against K562,Raji and autologous tumor cells increased while TIL were cultured in vitro,and the increase of cytotoxicity against autologous tumor cells was most significant in TIL.Phenotypic analyses showed the expression of CD3,CD8,CD25 and HLA-DR were increased in the process of cultivation and were correlated to the cytotoxicity.Conclusion TIL in OVEC has strong autologous tumor cytotoxicity and is potentially useful in clinical adoptive immunotherapy.
, 百拇医药
MeSH ovarian neoplasms;lymphocytes, tumor-infiltrating; immunophenotyping/lymphocytes; cytotoxicity, immunologic
卵巢恶性肿瘤的治疗是妇科领域的棘手问题,生物学治疗是其综合治疗中的重要方法之一。自Rosenberg发现肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TIL)的抗瘤效应比LAK细胞大50～100倍后[1],已有应用TIL治疗中、晚期癌症患者的系列报道,发现黑色素瘤、肾癌和卵巢癌效果较理想[2]。目前限制TIL临床应用的主要问题是不易获得治疗量的TIL(109个细胞)。为此我们初步研究了卵巢上皮性癌(简称卵巢癌)TIL的体外分离、培养方法及生物学特性,以期推动临床应用。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 肿瘤组织来源:15份卵巢癌实体瘤组织均来自河北医科大学第四医院妇科,均经病理证实为卵巢上皮性癌,并均取外周血分离PBL培养,其中5例同时取腹水,以获得腹水TIL。
1.2 肿瘤组织的处理与消化:将术中切取的新鲜肿瘤组织置于含抗生素的冷Hanks'液中浸泡30 min,去除坏死、出血及脂肪组织,称重,剪成1 mm×1 mm×1 mm小块,加入以RPMI 1640配制的不同组合的消化酶液中,按实验设计进行不同的消化处理。所用酶有胶原酶Ⅱ型、透明质酸酶、DNA酶(均为Sigma产品)。完全消化后的组织过120目铜网,即得到含TIL和肿瘤细胞的单细胞悬液。
1.3 TIL和肿瘤细胞的分离:外周血采用连续密度梯度法(100 % Ficoll分离液)[1];腹水采用不连续密度梯计法(100 %和75 % Ficoll分离液)[2]分离TIL和瘤细胞;实体瘤组织除采用前述两种分离方法(分别简称方法1和方法2)外,还采用分步低速离心后再采用连续密度梯度法(方法3)[3],即将混合细胞悬液3 ml轻轻加于1 ml小牛血清界面上,500 rpm、15 s离心后,底层为瘤细胞,将上层细胞悬液再行连续梯度分离,获取TIL。淋巴细胞分离液Ficoll购自中科院血液所。所得TIL用台盼兰拒染法测定活率,并涂片行MGG染色,光镜下确定淋巴细胞和肿瘤细胞百分率。
, 百拇医药
1.4 TIL的培养及条件:TIL在含10 %人AB血清的RPMI 1640完全培养基中以1×106/ml初始浓度于24孔板中培养,并加入IL-2(1 000 U/ml),同时或加PHA(20 μg/ml),或加OKT3(10-4稀释),37 ℃、5 %CO2孵箱培养。
1.5 淋巴细胞表型测定:采用间接免疫荧光染色法[4],荧光显微镜(美国Reichert)计数细胞。抗CD3、CD4、CD8、CD16、CD19、CD25单抗及羊抗鼠FITC-IgG购自北京帮定生物制品公司,按说明书操作。
1.6 TIL杀伤力测定:参照文献MTT法[5]并加改进。以K562(NK敏感),Raji(NK抵抗)和自体新鲜瘤细胞为靶细胞,效(E)∶靶(T)=10∶1,同时设效应细胞对照和靶细胞对照。在酶标仪570 nm波长下测每孔OD值,按下式计算杀伤率。
, 百拇医药
杀伤率=(1-
)×100 %
E为效应细胞孔,T为靶细胞孔,E+T为效靶混合孔。
2 结果
2.1 不同消化和分离方法获得TIL的效应:采用6种酶的组合方法消化3份卵巢癌实体瘤细胞标本,平均TIL活力与得率见表1,结果酶组合6较理想。
表1 不同酶组合对卵巢癌TIL活力和分离效果的影响
Table 1 The viability and yield of TIL in ovarian tumors by
different enzymic combination
, 百拇医药
Enzymic
combination*
Digestion
Viability of
TIL (%)
Yield of TIL
(106/g)
1
4 ℃,12 h
92
1.20
2
, http://www.100md.com
4 ℃,12 h
78
1.96
3
4 ℃,12 h
89
0.92
4
4 ℃,12 h
78
2.10
5
37 ℃,stirring for 4 h
, 百拇医药
80
4.14
6
4 ℃digesting for 12 h
85
5.69
37 ℃,stirring for 4 h
* 1.0.1 % collagenase;2.0.01 % hyaluronidase;3.0.002 % deoxyribonuclease;4 and 5.The combinaton of 1、2 and 3 enzymes;6.After 12 h digestion of collagenase,adding hyaluronidase and deoxyribonuclease,and stirring for 4 h.
