改良解脲/人型支原体诊断试剂的应用评价
作者：王金龙
单位：王金龙 广州市肿瘤医院检验科(510095)
关键词：泌尿生殖道支原体；诊断试剂；评价
广东医学990513摘要：目的 评价自制改良解脲脲原体(UU)/人型支原体(MH)诊断试剂的质量。方法 参考法国生物梅里埃支原体Mycoplasma IST培养基组成，调整常规泌尿生殖道支原体培养基的主要成分浓度、添加4种抑菌剂和复合营养增强剂。用改良和Mycoplasma IST两种支原体诊断试剂对93例临床标本同时检测。结果 改良培养基检测UU阳性者28例(30.1%)；MH阳性者5例(5.4%)；梅里埃试剂检测UU阳性者29例(31.2%)，MH阳性者5例(5.4%)。两试剂检测结果差异无显著性(两组UU检出率比较χ2=0.25,P>0.5；MH检出率比较χ2=3.2,P>0.05)。结论 自制改良UU/MH诊断试剂质量接近Mycoplasma IST。
, 百拇医药
长期以来，对泌尿生殖道支原体感染的实验诊断主要采用选择培养法[1，2]。国外现代支原体培养诊断试剂质量已有很大提高；而国内仍停留在传统水平上。为此，我们参照法国生物梅里埃支原体Mycoplasma IST诊断试剂的特点，在常规解脲脲原体(ureaplasma urealyticum, UU)/人型支原体(mycoplasma hominis, MH)液体选择培养基基础上，调整其主要成分浓度、添加4种抑菌剂和复合营养增强剂，改进了常规UU/MH液体选择培养基。并用改良和生物梅里埃两种诊断试剂进行了支原体培养、鉴定等试验对照。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 标准菌株 UU 4、8型和MH标准菌株由中山医科大学微生物学教研室提供。阳性培养物取0.1 mL接种。
1.2 标本 分别用无菌棉签(各受检者同时取2支)或无菌试管收集诊断为泌尿生殖道感染者的阴道分泌物或前段尿，共93份(男34份，女59份，年龄21～58岁)，3 h内送实验室。棉拭子同时接种两种培养基内(3 mL)；尿标本取10 mL，2 000 r/min离心10 min，弃上清，每次取沉渣0.2 mL同时接种两种培养液内(3 mL)。接种后各标本置支原体培养液中，4 ℃保存48 h内可重新接种。
, 百拇医药
1.3 培养诊断试剂 ①法国梅里埃泌尿生殖道支原体Mycoplasma IST试剂盒，批号7141 35501，有效期内严格按说明书使用操作；②自制改良UU/MH液体选择培养基：低钾牛心消化液250 mL、蛋白胨8 g、酵母提取物4 g、尿素0.5 g、精氨酸5 g、半胱氨酸0.1 g、酚红0.05 g、氯化钠3.5 g，加双蒸水至860 mL，低磅灭菌，加新生小牛血清120 mL、复合营养增强剂10 mL(polyvitex mixture:含L-谷氨酰胺、腺嘌呤、氧化型二磷吡啶核苷酸、胱氨酸、葡萄糖等)、3种抗生素及1种抗真菌剂混合液10 mL、pH值调至6.3[1～3]。3 mL分装于培养小瓶，-20℃冻存备用。
1.4 分析仪器及试剂 日立7020全自动生化分析仪及北京中生生化试剂；瑞士AVL钾钠氯分析仪及配套试剂；AVL血气分析仪及配套试剂。取两种培养基样品，分别按各仪器分析测试常规操作上机进行测试。
, 百拇医药
1.5 培养鉴定试验 各标准菌株和临床标本同时接种两种培养基，充分摇匀。取55 μL加入同一批号Mycoplasma IST配套的培养鉴定试条中，加石蜡油覆盖，(36±1)℃孵育，24 h和48 h分别观察结果：培养基指示剂呈橙/红色清亮为支原体生长指征；若培养基呈红色混浊，则将保存备用标本重新接种或转种，并用0.45 μm孔径针头式过滤器除菌后重新检测。试条鉴定孔培养基指示剂呈橙/红色则相应为UU和(或)MH阳性。
1.6 统计学处理 采用配对计数资料的χ2检验。
2 结果
2.1 两种支原体UU/MH液体选择培养基部分生化指标测试结果 见表1。
表1 两种支原体UU/MH液体选择培养基部分生化指标测试结果 培养基种类
, http://www.100md.com
K+
Na+
Cl-
P
Ur
Glu
Cho
TP
(g/L)
Alb
(g/L)
pH值
, 百拇医药 (mmol/L)
Mycoplasma IST
9.3
95.5
104.6
5.2
9.7
5.4
0.17
45.2
3.6
6.3
改良UU/MH试剂
, http://www.100md.com
12.1
92.7
104.4
5.6
9.7
5.9
0.11
43.8
4.1
6.3
