大鼠胚胎小脑提取液对培养脊髓神经细胞的作用
作者：吕捷 吕永利
单位：吕捷 现在首都医科大学神经科学研究所；吕永利 中国医科大学脑研究所神经解剖研究室，沈阳 110001
关键词：靶源性神经营养因子；小脑提取液；胎龄；脊髓
中华医科990502 摘要 目的：探讨不同胎龄大鼠小脑提取液(CE)对体外培养脊髓神经细胞的影响。方法：制备不同蛋白浓度的14，16，18，20 d胎鼠(E14、E16、E18、E20)CE，加入原代培养的E18胎鼠脊髓神经细胞中，24 h后以微量快速自动比色法检测细胞活性。结果：实验组各胎龄CE均能促进培养脊髓神经元的存活，并有蛋白浓度依赖关系，与对照组及其它各实验组相比有极显著性差异(P<0.001)，E14和E18 CE分别在蛋白浓度为0.20和0.40 mg/ml时有最大神经营养活性。结论：CE对培养脊髓神经细胞具有明显营养作用。
, http://www.100md.com Effect of Cerebellum Extracts from Embryonic Rat on Cultured Spinal Neural Cells
L
Jie, L Yongli
Neuroanatomy Research Office, Brain Institute, China Medical University, Shenyang, 110001
ABSTRACT Objective:The effects of cerebellum extracts (CE) from different embryonic aged of rat on the cultured rat spinal cells were studied. Methods：CE from 14 d, 16 d, 18 d, 20 d aged of embryonic rats (E14～E20) were collected and were made into solutions of containing different concentrations of proteins. Then these solutions were added to the cultured spinal cells of E18 rats. The neuronal survival was determined by the auto-colorimetric assay. Results:CE of all experimental aged of rats could promote the survival of spinal neurons, and there was also a concentration-dependent relation on protein, with significant differences (P<0.001) between the control and experimental groups. The most prominent neurotrophic activities were found in E14 CE of 0.20 mg/ml and E18 CE of 0.40 mg/ml. Conclusion:CE has significant neurotrophic effects on cultured spinal neural cells.
, 百拇医药
KEY WORDS target-derived neurotrophic factors; cerebellum extracts; embryonic age; spinal cord
受损伤神经元的存活及功能恢复有赖于这些神经元的靶细胞提供的特异的靶源性神经营养因子(target-derived neurotrophic factors, TNTFs)[1]。小脑是脊髓的主要靶器官之一，已发现有多种神经营养因子(neurotrophic factors NTFs)及其受体在两者表达，但以小脑为靶器官提供的TNTFs还未见报道。胚胎小脑是一种在脑移植中被广为应用的移植物，它能抑制瘢痕组织生长，促进神经组织再生[2]，诱导损伤后脊髓小脑束的重建[1]。为进一步探讨胚胎小脑中的有效神经营养成分，我们制备了小脑提取液(cerebellum extracts, CE)，观察了它对培养脊髓细胞的作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 CE的制备
取相应胎龄(E14、E16、E18、E20)胚鼠小脑各20个，制备匀浆，经超声粉碎，超速离心，取上清液，以紫外分光光度法测定蛋白质浓度，以PBS (pH7.0)作相应稀释，得到不同蛋白浓度(0.05～0.60mg/ml)的CE。
1.2 细胞培养
取出E18脊髓，经胰酶消化得到脊髓细胞悬液，稀释到1×106/ml。将细胞悬液以5×104/孔的密度接种于96孔板。实验组每孔加入50 μl不同胎龄不同浓度的CE，对照组每孔加入50μl PBS (pH7.0)，每孔总容量为100μl。置培养箱内孵育24h。各组每次8孔，重复2～3批次。
1.3 快速微量自动比色(MTT)分析
, 百拇医药