, http://www.100md.com
对3份标本采用3种分离方法所得TIL的平均获率(分离后获得淋巴细胞数与分离前淋巴细胞数之比)与纯度见表2,结果方法3所得TIL的获率及纯度均较高。
表2 不同分离方法所得卵巢癌TIL的获率及纯度
Table 2 The harvest and purity of TIL in ovarian tumors by
different separating methods
Result
Harvest(%)
Purity(%)
Method 1
, 百拇医药 60
33
Method 2
24
51
Method 3
36
50
Method 1. Continuous Ficoll-Hypaque gradient
Method 2. Discontinuous Ficoll-Hypaque gradient
Method 3. Continuous Ficoll-Hypaque gradient after low-speed centrifugation
, http://www.100md.com
统一采用酶组合6和分离方法3处理15份卵巢癌实体瘤,得率范围5.69×106～1.14×107/g,获率范围31.08 %～80.50 %,纯度33.33 %～69.57 %。
2.2 卵巢癌TIL的增殖动力学:与外周血淋巴细胞(PBL)相比,新分离的卵巢癌TIL处于抑制状态;PBL在IL-2刺激后24～48 h即活化增殖,而TIL的抑制期长达5～15天。TIL扩增时间(最长60天)比PBL(最长26天)长,最大扩增倍数(523倍)比PBL(78倍)高。15份卵巢实体瘤中除2例污染外,有7例实体瘤TIL体外扩增达到了治疗量(109)。5份腹水TIL均未达治疗量。卵巢癌TIL生长曲线见图1。
图1 卵巢癌TIL的生长曲线
, 百拇医药 Figure 1 The growth curve of TIL in Ovarian tumor
分别采用单加IL-2、IL-2+PHA和IL-2+OKT3单抗做刺激因子,观察5份实体瘤TIL的增殖情况,见表3。由表3看出IL-2+OKT3单抗作用较显著;与单加IL-2相比,PHA与OKT3均不能明显缩短TIL的抑制期。
表3 不同刺激因素对卵巢癌TIL扩增能力的作用
Table 3 The expanding ability of TIL in ovarian tumors by
different stimulating factors
No
Days of culture
, 百拇医药
The expanding folds of TIL
IL-2
IL-2+PHA
IL-2+OKT3
1
10
2.00
2.00
4.06
2
12
0.00
, 百拇医药 2.40
4.75
3
11
2.60
3.30
3.30
4
14
7.28
8.30
22.40
5
, 百拇医药 22
16.00
18.40
36.00
2.3 卵巢癌TIL的表型变化:初分离的卵巢癌TIL中,CD3细胞由30 %～70 %不等,CD16及CD19细胞极少,CD4细胞8 %～49 %,CD8细胞20 %～46 %,HLA-DR 22 %～35 %,CD25细胞0～16 %,其中CD4细胞占优势者和CD8细胞占优势者分别为6份和7份。经IL-2诱导后,CD3细胞比例显著增加,最高达98 %,CD8细胞明显增加,尤其当细胞培养超过40天时,以CD8细胞占优势型居多,达70 %;CD4细胞增加不明显;HLA-DR细胞显著增多,最多达100 %;CD25细胞亦增加,多达65 %。
, 百拇医药
2.4 卵巢癌TIL的细胞毒活性:初分离的卵巢癌实体瘤及腹水TIL的NK活性、LAK活性及对自体瘤的杀伤力均很低,明显低于PBL,见表4,均不足10 %;经IL-2诱导后卵巢癌TIL的各种细胞毒活性均增高,尤以特异性杀伤自体瘤细胞活性增加最为显著,最高达78 %,在培养3～4周间细胞毒活性最高(图2)。
表4 卵巢癌PBL与TIL细胞毒活性
Table 4 The cytotoxity of PBL and TIL in ovarian tumors
Culture week
Cytotoxity of PBL (%)
Cytotoxity of TIL
in ascites (%)
, http://www.100md.com
Cytotoxity of
TIL in solid tumor (%)
K562
Raji
autologous
K562
Raji
autologous
K562
Raji
autologous
0
, 百拇医药
55
23
33
11
3
3
8
7
1
78
39
40
27
21
, 百拇医药
27
41
39
55
3
71
43
35
20
31
78
50
31
65
, 百拇医药
4
56
21
15
15
12
61
42
32
53
图2 卵巢癌TIL对自体瘤的杀伤力曲线
