PCR-原位扩增法检测慢性乙型肝炎患者骨髓组织中的HBV DNA
作者：周仁荣 王九平 王剑波 康文臻 陈伟红
单位：周仁荣 解放军81医院 江苏省南京市 210002； 王九平 王剑波 康文臻 陈伟红 第四军医大学西京医院 陕西省西安市 710032
关键词：肝炎，乙型；DNA，病毒/ 分析；骨髓；聚合酶链反应
世界华人消化杂志990548 Subject headings hepatitis B; DNA, viral/ analysis; bone marrow; polymerase chain reaction
中国图书馆分类号 R 562.62
目前，国内外实验证实乙型肝炎病毒(HBV)存在于许多肝外组织器官，致使HBV在体内反复复制，病情演变复杂. 我们采用PCR-原位扩增法检测慢性乙肝患者的骨髓，结果表明HBV DNA可以存在于骨髓组织中，此乃可能是慢性乙肝导致外周血细胞下降的病理基础.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 1995-12/ 1996-04本科住院的慢性乙肝患者骨髓穿剌标本10例，经苦味酸固定，石蜡包埋，APES胶片处理载玻片，5 μm厚切片，60℃烤箱72 h. 肝炎诊断标准按1990年上海会议修订的诊断分型标准. 10例均为中度慢性乙型肝炎患者，其中5例有明显外周血细胞下降. 8例正常对照为骨科非乙肝患者骨髓组织. 试剂：Bio-11dUTP北京医科大学药学院产品，HBV引物为北京军事科学院二所设计、合成，耐热DNA多聚酶(Taq酶)，脱氧单核糖酸(dNTP)、10×扩增缓冲液购自华美生物工程公司，链霉素亲和素碱性磷酸酶复合物(SA-SP)为美国ZYMED公司产品.
1.2 方法 骨髓HBsAg免疫组化检测方法按文献[1]. 骨髓组织HBV DNA检测：石蜡切片脱蜡水化，分别用蛋白酶K和RNA酶消化，切片滴加原位扩增液30 μL，覆以硅化盖片. 石蜡油封片，进行PCR双循环，同一例标本须作HE染色. 对照实验①切片中不加Taq酶；②不加引物；③经DNA酶消化；④正常骨髓组织.
, 百拇医药
2 结果
本组10例患者中有2例HBsAg免疫组化染色呈阳性，这2例HBV DNA为阳性反应，信号为蓝兰颗粒，定位于胞质、胞核或核膜上，在骨髓组织中呈弥散性. 2例HBV DNA阳性患者其外周血细胞均有明显下降. 对照试验HBV DNA均为阴性反应(表1).
表1 骨髓组织10例HBV DNA免疫组化及原位PCR检测 指 标
正常骨髓
(n=8)
三系细胞明显下降
(n=5)
三系细胞正常
(n=5)
, http://www.100md.com
血清阳性(PCR法)
0
5
5
免疫组化HBsAg阳性
0
2
0
原位PCR法阳性
0
2
0
3 讨论
, 百拇医药
聚合酶反应(PCR)原位扩增法是随着现代分子生物技术及DNA技术而建立起来的一门新技术. 它具有敏感性高，特异性强等优点. 自Halpern et al[2]在感染鸭肝外组织中发现有聚腺苷酸化鸭乙型肝炎病毒(DHBV) DNA和病毒抗原，并认为可通过mRNA作用，最终基因产物翻译成病毒抗原. 近年研究表明，在HBV感染者的胰腺、脾、肾、外周血细胞等许多外组织细胞中发现HBV DNA[3]. 我们通过对10例患者骨髓组织免疫组化及原位PCR检测，发现有2例阳性，定位于胞质、胞核或核膜，在组织分布为弥散性. 从形态上证实了HBV DNA， HBsAg存在于骨髓细胞中.
病毒诱发骨髓再生低下的动物模型已建立[4]，在许多再障病例中已有细胞免疫系统的紊乱表现，其中包括激活T淋巴细胞的数量和百分率增高，这种细胞始终与病毒性感染起反应作用. 本实验显示骨髓组织中存在HBV DNA，且与乙肝患者外周血细胞的改变有明显关系. 其外周血细胞减少的原因可能与HBV直接对骨髓组织的侵害以及在此基础上造成局部细胞免疫紊乱所致.
