急性非淋巴细胞白血病中MGMT与p53基因突变的研究
作者：李晓雯 郑红 连建华 齐华 游文风 宋国英 陈玉清
单位：河南医科大学细胞生物学与医学遗传学教研室郑州450052；陈玉清:河南省人民医院血液病研究所
关键词：白血病，非淋巴细胞，急性；基因，p53；DNA突变分析；聚合酶链反应
河北医科大学学报990506 摘 要 目的 探讨肿瘤抑制基因p53、MGMT在急性非淋巴细胞白血病(ANLL)中的改变。方法 用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术对31例ANLL患者、22例正常人p53基因第5、6、7、8外显子和MGMT基因第1、4外显子进行突变分析。结果 31例ANLL中5例存在p53基因突变,4例存在MGMT基因突变,其中2例p53与MGMT同时发生突变。结论 p53基因突变在白血病发生中起一定作用。MGMT的作用有待进一步研究。
中图号 R733.7
, 百拇医药
STUDY OF MUTATION OF MGMT AND p53 IN ACUTE
NON-LYMPHOCYTIC LEUKEMIA
Li Xiaowen Zheng Hong Lian Jianhua Qi Hua You Wenfeng Song Guoying Chen Yuqing
Department of Cellular Biology & Medical Genetics,Henan Medical University(Zhengzhou 450052)
ABSTRACT Objective To investigate the incidence of p 53 and MGMT gene alteration in acute non-lymphocytic leukemia(ANLL).Methods Using polymerase chain reaction-single stand conformation polymorphism(PCR-SSCP) technique,31 cases of acute non-lymphocytic leukemia(ANLL) and 22 normal controls were studied for mutation in p53 gene exons 5,6,7,8 and MGMT gene exons1,4.Results In 31 cases of ANLL,4 cases showed MGMT gene mutation,5 cases p53 gene mutation and 2 cases both p53 and MGMT mutation.Conclusion p53 gene mutation may play an important role in the pathogenesis of acute leukemia,while the role of MGMT gene mutation remains to be elucidated.
, 百拇医药
MeSH leukemia,nonlymplyocytic,acute;genes,p53;DNA mutational analysis;polymerase chain reaction
近年来的研究表明,人类多种恶性肿瘤中存在p53基因的突变[1],业已在25 %～50 %的肿瘤细胞中发现O6-甲基尿嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)基因异常[2]。为研究ANLL中MGMT、p53基因的突变情况及相关关系,我们用PCR-SSCP技术对31例ANLL标本进行了检测。
1 材料与方法
1.1 研究对象和DNA制备:河南医科大学第一附属医院血液科、儿科、河南省人民医院血液科1996年10月～1997年6月初诊未化疗的急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)31例;正常人22例,每个病例抽取其外周血1～5 ml或骨髓0.5～1 ml,肝素抗凝。常规方法制备DNA。
, 百拇医药
1.2 引物:p53基因第5、6、7、8外显子引物购自北师大细胞调控国家重点实验室。MGMT基因第1、4外显子引物由美国Cybersyn公司协助合成。
1.3 PCR-SSCP反应体系:总体积25 μl,10×PCR缓冲液2.5 μl,0.2 mol/L dNTP,上下游引物各25 pmol,模板DNA 0.5～1.0 μg,无菌双蒸水补足至总体积,混匀,反应体系先行97 ℃预变性6 min后,加入Taq DNA聚合酶1.5 U和50 μl石蜡油覆盖,进入循环:94 ℃ 60 s→55 ℃～60 ℃ 90 s→72 ℃ 60 s,进行35个循环后,72 ℃延伸7 min终止反应。取5 μl扩增产物和等体积变性缓冲液(97 %甲酰胺、10 M medta、0.05 %溴酚兰)混匀后97 ℃热变性10 min,迅速取出置于冰上5 min,加样于8 %非变性聚丙酰胺凝胶(交联度49∶1),电压300 V,1×TBE,电泳至溴酚兰接近凝胶下缘时结束电泳。对发现有SSCP改变的样本重复PCR-SSCP分析1～2次,以排除假阳性结果。
, 百拇医药
1.4 统计学处理:基因突变的相关分析采用配对计数的χ2检验。
2 结果
31例ANLL中发现p53基因突变5例(突变率为16.1 %):第5外显子1例,第6外显子2例,第7外显子1例,第8外显子1例;MGMT基因突变4例(突变率为12.1 %):第1外显子1例,第4外显子3例;其中2例p53基因第6外显子、MGMT基因第4外显子同时突变;22例正常标本均未发现p53、MGMT基因突变。
3 讨论
已知p53基因5、6、7、8外显子是发生突变的4个热点区[3],我们应用PCR-SSCP技术对急性白血病p53基因第5、6、7、8外显子和MGMT基因第1、4外显子进行了突变分析,发现p53基因在ANLL中突变率为16.1 %,与对照组比较有显著性差异(P<0.05),并且远远高于一般基因的自发突变率(10-6～10-4),表明p53基因突变后失去抑癌能力,引起细胞生长失控和恶性转化,在白血病发生过程中起着重要作用,p53基因突变与ANLL分型的关系应进一步扩大病例研究后做出结论。已有研究表明,存在p53基因突变的急性白血病患者对常规化疗药物不敏感,疗效较差[4]。Bayever用突变性p53基因的阻断疗法取得了良好的治疗效果[5];Cheng采用野生型p53基因的替代疗法有效的抑制了p53的T-ALL细胞系Be-13细胞的恶性生长[6]。因此,在白血病患者中检测p53基因突变,可以有效的帮助判断预后和有针对性地进行基因治疗,具有极高的临床应用价值和良好的应用前景。