Figure 2 The curve of TIL's autologous tumor cytotoxicity
, http://www.100md.com
3 讨论
许多学者注意到从实体瘤中制备单细胞悬液时,细胞的得率及淋巴细胞纯度差异极大,但由于TIL的分离和培养操作复杂,各实验室条件不同,临床应用效果也有差异。如何得到足够数量的高活力的TIL对后续培养十分重要。卵巢癌由于组织松脆,易分离,细胞得率较高,本研究得率在106～107个细胞;我们探索了6种消化方法,结果由于酶对细胞活力有影响,且磁力搅拌对细胞造成的机械损伤大,故选用酶组合6(表1)可保证组织消化完全和细胞活力较高;在分离方法上选用方法3(表2)可使IL-2纯度及获率均较高。我们所用的方法有异于Rosenberg的经典方法[1]。
与文献报道一致[6],新鲜初分离的卵巢癌TIL增殖力低下,处于功能低下状态,在我们的实验中,13份卵巢癌的TIL均活化(2份污染),抑制期5～15天。造成TIL抑制状态的原因可能为以下3种情况:①肿瘤细胞及其产生的因子;②TIL中存在抑制性T亚群;③TIL本身传导活化信号受阻。在本实验中,新分离的TIL中的瘤细胞多于培养2～3周死亡,但有些TIL在培养5天后活化并增殖,此时仍有较多瘤细胞存在。我们注意到,卵巢癌TIL的活化与刺激剂及剂量无关,不同刺激因子时活化时间无差别,故支持TIL本身传导活化信号受阻这一假设。T细胞活化主要由TCR/CD3复合体途径完成,活化后T细胞表达IL-2R,与IL-2结合,进一步活化与扩增。OKT3和PHA的作用是使TIL表达更多的IL-2R,提高TIL对IL-2的敏感性,从而提高增殖力。本组结果以OKT3+IL-2刺激作用最为显著,对PHA反应不如PBL,与Schoof等[7]的结果一致。
, 百拇医药
TIL的表型有两个特点,一是异质性,二是变化性,随体外培养时间的推移,TIL表型有明显改变。本实验结果初分离的卵巢癌TIL CD3细胞不等,CD4与CD8占优势者近乎相等,IL-2R、HLA-DR和NK细胞标志表达率较低,而培养后IL-2R和HLA-DR表达显著增多,CD3和CD8亦明显增加,这与活化后TIL强增殖力与高杀伤活性有关。
TIL与LAK细胞的重要区别之一是TIL具有更大的专一性杀伤自体瘤细胞的能力[1],而LAK细胞无此能力。我们在实验中观察到,初分离的卵巢癌TIL的特异性和非特异性细胞毒性均很低,低于PBL,随着培养时间的延长,TIL活化与增殖,TIL的特异性杀伤自体瘤细胞的能力显著增加,培养3周时达高峰;TIL的非特异杀伤力也增加,但不如PBL显著。Toplian等[8]对TIL的特异性杀伤机制进行了深入研究,在培养早期TIL的细胞毒性表现为非特异性,类似LAK细胞,随培养时间延长出现特异杀伤力,以至达到高度特异性,这时TIL是高度同一的细胞群(CD+3、CD+8、HLA-DR+细胞),即激活的细胞毒性淋巴细胞;由于TIL对表达MHC-Ⅰ类抗原的正常B细胞、PBL和成纤维细胞无杀伤作用,表明TIL针对肿瘤相关抗原的特异性免疫的存在。Ioannides等[9]由卵巢癌腹水中获得TIL,发现了与Toplian等[8]相似的结果。与文献报道一致[2],我们的结果也显示TIL确实有非特异性杀伤效应,这与TIL中存在的少量NK与LAK细胞有关。
, http://www.100md.com
总之,TIL具有高效杀伤自体瘤细胞的活性,有潜在临床实用价值,卵巢癌TIL的临床应用价值更高[2]。尽管TIL的分离与培养较为困难,但鉴于卵巢癌本身的组织特点,改善分离培养条件,进一步提高卵巢癌TIL的得率及扩增力,达到109～1010个细胞的治疗量很有希望,值得进一步研究。
参考文献
1.Rosenberg SA,Spiess P,Lafreniere R,et al.A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes.Science,1986,233(9):1318
2.Toplian SL,Solomon D,Avis FP,et al.Immunotherapy of patients with advanced cancer using tumor-infiltrating lymphocytes and recombinant interleukin-2:a pilot study.J Clin Oncol,1988,6(5):839
, 百拇医药
3.温汉平,王小宁.分步低速离心法快速分离纯化瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞.中国免疫学杂志,1993,9(3):165
4.王一理,宋建明,姚德茂,等.TIL治疗人体进展期肿瘤后的免疫学监测.中国肿瘤生物治疗杂志,1996,3(4):207