终止培养前4h，96孔板每孔加10μl四唑盐衍生物MTT溶液(1.5mg/ml 1640)，继续培养4h后每孔加入100μl 0.08mol/L HCl—异丙醇溶液终止反应。用吸管反复抽吸使蓝色产物充分溶解，将培养板置于微板读数器内，采用实验波长570nm，参考波长630nm测定每孔样品的光密度(OD)值。四唑盐衍生物MTT可被活跃的细胞摄取，并在细胞质线粒体脱氢酶的作用下转变为蓝色产物formazan，在一定波长下比色得到OD值。活跃细胞越多，蓝色产物越多，则OD值越高，说明作用性越强。
1.4 统计分析
对所得数据进行Student's t检验，α=0.05。
2 结果
终止培养后测得各孔OD值，反映各胎龄不同浓度CE对培养24h E18脊髓神经细胞的作用，见表1、2，图1、2。
, 百拇医药
表1 E14及E16 CE对培养24h E18脊髓神经细胞的作用(n=8，
±s) OD值
对照组
实验组CE蛋白浓度(mg/ml)
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
E14 OD值
0.002
, 百拇医药 ±0.001
0.038
±0.009
0.120
±0.020
0.132
±0.014
0.174
±0.019
0.155
±0.012
P
<0.001
, http://www.100md.com
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
E16 OD值
0.004
±0.002
0.047
±0.005
0.072
±0.017
0.099
, 百拇医药 ±0.023
0.146
±0.020
0.213
±0.015
P
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
图1 E14及E16 CE对培养E18脊髓神经细胞的作用
, http://www.100md.com
表2 E18及E20 CE对培养24 h E18脊髓神经细胞的作用(n=8，±s) OD值
对照组
实验组CE蛋白浓度(mg/ml)
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60
E18 OD值
0.010
, 百拇医药 ±0.001
0.141
±0.025
0.056
±0.004
0.041
±0.005
0.031
±0.002
0.020
±0.001
P
<0.001
, http://www.100md.com
<0.001
<0.001
<0.001
<0.001
E20 OD值
0.006
±0.001
0.014
±0.001
0.010
±0.002
0.016
, 百拇医药 ±0.002
0.008
±0.001
0.010
±0.004
P
<0.001
<0.001
<0.001
>0.05
<0.02
表1和图1显示了0.05～0.25mg/ml蛋白浓度的E14与E16 CE对培养脊髓神经细胞的作用。可见各实验组与对照组有极显著性差异(P<0.001)，E14组最适浓度为0.20mg/ml。
, 百拇医药
表2和图2显示了0.40～0.45mg/ml蛋白浓度的E18与E20 CE对培养脊髓神经细胞的作用。可见除E20 0.55mg/ml组与对照组无显著性差异外，其余各实验组与对照组均有极显著性差异(P<0.001)。E18组在0.40 mg/ml取得最大值，其后迅速下降，E20组效应曲线则处于低水平波动状态。两组比较亦有极显著性差异(P<0.001)。
图2 E18及E20 CE对培养E18脊髓神经细胞的作用
以上结果表明，实验的各胎龄CE均能支持培养E18脊髓神经元的存活，并有蛋白浓度依赖关系；在相同的蛋白浓度范围内，E14、E16、E18 CE显示了更强的神经营养活性。
3 讨论
以胚胎脑组织移植修复脊髓损伤已有不少报道[1，2]，以各种NTFs作用于培养脊髓神经细胞也已有广泛的研究[3]。小脑是脊髓的主要靶器官，两者之间存在着重要的纤维联系，但以小脑为靶器官提供的特异性TNTFs还未见报道，本研究首次报道了小脑提取液对培养脊髓神经细胞的作用。
, 百拇医药
已有研究表明，培养24 h的胚胎脊髓细胞98%为神经元[4]，所以我们认为，培养24 h的细胞活性可视为神经细胞的活性。几乎所有的实验组与对照组都有显著差异，表明CE确实具有神经营养活性。E14 CE的效应曲线在一个最适蛋白浓度(0.2mg/ml)时取得最大OD值，E18 CE的效应曲线在一个最适蛋白浓度(0.4mg/ml)时取得最大OD值，浓度低于或高于这个界值，作用就会减弱，这与已有的关于TNTFs研究的报道一致[5]，表明CE中的某种或某几种蛋白质具有神经营养活性，可促进培养神经元的存活。E16 CE的效应曲线在测定范围内呈现单方向的升区间，根据上述趋势，我们推论，它的最适浓度可能位于该范围之外，有待进一步验证。
为什么一定胚胎期，一定蛋白浓度的CE具有更强的神经营养活性呢?我们认为，E14～E18小脑胚胎期正处于神经元群体分化期，轴突形成需要靶器官提供特异的TNTFs，早于或迟于这一时期，该因子不再表达，这是受细胞固有的遗传信息所调控的，高浓度的营养液导致神经营养活性的降低可能是高浓度的TNTFs引起细胞表面受体的下调结果[5]。
, 百拇医药
本实验结果表明，各胎龄CE均对脊髓神经元具有明显的神经营养作用，并各自具有蛋白浓度依赖关系，在相同的蛋白浓度范围内，E14、E16、E18 CE显示了更强的神经营养活性，为利用胚胎小脑移植修复脊髓损伤提供了实验依据。
国家自然科学基金资助项目，39270682