2.2 两种UU/MH液体选择培养基检测临床93例标本UU和MH结果 见表2和表3。
表2 两种UU/MH液体选择培养基检测临床93例标本的UU结果(%) 培养基种类
, http://www.100md.com
阳性率
阴性率
假阳性率
假阴性率
特异性
敏感性
Mycoplasma IST
31.2
66.7
2.2
0
96.9
100
, http://www.100md.com
改良UU/MH试剂
30.1*
65.6**
3.2
1.1
95.3
96.6
*阳性符合率96.55%，**阴性符合率98.38%，UU：χ2=0.25,P>0.5表3 两种UU/MH液体选择培养基检测临床93例标本的MH结果(%) 培养基种类
阳性率
阴性率
, 百拇医药
假阳性率
假阴性率
特异性
敏感性
Mycoplasma IST
5.4
93.5
1.1
0
98.9
100
改良UU/MH试剂
5.4*
, http://www.100md.com
92.5**
2.2
0
97.7
100
*阳性符合率100%，**阴性符合率98.85%，MH：χ2=3.2,P>0.05
2.3 鉴定结果 两种UU/MH液体选择培养基接种支原体标准菌株的培养鉴定结果相同。
3 讨论
由于各种支原体UU/MH培养基配方、原料和工艺等不同，培养基的生化成份及质量有一定差别。法国生物梅里埃Mycoplasma IST培养基比常规培养基多10余种成分，除特殊的复合营养增强剂、bio-Myotone、马血清和4种抗生素外，在一般成分上，Mycoplasma IST与常规培养基相比：尿素、氯化钠较低；精氨酸、葡萄糖和酚红较高。培养基改良中，采用了进口的蛋白胨、酵母提取物、复合营养增强剂及抗生素等原料。常规制备的牛心消化液含大量钾离子，若用35%(V/V)的牛心消化液配制[1，3]，培养基中钾离子浓度高出梅里埃试剂1倍以上。笔者在消化新鲜牛心前增设一个除溶血液的步骤，除去约50%的钾离子。用低钾牛心消化液、蛋白胨和新生小牛血清替代了生物梅里埃的bio-Myotone,bio-Trypcase和马血清。
, http://www.100md.com
常规支原体UU/MH培养基抑菌剂多为青霉素，其检测临床标本中有较高比例的细菌混浊生长现象。细菌生长既干扰了结果判断，又竞争性地消耗培养液的营养成分影响结果的真实性。自制改良UU/MH培养基同Mycoplasma IST一样，加有3种抗生素和1种抗真菌制剂。据报道[4]，有多种抑菌剂组合模式。我们经过验证试验选定了与Mycoplasma IST符合率最高的一种模式。对于极少数耐药菌引起的培养液混浊情况，我们在标本有效保存时间内再次接种或转种，过滤除菌后进行培养鉴定。
自制改良培养基成品外观和接种UU、MH标准菌株及临床阳性标本的指示时间和显橙/红色程度与Mycoplasma IST相同。常规培养基成品外观颜色及支原体阳性显色与Mycoplasma IST相差较大，因无复合营养增强剂，部分支原体阳性显色时间延迟，有的为阴性结果。自制改良UU/MH液体培养基宜在0℃以下保存。若4℃保存，培养基的营养成分及抑菌剂活性损失程度较大。Mycoplasma IST将不稳定组分制成冻干品，很好地保存了培养基的有效成分。
, 百拇医药
(本研究得到广州市皮肤病防治研究所费实主任、曹文苓医师大力支持，谨此志谢)
参考文献
1 李影林，主编.中华医学检验全书.北京：人民卫生出版社，1997.1132～1134
2 Clegg A, Passey M, Yoannes M, et al. High rates of genital mycoplasma infection in the hihglands of Papua New Guinea determined both by cultrue and by a commercial detection kit. J Clin Microbiol, 1997,35(1):197
3 吴移谋，余敏君，尹卫国.从临床标本中定量检测泌尿生殖道支原体耐药性的研究.中华医学检验杂志，1998，21(6)：335
4 Fiacco V, Miller MJ, Carney E, et al. Comparison of media for isolation of ureaplasma urealyticum and genital Mycoplasma species. J Clin Microbiology, 1984,20(5):862, 百拇医药
单位：王金龙 广州市肿瘤医院检验科(510095)
关键词：泌尿生殖道支原体；诊断试剂；评价