5.Carmichael J,Degnaff WG,Gadzer AF,et al.Evaluation a tetrazolium based semiautomated colorimetric assessment of chemosenstivity testing.Cancer Res,1987,47(2):936
6.Miescher S,Stoeck M,Barras QC,et al.Proliferation and cytolytic potential of purified human tumor-infiltrating T lymphocytes:impaired response to mitogen-driven stimulation despite T-cell receptor expression.Int J Cancer,1988,42(2):657
, 百拇医药
7.Schoof DD,Selleck CM,Massaro AF,et al.Activation of human tumor-infiltrating lymphocytes by monoclonal antibodies directed to CD3 complelx.Cancer Res,1990,50(3):1138
8.Topalian SL,Solomon D,Rosenberg SA.Tumor-specific cytolysis by lymphocytes infiltrating human melanomas.J Immunol,1989,142(10):3714
9.Ioannides CE,Freedman RS,Pcatsoucas CD,et al.Cytotoxic T cell clones isolated from ovarian tumor-infiltrating lymphocytes recognize multiple antigenic epitopes on autologous tumor cells.J Immuno,1991,145(5):1700
收稿日期：1998-10-27, http://www.100md.com
单位：河北医科大学第四医院妇产科石家庄050011；刘辉：中国人民解放军第二军医大学博士生
关键词：卵巢肿瘤；淋巴细胞，肿瘤浸润；免疫表型分型/淋巴细胞；细胞毒性，免疫
河北医科大学学报990510 摘 要 目的 探讨卵巢上皮性癌(简称卵巢癌)肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TIL)的生物学特性。方法 用机械法和酶法消化实体瘤后,采用分步低速离心后行连续密度梯度法分离卵巢癌TIL,在有IL-2、PHA或OKT3条件下培养,表型分析采用间接免疫荧光染色法,细胞毒性检测采用MTT法。结果 15份卵巢癌TIL中,得率范围106～107/g,13份TIL活化(另2份污染),最大扩增倍数523倍,其中7份TIL经培养达治疗量(109个细胞);初分离的卵巢癌TIL处于功能抑制状态,抑制期5～15天,随着活化后体外培养,CD3、CD8、CD25(IL-2R)和HLA-DR表达显著增多;初分离的卵巢癌TIL对K562和自体瘤细胞杀伤力均低下,随着体外培养,细胞毒性增加,尤以对自体瘤的特异性杀伤力增加最显著。结论 卵巢癌TIL体外易分离及活化,特异性杀伤力较强,适于肿瘤的生物学治疗
, 百拇医药
中图号 R737.31
STUDY OF CULTURE,PHENOTYPE,AND CYTOTOXICITY
OF TUMOR-INFILTRATING LYMPHOCYTES IN
OVARIAN EPITHELIAL CARCINOMA
Wu Xiaohua Fan Jinlan Song Junfen Wang Sujun Liu Hui
Department of Gynecology,the Fourth Hospital of Hebei Medical University
(Shijiazhuang 050011)
, 百拇医药
ABSTRACT Objective To explore the biological characteristics of tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) in ovarian epithelial carcinoma (OVEC).Methods Ovarian cancer tissues were digested enzymatically or mechanically,then cultured in the presence of IL-2,PHA and OKT3 mAb.The changes in phenotypes and cytotoxicities of TIL in OVEC were examined by indirect immunofluorescence method and MTT method