支气管哮喘患者纤维支气管镜检查肉眼观察与气道炎症的相关研究
作者：张 伟 王随照 钟南山
单位：张 伟 广东省人民医院 核医学科；王随照 血液科 510080；钟南山 广州呼吸疾病研究所 510120
关键词：支气管哮喘；气道炎症；Dahl计分
广东医学990506摘要：目的 通过分析支气管哮喘病人临床表现与纤维支气管镜检查肉眼观察指标和气道粘膜的炎性细胞的关系，以了解肉眼观察指标评价哮喘气道炎症的准确性。方法 采用Dahl肉眼评分系统对受试对象气道进行积分，钳取气道粘膜组织，利用HE染色结合免疫组化染色的方法计数气道粘膜的炎性细胞，然后比较Dahl计分、气道粘膜炎性细胞计数和临床病情分级三者之间的相关性。结果 ①哮喘组Dahl积分为7.35±0.88，明显高于对照组1.06±0.36(P<0.05)，哮喘组Dahl积分与病情程度呈正相关(r=0.73，P<0.05)；②哮喘组气道粘膜嗜酸性粒细胞和淋巴细胞均明显高于对照组(P<0.05)；③哮喘组气道粘膜EG2阳性细胞数明显高于对照组，并且EG2阳性细胞数与病情程度相关(r=0.65，P<0.05)；④本实验中未发现哮喘组Dahl积分与炎性细胞计数有显著相关性。结论 对哮喘病人气道的肉眼评价较为宏观，是一个判断哮喘病情的较好的辅助指标，但还不能准确反映其气道粘膜的炎症。
, 百拇医药
Study on the relationship between airway macroscopic evaluation and mucus cytology in asthmatic patients
Zhang Wei, Wang Suizhao, Zhong Nanshan.
Department of Nuclear Medicine, Guangdong Provincial People′s Hospital, Guangzhou 510080
Abstract Objective To study the characteristic of airway inflammation in macroscopic aspect from asthmatic patients, the relationship between visual aspect and mucosal cytology were evaluated.Methods After the visual scoring of airway inflammation by Dahl endoscopic scoring system through fiberoptic bronchoscopy, the mucosal biopsies were performed and used for HE histochemical staining and EG2 immunohistochemical staining to calculate the inflammational cells. The significance between asthmatic group and control group was compared. The relationship among Dahl scoring, inflammational cell counts of airway mucus, and clinical grades were analyzed.Results The Dalh scoring in asthmatic group was 7.35±0.88, which was higher significantly than that in control group 1.06±0.36 (P<0.05). The Dahl scoring in asthmatic group was correlated with the clinical grades (r=0.73，P<0.05). The number of eosinophils in airway mucus from asthmatic group was much higher than that from control group (P<0.05), and the number of eosinophils in airway mucus from asthmatic group was correlated with clinical grades (r=0.65，P<0.05).Conclusion Using a visual scoring in asthmatic patients is a kind of objective macroscopic inflammatory parameter, which might represent a useful indicator of the severity of asthma.
, 百拇医药
Key words Bronchial asthma Airway inflammation Dahl score