, http://www.100md.com
MGMT基因可有效地修复DNA分子中鸟嘌呤06位的烷化碱基,防止突变发生[7]。本实验中MGMT基因突变率为12.1 %,统计学分析结果P>0.05,与对照组无显著性差异,可能是由于例数过少造成的。此外,我们仅对MGMT基因第1、4外显子进行了突变分析,而并未检测其他外显子的基因突变,也有可能降低MGMT突变的检出率。2例MGMT基因与p53基因同时发生突变,推测MGMT基因突变时,对DNA损伤的修复能力低下,增加了p53基因的突变机会,但此结论需增大样本含量,进一步深入研究加以证实。
参考文献
1.Levine AH,Momand J,Finlay CA.The p53 tumor suppressor gene.Nature,1991,351:453
2.Harris LC,Von-Wronskki MA,Venable CC,et al.Changes in O6-methylguanine-DNA methylteansferase expression during immortalizatiion of cloned human fibroblasts.Csrcinogenesis,1996,17(2):219
, 百拇医药
3.Hartmann A,Blaszyk H,Mcgovern RM,et al.p53 gene mutations inside and outside of exons 5-8:The pattens differ in breast and other cancer.Oncogen,1995,10(6):681
4.Pokocimer M,Rottef V.Structure and function of p53 in normal cells and their aberrations in cancer cells:projection on the hematologiccell lineage.Blood,1994,84(8):2391
5.Momand J,Zambetti GP,Olson DC,et al.The mdm-2 oncogene product formsa complex with the p53 protein and inhibits p53-mediated transactivation.Cell,1992,69(7):1237
6.Vogelstein B,Kinzler KW.p53 function and dysfunction.Cell,1992,70(4):523
7.Hayakawa H,Koike G,Sekiguchi M.Experession and cloning of complementary DNA for a human enzyme that repairs O6-methylguanine-DNA.J Mol Biol,1990,213:739
收稿日期：1999-06-07, 百拇医药
单位：河南医科大学细胞生物学与医学遗传学教研室郑州450052；陈玉清:河南省人民医院血液病研究所
关键词：白血病，非淋巴细胞，急性；基因，p53；DNA突变分析；聚合酶链反应
河北医科大学学报990506 摘 要 目的 探讨肿瘤抑制基因p53、MGMT在急性非淋巴细胞白血病(ANLL)中的改变。方法 用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术对31例ANLL患者、22例正常人p53基因第5、6、7、8外显子和MGMT基因第1、4外显子进行突变分析。结果 31例ANLL中5例存在p53基因突变,4例存在MGMT基因突变,其中2例p53与MGMT同时发生突变。结论 p53基因突变在白血病发生中起一定作用。MGMT的作用有待进一步研究。
中图号 R733.7
, 百拇医药
STUDY OF MUTATION OF MGMT AND p53 IN ACUTE
NON-LYMPHOCYTIC LEUKEMIA
Li Xiaowen Zheng Hong Lian Jianhua Qi Hua You Wenfeng Song Guoying Chen Yuqing
Department of Cellular Biology & Medical Genetics,Henan Medical University(Zhengzhou 450052)
ABSTRACT Objective To investigate the incidence of p 53 and MGMT gene alteration in acute non-lymphocytic leukemia(ANLL).Methods Using polymerase chain reaction-single stand conformation polymorphism(PCR-SSCP) technique,31 cases of acute non-lymphocytic leukemia(ANLL) and 22 normal controls were studied for mutation in p53 gene exons 5,6,7,8 and MGMT gene exons1,4.Results In 31 cases of ANLL,4 cases showed MGMT gene mutation,5 cases p53 gene mutation and 2 cases both p53 and MGMT mutation.Conclusion p53 gene mutation may play an important role in the pathogenesis of acute leukemia,while the role of MGMT gene mutation remains to be elucidated.