separately.Results All TIL in OVEC were activated and proliferated after 5～15 days' supression,during that peroid the abilities both in proliferatioin and cytotoxicity were poor.The most expanding flod was 532.OKT3mAb+IL-2 could induce higher expanding folds of TIL.The cytotoxities against K562,Raji and autologous tumor cells increased while TIL were cultured in vitro,and the increase of cytotoxicity against autologous tumor cells was most significant in TIL.Phenotypic analyses showed the expression of CD3,CD8,CD25 and HLA-DR were increased in the process of cultivation and were correlated to the cytotoxicity.Conclusion TIL in OVEC has strong autologous tumor cytotoxicity and is potentially useful in clinical adoptive immunotherapy.
, 百拇医药
MeSH ovarian neoplasms;lymphocytes, tumor-infiltrating; immunophenotyping/lymphocytes; cytotoxicity, immunologic
卵巢恶性肿瘤的治疗是妇科领域的棘手问题,生物学治疗是其综合治疗中的重要方法之一。自Rosenberg发现肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes,TIL)的抗瘤效应比LAK细胞大50～100倍后[1],已有应用TIL治疗中、晚期癌症患者的系列报道,发现黑色素瘤、肾癌和卵巢癌效果较理想[2]。目前限制TIL临床应用的主要问题是不易获得治疗量的TIL(109个细胞)。为此我们初步研究了卵巢上皮性癌(简称卵巢癌)TIL的体外分离、培养方法及生物学特性,以期推动临床应用。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 肿瘤组织来源:15份卵巢癌实体瘤组织均来自河北医科大学第四医院妇科,均经病理证实为卵巢上皮性癌,并均取外周血分离PBL培养,其中5例同时取腹水,以获得腹水TIL。
1.2 肿瘤组织的处理与消化:将术中切取的新鲜肿瘤组织置于含抗生素的冷Hanks'液中浸泡30 min,去除坏死、出血及脂肪组织,称重,剪成1 mm×1 mm×1 mm小块,加入以RPMI 1640配制的不同组合的消化酶液中,按实验设计进行不同的消化处理。所用酶有胶原酶Ⅱ型、透明质酸酶、DNA酶(均为Sigma产品)。完全消化后的组织过120目铜网,即得到含TIL和肿瘤细胞的单细胞悬液。
1.3 TIL和肿瘤细胞的分离:外周血采用连续密度梯度法(100 % Ficoll分离液)[1];腹水采用不连续密度梯计法(100 %和75 % Ficoll分离液)[2]分离TIL和瘤细胞;实体瘤组织除采用前述两种分离方法(分别简称方法1和方法2)外,还采用分步低速离心后再采用连续密度梯度法(方法3)[3],即将混合细胞悬液3 ml轻轻加于1 ml小牛血清界面上,500 rpm、15 s离心后,底层为瘤细胞,将上层细胞悬液再行连续梯度分离,获取TIL。淋巴细胞分离液Ficoll购自中科院血液所。所得TIL用台盼兰拒染法测定活率,并涂片行MGG染色,光镜下确定淋巴细胞和肿瘤细胞百分率。
, 百拇医药
1.4 TIL的培养及条件:TIL在含10 %人AB血清的RPMI 1640完全培养基中以1×106/ml初始浓度于24孔板中培养,并加入IL-2(1 000 U/ml),同时或加PHA(20 μg/ml),或加OKT3(10-4稀释),37 ℃、5 %CO2孵箱培养。
1.5 淋巴细胞表型测定:采用间接免疫荧光染色法[4],荧光显微镜(美国Reichert)计数细胞。抗CD3、CD4、CD8、CD16、CD19、CD25单抗及羊抗鼠FITC-IgG购自北京帮定生物制品公司,按说明书操作。
1.6 TIL杀伤力测定:参照文献MTT法[5]并加改进。以K562(NK敏感),Raji(NK抵抗)和自体新鲜瘤细胞为靶细胞,效(E)∶靶(T)=10∶1,同时设效应细胞对照和靶细胞对照。在酶标仪570 nm波长下测每孔OD值,按下式计算杀伤率。