支气管哮喘的基本病理特征是气道慢性非特异性炎症。研究表明，哮喘病人支气管肺泡灌洗液和气道粘膜中炎性细胞数增加，炎性细胞与哮喘临床症状有明显相关性[1～3]，并且哮喘气道的宏观观察指标与临床症状也存在一定的相关性[1，2]，本文拟在比较利用Dahl[4]肉眼评分系统，研究肉眼宏观观察与气道粘膜炎性细胞以及与临床表现的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料 将受试对象分为两组，哮喘组B组：10例，男性7例，女性3例，平均年龄33±3.4岁，诊断参照1997年中华医学会推荐的支气管哮喘诊断标准，病情按照非急性发作期进行分级[5]。根据NHLBI提出纤维支气管镜检查哮喘病人的指南，本实验选择临床分级在1～3级的病人；非哮喘对照组A组：8例，男4例，女4例，平均年龄34±2.5岁，大部分是肺内局部阴影需作纤维支气管镜检查的非哮喘患者。所有受试对象实验前2个月内未用皮质激素，支气管镜检查的前一天进行肺通气功能测定和组织胺吸入支气管激发试验(FEV1<预计值60%时，改作支气管扩张剂吸入试验)。详细情况见表1。
, 百拇医药
表1 纤维支气管镜检查的哮喘组病人基本情况表 序号
年龄
(岁)
性别
FEV1占
预计值%
PD20FEV1
(μmol组胺)
病情
分级
1
18
, 百拇医药
F
85
7.8
1
2
52
F
109
7.8
2
3
47
F
106
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7.8
3
4
38
F
77
0.12
3
5
27
M
126
0.24
3
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6
25
F
105
1.96
1
7
38
M
103
0.24
2
8
25
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M
68
0.98
3
9
30
F
97
3.91
1
10
30
F
63
, 百拇医药
0.98
2
±s
33±3.4
93.9±6.3
3.18±1.1
1.2 纤维支气管镜检查前准备 ①受试者检查当天早晨空腹；②术前半小时口服安定2.5 mg，阿托品0.3mg；③术前给予5%利多卡因2 mL加0.5%舒喘灵0.5～1.0 mL混合后雾化吸入；④2%利多卡因局部麻醉咽喉部，麻黄素和2%利多卡因处理鼻腔；⑤术中给予2～4 L/min氧气吸入，监测SaO2、心率；⑥固定地选择一位富有经验的医师(病情分析和纤维支气管镜操作是不同的检查者，相互双盲)。
, 百拇医药
1.3 样本的处理 按操作常规进行纤维支气管镜检查(PENTAX p-30型)，经声门后，对气管和支气管进行肉眼评分，然后在右上叶嵴钳取2块粘膜组织，放入1%多聚甲醛中固定。固定好的组织块酒精梯度脱水、透明处理、浸蜡和石蜡包埋后，连续切3张片(4 μm/张)，第1张片用HE染色，其余用链霉素抗生物素-过氧化酶连接法免疫组化技术进行染色。
1.4 链霉素抗生素-过氧化酶连接法(SP) 免疫组化大致过程(SP试剂盒，Dako公司)：石蜡包埋的组织切片经脱蜡、水化、漂洗和用微波修复抗原法修复抗原后，依次加入过氧化物酶阻断剂、非免疫动物血清、第2和第3张片分别加入PBS和抗EG2单抗(羊抗入EG2单克隆抗体，浓度1∶5，Pharmingen公司)、生物素标记的第2抗体、链霉素亲和素-连接氧化物酶、DAB显色，苏木素染色，加抗EG2单抗的玻片再经伊红染色；DAB显色，阳性反应呈棕褐色，加抗EG2单抗的玻片经伊红染色，阳性反应呈棕红色颗粒。
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1.5 数据处理 采用SPSS软件处理，数据表示为±s，两组间均数比较采用LSD检验，相关分析采用Spearman等级相关分析。
2 结果
2.1 Dahl评分 哮喘组Dahl积分为7.35±0.88，明显高于对照组1.06±0.36(P<0.05)，并且哮喘组Dahl积分与病情程度呈正相关(r=0.73，P<0.05)，见图1。
2.2 两组气道粘膜炎性细胞数及EG2阳性细胞数 详见表2。EG2阳性细胞数与病情程度显著相关(r=0.65，P<0.05)。
图1 哮喘组纤支镜检查Dahl积分与病情的关系
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(Spearman等级相关r=0.73，P<0.05。
X轴代表病情分级，Y轴代表Dahl积分)
表2 对照组与哮喘组支气管粘膜活检组织炎性细胞数以及EG2
阳性细胞数(炎性细胞计数表示为：基底膜下 个/mm2) 组别
总细胞数
×103
EG+2细胞
×103
嗜酸粒细胞
, 百拇医药
×103
淋巴细胞
×103
巨噬细胞
×103
中性粒细胞
×103
A组(n=8)
1.38±0.41
0.08±0.02
0.19±0.10
, 百拇医药 0.58±0.45
0.61±0.54
0.27±0.13
B组(n=10)
8.70±1.73*
0.89±0.30*
1.79±0.70*
3.63±1.34*
2.52±0.50*
0.93±0.32*
, 百拇医药
注：两组间比较 *P<0.053 讨论
哮喘的气道炎症病理主要表现为上皮脱屑、大量炎性细胞浸润、毛细血管扩张和组织充血水肿等。50年代初有学者肉眼观察到哮喘气道粘膜的炎症情况，并试图作客观的评价，90年代早期Godard[1]报道了气道炎症肉眼评分与Aas临床症状评分之间有一定的相关性，但是Aas临床评分需要综合评价1 a以上的哮喘症状，而且计分繁杂，不利于在临床的推广应用。本实验选用Dahl等[4]报道的评分标准，临床评价参考1997年中华医学会推荐的标准，简单易计算并能够综合长期和(或)短期的症状。结果提示：哮喘病人的Dahl积分明显高于非哮喘组，并且Dahl积分与临床积分之间存在明显相关性。该结果与1993年Vyve等[2]的研究结果相同。但是本研究中，所采用的客观评价气道粘膜肉眼观察计分和临床计分系统的指标与Godard、Vyve采用的均有不同；Vyve用过度分泌、过度充血、水肿和易脆性等为指标，临床评分仍沿用Aas标准。本研究进一步证实肉眼观察气道粘膜的变化对判断哮喘病情轻重有一定的使用价值。