, 百拇医药
MeSH leukemia,nonlymplyocytic,acute;genes,p53;DNA mutational analysis;polymerase chain reaction
近年来的研究表明,人类多种恶性肿瘤中存在p53基因的突变[1],业已在25 %～50 %的肿瘤细胞中发现O6-甲基尿嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)基因异常[2]。为研究ANLL中MGMT、p53基因的突变情况及相关关系,我们用PCR-SSCP技术对31例ANLL标本进行了检测。
1 材料与方法
1.1 研究对象和DNA制备:河南医科大学第一附属医院血液科、儿科、河南省人民医院血液科1996年10月～1997年6月初诊未化疗的急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)31例;正常人22例,每个病例抽取其外周血1～5 ml或骨髓0.5～1 ml,肝素抗凝。常规方法制备DNA。
, 百拇医药
1.2 引物:p53基因第5、6、7、8外显子引物购自北师大细胞调控国家重点实验室。MGMT基因第1、4外显子引物由美国Cybersyn公司协助合成。
1.3 PCR-SSCP反应体系:总体积25 μl,10×PCR缓冲液2.5 μl,0.2 mol/L dNTP,上下游引物各25 pmol,模板DNA 0.5～1.0 μg,无菌双蒸水补足至总体积,混匀,反应体系先行97 ℃预变性6 min后,加入Taq DNA聚合酶1.5 U和50 μl石蜡油覆盖,进入循环:94 ℃ 60 s→55 ℃～60 ℃ 90 s→72 ℃ 60 s,进行35个循环后,72 ℃延伸7 min终止反应。取5 μl扩增产物和等体积变性缓冲液(97 %甲酰胺、10 M medta、0.05 %溴酚兰)混匀后97 ℃热变性10 min,迅速取出置于冰上5 min,加样于8 %非变性聚丙酰胺凝胶(交联度49∶1),电压300 V,1×TBE,电泳至溴酚兰接近凝胶下缘时结束电泳。对发现有SSCP改变的样本重复PCR-SSCP分析1～2次,以排除假阳性结果。
, 百拇医药
1.4 统计学处理:基因突变的相关分析采用配对计数的χ2检验。
2 结果
31例ANLL中发现p53基因突变5例(突变率为16.1 %):第5外显子1例,第6外显子2例,第7外显子1例,第8外显子1例;MGMT基因突变4例(突变率为12.1 %):第1外显子1例,第4外显子3例;其中2例p53基因第6外显子、MGMT基因第4外显子同时突变;22例正常标本均未发现p53、MGMT基因突变。
3 讨论
已知p53基因5、6、7、8外显子是发生突变的4个热点区[3],我们应用PCR-SSCP技术对急性白血病p53基因第5、6、7、8外显子和MGMT基因第1、4外显子进行了突变分析,发现p53基因在ANLL中突变率为16.1 %,与对照组比较有显著性差异(P<0.05),并且远远高于一般基因的自发突变率(10-6～10-4),表明p53基因突变后失去抑癌能力,引起细胞生长失控和恶性转化,在白血病发生过程中起着重要作用,p53基因突变与ANLL分型的关系应进一步扩大病例研究后做出结论。已有研究表明,存在p53基因突变的急性白血病患者对常规化疗药物不敏感,疗效较差[4]。Bayever用突变性p53基因的阻断疗法取得了良好的治疗效果[5];Cheng采用野生型p53基因的替代疗法有效的抑制了p53的T-ALL细胞系Be-13细胞的恶性生长[6]。因此,在白血病患者中检测p53基因突变,可以有效的帮助判断预后和有针对性地进行基因治疗,具有极高的临床应用价值和良好的应用前景。
, http://www.100md.com
MGMT基因可有效地修复DNA分子中鸟嘌呤06位的烷化碱基,防止突变发生[7]。本实验中MGMT基因突变率为12.1 %,统计学分析结果P>0.05,与对照组无显著性差异,可能是由于例数过少造成的。此外,我们仅对MGMT基因第1、4外显子进行了突变分析,而并未检测其他外显子的基因突变,也有可能降低MGMT突变的检出率。2例MGMT基因与p53基因同时发生突变,推测MGMT基因突变时,对DNA损伤的修复能力低下,增加了p53基因的突变机会,但此结论需增大样本含量,进一步深入研究加以证实。
参考文献
1.Levine AH,Momand J,Finlay CA.The p53 tumor suppressor gene.Nature,1991,351:453
2.Harris LC,Von-Wronskki MA,Venable CC,et al.Changes in O6-methylguanine-DNA methylteansferase expression during immortalizatiion of cloned human fibroblasts.Csrcinogenesis,1996,17(2):219
, 百拇医药
3.Hartmann A,Blaszyk H,Mcgovern RM,et al.p53 gene mutations inside and outside of exons 5-8:The pattens differ in breast and other cancer.Oncogen,1995,10(6):681
4.Pokocimer M,Rottef V.Structure and function of p53 in normal cells and their aberrations in cancer cells:projection on the hematologiccell lineage.Blood,1994,84(8):2391
5.Momand J,Zambetti GP,Olson DC,et al.The mdm-2 oncogene product formsa complex with the p53 protein and inhibits p53-mediated transactivation.Cell,1992,69(7):1237
6.Vogelstein B,Kinzler KW.p53 function and dysfunction.Cell,1992,70(4):523
7.Hayakawa H,Koike G,Sekiguchi M.Experession and cloning of complementary DNA for a human enzyme that repairs O6-methylguanine-DNA.J Mol Biol,1990,213:739
收稿日期：1999-06-07, 百拇医药