, 百拇医药
杀伤率=(1-
)×100 %E为效应细胞孔,T为靶细胞孔,E+T为效靶混合孔。
2 结果
2.1 不同消化和分离方法获得TIL的效应:采用6种酶的组合方法消化3份卵巢癌实体瘤细胞标本,平均TIL活力与得率见表1,结果酶组合6较理想。
表1 不同酶组合对卵巢癌TIL活力和分离效果的影响
Table 1 The viability and yield of TIL in ovarian tumors by
different enzymic combination
, 百拇医药
Enzymic
combination*
Digestion
Viability of
TIL (%)
Yield of TIL
(106/g)
1
4 ℃,12 h
92
1.20
2
, http://www.100md.com
4 ℃,12 h
78
1.96
3
4 ℃,12 h
89
0.92
4
4 ℃,12 h
78
2.10
5
37 ℃,stirring for 4 h
, 百拇医药
80
4.14
6
4 ℃digesting for 12 h
85
5.69
37 ℃,stirring for 4 h
* 1.0.1 % collagenase;2.0.01 % hyaluronidase;3.0.002 % deoxyribonuclease;4 and 5.The combinaton of 1、2 and 3 enzymes;6.After 12 h digestion of collagenase,adding hyaluronidase and deoxyribonuclease,and stirring for 4 h.
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对3份标本采用3种分离方法所得TIL的平均获率(分离后获得淋巴细胞数与分离前淋巴细胞数之比)与纯度见表2,结果方法3所得TIL的获率及纯度均较高。
表2 不同分离方法所得卵巢癌TIL的获率及纯度
Table 2 The harvest and purity of TIL in ovarian tumors by
different separating methods
Result
Harvest(%)
Purity(%)
Method 1
, 百拇医药 60
33
Method 2
24
51
Method 3
36
50
Method 1. Continuous Ficoll-Hypaque gradient
Method 2. Discontinuous Ficoll-Hypaque gradient
Method 3. Continuous Ficoll-Hypaque gradient after low-speed centrifugation
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统一采用酶组合6和分离方法3处理15份卵巢癌实体瘤,得率范围5.69×106～1.14×107/g,获率范围31.08 %～80.50 %,纯度33.33 %～69.57 %。
2.2 卵巢癌TIL的增殖动力学:与外周血淋巴细胞(PBL)相比,新分离的卵巢癌TIL处于抑制状态;PBL在IL-2刺激后24～48 h即活化增殖,而TIL的抑制期长达5～15天。TIL扩增时间(最长60天)比PBL(最长26天)长,最大扩增倍数(523倍)比PBL(78倍)高。15份卵巢实体瘤中除2例污染外,有7例实体瘤TIL体外扩增达到了治疗量(109)。5份腹水TIL均未达治疗量。卵巢癌TIL生长曲线见图1。
图1 卵巢癌TIL的生长曲线
, 百拇医药 Figure 1 The growth curve of TIL in Ovarian tumor
分别采用单加IL-2、IL-2+PHA和IL-2+OKT3单抗做刺激因子,观察5份实体瘤TIL的增殖情况,见表3。由表3看出IL-2+OKT3单抗作用较显著;与单加IL-2相比,PHA与OKT3均不能明显缩短TIL的抑制期。
表3 不同刺激因素对卵巢癌TIL扩增能力的作用
Table 3 The expanding ability of TIL in ovarian tumors by
different stimulating factors
No
Days of culture
, 百拇医药
The expanding folds of TIL
IL-2
IL-2+PHA
IL-2+OKT3
1
10
2.00
2.00
4.06
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12
0.00
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4.75
3
11
2.60
3.30
3.30