作者简介：吕捷 研究生
参考文献
1 Himes BT, Goldberger ME, Tessler A. Grafts of fetal central nervous system tissue rescue axotomized Clarke's nucleus neurons in adult and neonatal operates. J Comp Neurol, 1994,339:117—131
, 百拇医药
2 南龙哲，于频.培养小脑和胚胎小脑组织移植修复横断脊髓的实验研究.中华外科杂志，1989，27(4)：247—249
3 Kato AC, Lindsay RM. Overlapping and additive effects of neurotrophins and CNTF on cultured human spinal cord neurons. Exp Neurol, 1994,130:196—201
4 Huber KA, Krieglstein K, Vnsicker K. The neurotrophins BDNF, NT-3 and NT-4 but not NGF, TGF-β 1 and GDNF increase the number of NADPH-diaphorase-reactive neurons in rat spinal cord cultures. Neuroscience, 1995,69(3):77—779
5 Eagleson KL, Haun F, Cuningham TJ. Different populations of dorsal lateral geniculate nucleus neurons have concentration-specific requirments for a cortically derived neuron survival factor. Exp Neurol, 1990,110:284—290
1998-07-20收稿, 百拇医药
单位：吕捷 现在首都医科大学神经科学研究所；吕永利 中国医科大学脑研究所神经解剖研究室，沈阳 110001
关键词：靶源性神经营养因子；小脑提取液；胎龄；脊髓
中华医科990502 摘要 目的：探讨不同胎龄大鼠小脑提取液(CE)对体外培养脊髓神经细胞的影响。方法：制备不同蛋白浓度的14，16，18，20 d胎鼠(E14、E16、E18、E20)CE，加入原代培养的E18胎鼠脊髓神经细胞中，24 h后以微量快速自动比色法检测细胞活性。结果：实验组各胎龄CE均能促进培养脊髓神经元的存活，并有蛋白浓度依赖关系，与对照组及其它各实验组相比有极显著性差异(P<0.001)，E14和E18 CE分别在蛋白浓度为0.20和0.40 mg/ml时有最大神经营养活性。结论：CE对培养脊髓神经细胞具有明显营养作用。
, http://www.100md.com Effect of Cerebellum Extracts from Embryonic Rat on Cultured Spinal Neural Cells
L
Jie, L YongliNeuroanatomy Research Office, Brain Institute, China Medical University, Shenyang, 110001
ABSTRACT Objective:The effects of cerebellum extracts (CE) from different embryonic aged of rat on the cultured rat spinal cells were studied. Methods：CE from 14 d, 16 d, 18 d, 20 d aged of embryonic rats (E14～E20) were collected and were made into solutions of containing different concentrations of proteins. Then these solutions were added to the cultured spinal cells of E18 rats. The neuronal survival was determined by the auto-colorimetric assay. Results:CE of all experimental aged of rats could promote the survival of spinal neurons, and there was also a concentration-dependent relation on protein, with significant differences (P<0.001) between the control and experimental groups. The most prominent neurotrophic activities were found in E14 CE of 0.20 mg/ml and E18 CE of 0.40 mg/ml. Conclusion:CE has significant neurotrophic effects on cultured spinal neural cells.