, 百拇医药
通讯作者：周仁荣
4 参考文献
[1] 王文亮，张晓东，解慧霞. 肝硬变内HBV DNA及其五种抗原的表达及意义. 中华病理学杂志，1995；24：14-17
[2] Halpern NS, Deery, DI, Viral nucleic acid snthesis and antigen accumulation in pancreas and kidney of peking ducks infected with duck hepatitis B Virus. Proc Natl Acad Sci USA, 1983；80：4860-4869
[3] 赵勇，梁英锐. 慢性活动性肝炎HBV DNA原位分子杂交研究. 中华病理学杂志，1990；19：42-45
[4] 高崇娴，张跃文，陈雅洁. 肝病患者骨髓细胞乙型肝炎病毒感染的研究. 中华内科杂志，1991；30：24-26
收稿日期：1998-10-16, http://www.100md.com
单位：周仁荣 解放军81医院 江苏省南京市 210002； 王九平 王剑波 康文臻 陈伟红 第四军医大学西京医院 陕西省西安市 710032
关键词：肝炎，乙型；DNA，病毒/ 分析；骨髓；聚合酶链反应
世界华人消化杂志990548 Subject headings hepatitis B; DNA, viral/ analysis; bone marrow; polymerase chain reaction
中国图书馆分类号 R 562.62
目前，国内外实验证实乙型肝炎病毒(HBV)存在于许多肝外组织器官，致使HBV在体内反复复制，病情演变复杂. 我们采用PCR-原位扩增法检测慢性乙肝患者的骨髓，结果表明HBV DNA可以存在于骨髓组织中，此乃可能是慢性乙肝导致外周血细胞下降的病理基础.
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1 材料和方法
1.1 材料 1995-12/ 1996-04本科住院的慢性乙肝患者骨髓穿剌标本10例，经苦味酸固定，石蜡包埋，APES胶片处理载玻片，5 μm厚切片，60℃烤箱72 h. 肝炎诊断标准按1990年上海会议修订的诊断分型标准. 10例均为中度慢性乙型肝炎患者，其中5例有明显外周血细胞下降. 8例正常对照为骨科非乙肝患者骨髓组织. 试剂：Bio-11dUTP北京医科大学药学院产品，HBV引物为北京军事科学院二所设计、合成，耐热DNA多聚酶(Taq酶)，脱氧单核糖酸(dNTP)、10×扩增缓冲液购自华美生物工程公司，链霉素亲和素碱性磷酸酶复合物(SA-SP)为美国ZYMED公司产品.
1.2 方法 骨髓HBsAg免疫组化检测方法按文献[1]. 骨髓组织HBV DNA检测：石蜡切片脱蜡水化，分别用蛋白酶K和RNA酶消化，切片滴加原位扩增液30 μL，覆以硅化盖片. 石蜡油封片，进行PCR双循环，同一例标本须作HE染色. 对照实验①切片中不加Taq酶；②不加引物；③经DNA酶消化；④正常骨髓组织.
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2 结果
本组10例患者中有2例HBsAg免疫组化染色呈阳性，这2例HBV DNA为阳性反应，信号为蓝兰颗粒，定位于胞质、胞核或核膜上，在骨髓组织中呈弥散性. 2例HBV DNA阳性患者其外周血细胞均有明显下降. 对照试验HBV DNA均为阴性反应(表1).
表1 骨髓组织10例HBV DNA免疫组化及原位PCR检测 指 标
正常骨髓
(n=8)
三系细胞明显下降
(n=5)
三系细胞正常
(n=5)
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血清阳性(PCR法)
0
5
5
免疫组化HBsAg阳性
0
2
0
原位PCR法阳性
0
2
0
3 讨论
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聚合酶反应(PCR)原位扩增法是随着现代分子生物技术及DNA技术而建立起来的一门新技术. 它具有敏感性高，特异性强等优点. 自Halpern et al[2]在感染鸭肝外组织中发现有聚腺苷酸化鸭乙型肝炎病毒(DHBV) DNA和病毒抗原，并认为可通过mRNA作用，最终基因产物翻译成病毒抗原. 近年研究表明，在HBV感染者的胰腺、脾、肾、外周血细胞等许多外组织细胞中发现HBV DNA[3]. 我们通过对10例患者骨髓组织免疫组化及原位PCR检测，发现有2例阳性，定位于胞质、胞核或核膜，在组织分布为弥散性. 从形态上证实了HBV DNA， HBsAg存在于骨髓细胞中.
病毒诱发骨髓再生低下的动物模型已建立[4]，在许多再障病例中已有细胞免疫系统的紊乱表现，其中包括激活T淋巴细胞的数量和百分率增高，这种细胞始终与病毒性感染起反应作用. 本实验显示骨髓组织中存在HBV DNA，且与乙肝患者外周血细胞的改变有明显关系. 其外周血细胞减少的原因可能与HBV直接对骨髓组织的侵害以及在此基础上造成局部细胞免疫紊乱所致.
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通讯作者：周仁荣
4 参考文献
[1] 王文亮，张晓东，解慧霞. 肝硬变内HBV DNA及其五种抗原的表达及意义. 中华病理学杂志，1995；24：14-17
[2] Halpern NS, Deery, DI, Viral nucleic acid snthesis and antigen accumulation in pancreas and kidney of peking ducks infected with duck hepatitis B Virus. Proc Natl Acad Sci USA, 1983；80：4860-4869
[3] 赵勇，梁英锐. 慢性活动性肝炎HBV DNA原位分子杂交研究. 中华病理学杂志，1990；19：42-45
[4] 高崇娴，张跃文，陈雅洁. 肝病患者骨髓细胞乙型肝炎病毒感染的研究. 中华内科杂志，1991；30：24-26
收稿日期：1998-10-16, http://www.100md.com