4
14
7.28
8.30
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5
, 百拇医药 22
16.00
18.40
36.00
2.3 卵巢癌TIL的表型变化:初分离的卵巢癌TIL中,CD3细胞由30 %～70 %不等,CD16及CD19细胞极少,CD4细胞8 %～49 %,CD8细胞20 %～46 %,HLA-DR 22 %～35 %,CD25细胞0～16 %,其中CD4细胞占优势者和CD8细胞占优势者分别为6份和7份。经IL-2诱导后,CD3细胞比例显著增加,最高达98 %,CD8细胞明显增加,尤其当细胞培养超过40天时,以CD8细胞占优势型居多,达70 %;CD4细胞增加不明显;HLA-DR细胞显著增多,最多达100 %;CD25细胞亦增加,多达65 %。
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2.4 卵巢癌TIL的细胞毒活性:初分离的卵巢癌实体瘤及腹水TIL的NK活性、LAK活性及对自体瘤的杀伤力均很低,明显低于PBL,见表4,均不足10 %;经IL-2诱导后卵巢癌TIL的各种细胞毒活性均增高,尤以特异性杀伤自体瘤细胞活性增加最为显著,最高达78 %,在培养3～4周间细胞毒活性最高(图2)。
表4 卵巢癌PBL与TIL细胞毒活性
Table 4 The cytotoxity of PBL and TIL in ovarian tumors
Culture week
Cytotoxity of PBL (%)
Cytotoxity of TIL
in ascites (%)
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Cytotoxity of
TIL in solid tumor (%)
K562
Raji
autologous
K562
Raji
autologous
K562
Raji
autologous
0
, 百拇医药
55
23
33
11
3
3
8
7
1
78
39
40
27
21
, 百拇医药
27
41
39
55
3
71
43
35
20
31
78
50
31
65
, 百拇医药
4
56
21
15
15
12
61
42
32
53
图2 卵巢癌TIL对自体瘤的杀伤力曲线
Figure 2 The curve of TIL's autologous tumor cytotoxicity
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3 讨论
许多学者注意到从实体瘤中制备单细胞悬液时,细胞的得率及淋巴细胞纯度差异极大,但由于TIL的分离和培养操作复杂,各实验室条件不同,临床应用效果也有差异。如何得到足够数量的高活力的TIL对后续培养十分重要。卵巢癌由于组织松脆,易分离,细胞得率较高,本研究得率在106～107个细胞;我们探索了6种消化方法,结果由于酶对细胞活力有影响,且磁力搅拌对细胞造成的机械损伤大,故选用酶组合6(表1)可保证组织消化完全和细胞活力较高;在分离方法上选用方法3(表2)可使IL-2纯度及获率均较高。我们所用的方法有异于Rosenberg的经典方法[1]。
与文献报道一致[6],新鲜初分离的卵巢癌TIL增殖力低下,处于功能低下状态,在我们的实验中,13份卵巢癌的TIL均活化(2份污染),抑制期5～15天。造成TIL抑制状态的原因可能为以下3种情况:①肿瘤细胞及其产生的因子;②TIL中存在抑制性T亚群;③TIL本身传导活化信号受阻。在本实验中,新分离的TIL中的瘤细胞多于培养2～3周死亡,但有些TIL在培养5天后活化并增殖,此时仍有较多瘤细胞存在。我们注意到,卵巢癌TIL的活化与刺激剂及剂量无关,不同刺激因子时活化时间无差别,故支持TIL本身传导活化信号受阻这一假设。T细胞活化主要由TCR/CD3复合体途径完成,活化后T细胞表达IL-2R,与IL-2结合,进一步活化与扩增。OKT3和PHA的作用是使TIL表达更多的IL-2R,提高TIL对IL-2的敏感性,从而提高增殖力。本组结果以OKT3+IL-2刺激作用最为显著,对PHA反应不如PBL,与Schoof等[7]的结果一致。
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TIL的表型有两个特点,一是异质性,二是变化性,随体外培养时间的推移,TIL表型有明显改变。本实验结果初分离的卵巢癌TIL CD3细胞不等,CD4与CD8占优势者近乎相等,IL-2R、HLA-DR和NK细胞标志表达率较低,而培养后IL-2R和HLA-DR表达显著增多,CD3和CD8亦明显增加,这与活化后TIL强增殖力与高杀伤活性有关。