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KEY WORDS target-derived neurotrophic factors; cerebellum extracts; embryonic age; spinal cord
受损伤神经元的存活及功能恢复有赖于这些神经元的靶细胞提供的特异的靶源性神经营养因子(target-derived neurotrophic factors, TNTFs)[1]。小脑是脊髓的主要靶器官之一，已发现有多种神经营养因子(neurotrophic factors NTFs)及其受体在两者表达，但以小脑为靶器官提供的TNTFs还未见报道。胚胎小脑是一种在脑移植中被广为应用的移植物，它能抑制瘢痕组织生长，促进神经组织再生[2]，诱导损伤后脊髓小脑束的重建[1]。为进一步探讨胚胎小脑中的有效神经营养成分，我们制备了小脑提取液(cerebellum extracts, CE)，观察了它对培养脊髓细胞的作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 CE的制备
取相应胎龄(E14、E16、E18、E20)胚鼠小脑各20个，制备匀浆，经超声粉碎，超速离心，取上清液，以紫外分光光度法测定蛋白质浓度，以PBS (pH7.0)作相应稀释，得到不同蛋白浓度(0.05～0.60mg/ml)的CE。
1.2 细胞培养
取出E18脊髓，经胰酶消化得到脊髓细胞悬液，稀释到1×106/ml。将细胞悬液以5×104/孔的密度接种于96孔板。实验组每孔加入50 μl不同胎龄不同浓度的CE，对照组每孔加入50μl PBS (pH7.0)，每孔总容量为100μl。置培养箱内孵育24h。各组每次8孔，重复2～3批次。
1.3 快速微量自动比色(MTT)分析
, 百拇医药
终止培养前4h，96孔板每孔加10μl四唑盐衍生物MTT溶液(1.5mg/ml 1640)，继续培养4h后每孔加入100μl 0.08mol/L HCl—异丙醇溶液终止反应。用吸管反复抽吸使蓝色产物充分溶解，将培养板置于微板读数器内，采用实验波长570nm，参考波长630nm测定每孔样品的光密度(OD)值。四唑盐衍生物MTT可被活跃的细胞摄取，并在细胞质线粒体脱氢酶的作用下转变为蓝色产物formazan，在一定波长下比色得到OD值。活跃细胞越多，蓝色产物越多，则OD值越高，说明作用性越强。
1.4 统计分析
对所得数据进行Student's t检验，α=0.05。
2 结果
终止培养后测得各孔OD值，反映各胎龄不同浓度CE对培养24h E18脊髓神经细胞的作用，见表1、2，图1、2。
, 百拇医药
表1 E14及E16 CE对培养24h E18脊髓神经细胞的作用(n=8，
±s) OD值对照组
实验组CE蛋白浓度(mg/ml)
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
E14 OD值
0.002
, 百拇医药 ±0.001
0.038
±0.009
0.120
±0.020
0.132
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P
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E16 OD值
0.004
±0.002
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±0.005
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图1 E14及E16 CE对培养E18脊髓神经细胞的作用
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表2 E18及E20 CE对培养24 h E18脊髓神经细胞的作用(n=8，
±s) OD值对照组
实验组CE蛋白浓度(mg/ml)
0.40
0.45
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E18 OD值
0.010
, 百拇医药 ±0.001
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表1和图1显示了0.05～0.25mg/ml蛋白浓度的E14与E16 CE对培养脊髓神经细胞的作用。可见各实验组与对照组有极显著性差异(P<0.001)，E14组最适浓度为0.20mg/ml。