广东医学990513摘要：目的 评价自制改良解脲脲原体(UU)/人型支原体(MH)诊断试剂的质量。方法 参考法国生物梅里埃支原体Mycoplasma IST培养基组成，调整常规泌尿生殖道支原体培养基的主要成分浓度、添加4种抑菌剂和复合营养增强剂。用改良和Mycoplasma IST两种支原体诊断试剂对93例临床标本同时检测。结果 改良培养基检测UU阳性者28例(30.1%)；MH阳性者5例(5.4%)；梅里埃试剂检测UU阳性者29例(31.2%)，MH阳性者5例(5.4%)。两试剂检测结果差异无显著性(两组UU检出率比较χ2=0.25,P>0.5；MH检出率比较χ2=3.2,P>0.05)。结论 自制改良UU/MH诊断试剂质量接近Mycoplasma IST。
, 百拇医药
长期以来，对泌尿生殖道支原体感染的实验诊断主要采用选择培养法[1，2]。国外现代支原体培养诊断试剂质量已有很大提高；而国内仍停留在传统水平上。为此，我们参照法国生物梅里埃支原体Mycoplasma IST诊断试剂的特点，在常规解脲脲原体(ureaplasma urealyticum, UU)/人型支原体(mycoplasma hominis, MH)液体选择培养基基础上，调整其主要成分浓度、添加4种抑菌剂和复合营养增强剂，改进了常规UU/MH液体选择培养基。并用改良和生物梅里埃两种诊断试剂进行了支原体培养、鉴定等试验对照。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 标准菌株 UU 4、8型和MH标准菌株由中山医科大学微生物学教研室提供。阳性培养物取0.1 mL接种。
1.2 标本 分别用无菌棉签(各受检者同时取2支)或无菌试管收集诊断为泌尿生殖道感染者的阴道分泌物或前段尿，共93份(男34份，女59份，年龄21～58岁)，3 h内送实验室。棉拭子同时接种两种培养基内(3 mL)；尿标本取10 mL，2 000 r/min离心10 min，弃上清，每次取沉渣0.2 mL同时接种两种培养液内(3 mL)。接种后各标本置支原体培养液中，4 ℃保存48 h内可重新接种。
, 百拇医药
1.3 培养诊断试剂 ①法国梅里埃泌尿生殖道支原体Mycoplasma IST试剂盒，批号7141 35501，有效期内严格按说明书使用操作；②自制改良UU/MH液体选择培养基：低钾牛心消化液250 mL、蛋白胨8 g、酵母提取物4 g、尿素0.5 g、精氨酸5 g、半胱氨酸0.1 g、酚红0.05 g、氯化钠3.5 g，加双蒸水至860 mL，低磅灭菌，加新生小牛血清120 mL、复合营养增强剂10 mL(polyvitex mixture:含L-谷氨酰胺、腺嘌呤、氧化型二磷吡啶核苷酸、胱氨酸、葡萄糖等)、3种抗生素及1种抗真菌剂混合液10 mL、pH值调至6.3[1～3]。3 mL分装于培养小瓶，-20℃冻存备用。
1.4 分析仪器及试剂 日立7020全自动生化分析仪及北京中生生化试剂；瑞士AVL钾钠氯分析仪及配套试剂；AVL血气分析仪及配套试剂。取两种培养基样品，分别按各仪器分析测试常规操作上机进行测试。
, 百拇医药
1.5 培养鉴定试验 各标准菌株和临床标本同时接种两种培养基，充分摇匀。取55 μL加入同一批号Mycoplasma IST配套的培养鉴定试条中，加石蜡油覆盖，(36±1)℃孵育，24 h和48 h分别观察结果：培养基指示剂呈橙/红色清亮为支原体生长指征；若培养基呈红色混浊，则将保存备用标本重新接种或转种，并用0.45 μm孔径针头式过滤器除菌后重新检测。试条鉴定孔培养基指示剂呈橙/红色则相应为UU和(或)MH阳性。
1.6 统计学处理 采用配对计数资料的χ2检验。
2 结果
2.1 两种支原体UU/MH液体选择培养基部分生化指标测试结果 见表1。
表1 两种支原体UU/MH液体选择培养基部分生化指标测试结果 培养基种类
, http://www.100md.com
K+
Na+
Cl-
P
Ur
Glu
Cho
TP
(g/L)
Alb
(g/L)
pH值
, 百拇医药 (mmol/L)
Mycoplasma IST
9.3
95.5
104.6
5.2
9.7
5.4
0.17
45.2
3.6
6.3
改良UU/MH试剂
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12.1
92.7
104.4
5.6
9.7
5.9
0.11
43.8
4.1
6.3
2.2 两种UU/MH液体选择培养基检测临床93例标本UU和MH结果 见表2和表3。