TIL与LAK细胞的重要区别之一是TIL具有更大的专一性杀伤自体瘤细胞的能力[1],而LAK细胞无此能力。我们在实验中观察到,初分离的卵巢癌TIL的特异性和非特异性细胞毒性均很低,低于PBL,随着培养时间的延长,TIL活化与增殖,TIL的特异性杀伤自体瘤细胞的能力显著增加,培养3周时达高峰;TIL的非特异杀伤力也增加,但不如PBL显著。Toplian等[8]对TIL的特异性杀伤机制进行了深入研究,在培养早期TIL的细胞毒性表现为非特异性,类似LAK细胞,随培养时间延长出现特异杀伤力,以至达到高度特异性,这时TIL是高度同一的细胞群(CD+3、CD+8、HLA-DR+细胞),即激活的细胞毒性淋巴细胞;由于TIL对表达MHC-Ⅰ类抗原的正常B细胞、PBL和成纤维细胞无杀伤作用,表明TIL针对肿瘤相关抗原的特异性免疫的存在。Ioannides等[9]由卵巢癌腹水中获得TIL,发现了与Toplian等[8]相似的结果。与文献报道一致[2],我们的结果也显示TIL确实有非特异性杀伤效应,这与TIL中存在的少量NK与LAK细胞有关。
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总之,TIL具有高效杀伤自体瘤细胞的活性,有潜在临床实用价值,卵巢癌TIL的临床应用价值更高[2]。尽管TIL的分离与培养较为困难,但鉴于卵巢癌本身的组织特点,改善分离培养条件,进一步提高卵巢癌TIL的得率及扩增力,达到109～1010个细胞的治疗量很有希望,值得进一步研究。
参考文献
1.Rosenberg SA,Spiess P,Lafreniere R,et al.A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes.Science,1986,233(9):1318
2.Toplian SL,Solomon D,Avis FP,et al.Immunotherapy of patients with advanced cancer using tumor-infiltrating lymphocytes and recombinant interleukin-2:a pilot study.J Clin Oncol,1988,6(5):839
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3.温汉平,王小宁.分步低速离心法快速分离纯化瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞.中国免疫学杂志,1993,9(3):165
4.王一理,宋建明,姚德茂,等.TIL治疗人体进展期肿瘤后的免疫学监测.中国肿瘤生物治疗杂志,1996,3(4):207
5.Carmichael J,Degnaff WG,Gadzer AF,et al.Evaluation a tetrazolium based semiautomated colorimetric assessment of chemosenstivity testing.Cancer Res,1987,47(2):936
6.Miescher S,Stoeck M,Barras QC,et al.Proliferation and cytolytic potential of purified human tumor-infiltrating T lymphocytes:impaired response to mitogen-driven stimulation despite T-cell receptor expression.Int J Cancer,1988,42(2):657
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7.Schoof DD,Selleck CM,Massaro AF,et al.Activation of human tumor-infiltrating lymphocytes by monoclonal antibodies directed to CD3 complelx.Cancer Res,1990,50(3):1138
8.Topalian SL,Solomon D,Rosenberg SA.Tumor-specific cytolysis by lymphocytes infiltrating human melanomas.J Immunol,1989,142(10):3714
9.Ioannides CE,Freedman RS,Pcatsoucas CD,et al.Cytotoxic T cell clones isolated from ovarian tumor-infiltrating lymphocytes recognize multiple antigenic epitopes on autologous tumor cells.J Immuno,1991,145(5):1700
收稿日期：1998-10-27, http://www.100md.com