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表2和图2显示了0.40～0.45mg/ml蛋白浓度的E18与E20 CE对培养脊髓神经细胞的作用。可见除E20 0.55mg/ml组与对照组无显著性差异外，其余各实验组与对照组均有极显著性差异(P<0.001)。E18组在0.40 mg/ml取得最大值，其后迅速下降，E20组效应曲线则处于低水平波动状态。两组比较亦有极显著性差异(P<0.001)。
图2 E18及E20 CE对培养E18脊髓神经细胞的作用
以上结果表明，实验的各胎龄CE均能支持培养E18脊髓神经元的存活，并有蛋白浓度依赖关系；在相同的蛋白浓度范围内，E14、E16、E18 CE显示了更强的神经营养活性。
3 讨论
以胚胎脑组织移植修复脊髓损伤已有不少报道[1，2]，以各种NTFs作用于培养脊髓神经细胞也已有广泛的研究[3]。小脑是脊髓的主要靶器官，两者之间存在着重要的纤维联系，但以小脑为靶器官提供的特异性TNTFs还未见报道，本研究首次报道了小脑提取液对培养脊髓神经细胞的作用。
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已有研究表明，培养24 h的胚胎脊髓细胞98%为神经元[4]，所以我们认为，培养24 h的细胞活性可视为神经细胞的活性。几乎所有的实验组与对照组都有显著差异，表明CE确实具有神经营养活性。E14 CE的效应曲线在一个最适蛋白浓度(0.2mg/ml)时取得最大OD值，E18 CE的效应曲线在一个最适蛋白浓度(0.4mg/ml)时取得最大OD值，浓度低于或高于这个界值，作用就会减弱，这与已有的关于TNTFs研究的报道一致[5]，表明CE中的某种或某几种蛋白质具有神经营养活性，可促进培养神经元的存活。E16 CE的效应曲线在测定范围内呈现单方向的升区间，根据上述趋势，我们推论，它的最适浓度可能位于该范围之外，有待进一步验证。
为什么一定胚胎期，一定蛋白浓度的CE具有更强的神经营养活性呢?我们认为，E14～E18小脑胚胎期正处于神经元群体分化期，轴突形成需要靶器官提供特异的TNTFs，早于或迟于这一时期，该因子不再表达，这是受细胞固有的遗传信息所调控的，高浓度的营养液导致神经营养活性的降低可能是高浓度的TNTFs引起细胞表面受体的下调结果[5]。
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本实验结果表明，各胎龄CE均对脊髓神经元具有明显的神经营养作用，并各自具有蛋白浓度依赖关系，在相同的蛋白浓度范围内，E14、E16、E18 CE显示了更强的神经营养活性，为利用胚胎小脑移植修复脊髓损伤提供了实验依据。
国家自然科学基金资助项目，39270682
作者简介：吕捷 研究生
参考文献
1 Himes BT, Goldberger ME, Tessler A. Grafts of fetal central nervous system tissue rescue axotomized Clarke's nucleus neurons in adult and neonatal operates. J Comp Neurol, 1994,339:117—131
, 百拇医药
2 南龙哲，于频.培养小脑和胚胎小脑组织移植修复横断脊髓的实验研究.中华外科杂志，1989，27(4)：247—249
3 Kato AC, Lindsay RM. Overlapping and additive effects of neurotrophins and CNTF on cultured human spinal cord neurons. Exp Neurol, 1994,130:196—201
4 Huber KA, Krieglstein K, Vnsicker K. The neurotrophins BDNF, NT-3 and NT-4 but not NGF, TGF-β 1 and GDNF increase the number of NADPH-diaphorase-reactive neurons in rat spinal cord cultures. Neuroscience, 1995,69(3):77—779
5 Eagleson KL, Haun F, Cuningham TJ. Different populations of dorsal lateral geniculate nucleus neurons have concentration-specific requirments for a cortically derived neuron survival factor. Exp Neurol, 1990,110:284—290
1998-07-20收稿, 百拇医药