表2 两种UU/MH液体选择培养基检测临床93例标本的UU结果(%) 培养基种类
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阳性率
阴性率
假阳性率
假阴性率
特异性
敏感性
Mycoplasma IST
31.2
66.7
2.2
0
96.9
100
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改良UU/MH试剂
30.1*
65.6**
3.2
1.1
95.3
96.6
*阳性符合率96.55%，**阴性符合率98.38%，UU：χ2=0.25,P>0.5表3 两种UU/MH液体选择培养基检测临床93例标本的MH结果(%) 培养基种类
阳性率
阴性率
, 百拇医药
假阳性率
假阴性率
特异性
敏感性
Mycoplasma IST
5.4
93.5
1.1
0
98.9
100
改良UU/MH试剂
5.4*
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92.5**
2.2
0
97.7
100
*阳性符合率100%，**阴性符合率98.85%，MH：χ2=3.2,P>0.05
2.3 鉴定结果 两种UU/MH液体选择培养基接种支原体标准菌株的培养鉴定结果相同。
3 讨论
由于各种支原体UU/MH培养基配方、原料和工艺等不同，培养基的生化成份及质量有一定差别。法国生物梅里埃Mycoplasma IST培养基比常规培养基多10余种成分，除特殊的复合营养增强剂、bio-Myotone、马血清和4种抗生素外，在一般成分上，Mycoplasma IST与常规培养基相比：尿素、氯化钠较低；精氨酸、葡萄糖和酚红较高。培养基改良中，采用了进口的蛋白胨、酵母提取物、复合营养增强剂及抗生素等原料。常规制备的牛心消化液含大量钾离子，若用35%(V/V)的牛心消化液配制[1，3]，培养基中钾离子浓度高出梅里埃试剂1倍以上。笔者在消化新鲜牛心前增设一个除溶血液的步骤，除去约50%的钾离子。用低钾牛心消化液、蛋白胨和新生小牛血清替代了生物梅里埃的bio-Myotone,bio-Trypcase和马血清。
, http://www.100md.com
常规支原体UU/MH培养基抑菌剂多为青霉素，其检测临床标本中有较高比例的细菌混浊生长现象。细菌生长既干扰了结果判断，又竞争性地消耗培养液的营养成分影响结果的真实性。自制改良UU/MH培养基同Mycoplasma IST一样，加有3种抗生素和1种抗真菌制剂。据报道[4]，有多种抑菌剂组合模式。我们经过验证试验选定了与Mycoplasma IST符合率最高的一种模式。对于极少数耐药菌引起的培养液混浊情况，我们在标本有效保存时间内再次接种或转种，过滤除菌后进行培养鉴定。
自制改良培养基成品外观和接种UU、MH标准菌株及临床阳性标本的指示时间和显橙/红色程度与Mycoplasma IST相同。常规培养基成品外观颜色及支原体阳性显色与Mycoplasma IST相差较大，因无复合营养增强剂，部分支原体阳性显色时间延迟，有的为阴性结果。自制改良UU/MH液体培养基宜在0℃以下保存。若4℃保存，培养基的营养成分及抑菌剂活性损失程度较大。Mycoplasma IST将不稳定组分制成冻干品，很好地保存了培养基的有效成分。
, 百拇医药
(本研究得到广州市皮肤病防治研究所费实主任、曹文苓医师大力支持，谨此志谢)
参考文献
1 李影林，主编.中华医学检验全书.北京：人民卫生出版社，1997.1132～1134
2 Clegg A, Passey M, Yoannes M, et al. High rates of genital mycoplasma infection in the hihglands of Papua New Guinea determined both by cultrue and by a commercial detection kit. J Clin Microbiol, 1997,35(1):197
3 吴移谋，余敏君，尹卫国.从临床标本中定量检测泌尿生殖道支原体耐药性的研究.中华医学检验杂志，1998，21(6)：335
4 Fiacco V, Miller MJ, Carney E, et al. Comparison of media for isolation of ureaplasma urealyticum and genital Mycoplasma species. J Clin Microbiology, 1984,20(5):862, 百拇医药