, 百拇医药
哮喘气道的慢性炎症由肥大细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞等参与形成，哮喘病人的BAL和气道粘膜组织中嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等明显增加[1～4]，Laitinen等[3]认为哮喘病人气道粘膜活检组织的主要优点之一既真正反映了气道炎症的确切部位，并且，哮喘炎性细胞的活化状态与哮喘的临床症状关系密切。嗜酸性粒细胞是支气管哮喘气道炎症形成和维持的主要效应细胞，通过释放具有细胞毒作用的蛋白颗粒如ECP、MBP和炎性介质等引起气道上皮脱屑、气道反应性增高和气道平滑肌收缩等，EG2是抗ECP的抗体，通过识别ECP的18 Kda反映活化分泌状态的嗜酸性粒细胞，研究表明过敏性和内源性哮喘气道EG2细胞计数能够较好地反映哮喘的病情程度[6]。本实验也发现EG2计数与哮喘的病情存在显著正相关，未发现Dahl积分与FEV1、PD20和EG2细胞之间有显著相关性。本研究利用中华医学会推荐的标准，证实了肉眼评价能够较好地反映哮喘病情的严重程度，是一个重要的判断临床病情的辅助指标，但是肉眼观察气道炎症仍有其一定的局限性。
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参考文献
1 Godard P, Chanez P, Horst V, et al. Description and validation of an endoscopic score to assess airway inflammation in asthmatic patients (Abstract). Am Rev Respirs Dis, 1990, 141:501A
2 Vyve TV, Chanez P, Lacoste JY, et al. Assessment of airway inflammtion in asthmatic patients by visual endoscopic scoring systems. Eur Respir J, 1993,6:1116
3 Laitinen A, Laetinen LA, Virtanen IT. Bronchil Biopsies. In: Asthma. Edited by Barnes PJ, Grunstein MM, Leff AR, et al. Lippincott Raven Publishers: Philadelphia, 1997. 209～223
, http://www.100md.com
4 Dahl RB, Venge P. Bronchoalveolar lavage studies. Eur Respir Rev, 1991,1(4):272
5 支气管哮喘防治指南，支气管哮喘的定义、诊断、治疗、疗效判断标准及教育和管理方案.中华结核和呼吸杂志，1997，20(10)：261
6 Azzawi M, Bradley B, Jeffery PK, et al. Identification of activated T lymphocytes and eosinophils in bronchial biopsies in stable atopic asthma. Am Rev Respir Dis, 1990, 142:1407, 百拇医药
单位：张 伟 广东省人民医院 核医学科；王随照 血液科 510080；钟南山 广州呼吸疾病研究所 510120
关键词：支气管哮喘；气道炎症；Dahl计分
广东医学990506摘要：目的 通过分析支气管哮喘病人临床表现与纤维支气管镜检查肉眼观察指标和气道粘膜的炎性细胞的关系，以了解肉眼观察指标评价哮喘气道炎症的准确性。方法 采用Dahl肉眼评分系统对受试对象气道进行积分，钳取气道粘膜组织，利用HE染色结合免疫组化染色的方法计数气道粘膜的炎性细胞，然后比较Dahl计分、气道粘膜炎性细胞计数和临床病情分级三者之间的相关性。结果 ①哮喘组Dahl积分为7.35±0.88，明显高于对照组1.06±0.36(P<0.05)，哮喘组Dahl积分与病情程度呈正相关(r=0.73，P<0.05)；②哮喘组气道粘膜嗜酸性粒细胞和淋巴细胞均明显高于对照组(P<0.05)；③哮喘组气道粘膜EG2阳性细胞数明显高于对照组，并且EG2阳性细胞数与病情程度相关(r=0.65，P<0.05)；④本实验中未发现哮喘组Dahl积分与炎性细胞计数有显著相关性。结论 对哮喘病人气道的肉眼评价较为宏观，是一个判断哮喘病情的较好的辅助指标，但还不能准确反映其气道粘膜的炎症。
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Study on the relationship between airway macroscopic evaluation and mucus cytology in asthmatic patients
Zhang Wei, Wang Suizhao, Zhong Nanshan.
Department of Nuclear Medicine, Guangdong Provincial People′s Hospital, Guangzhou 510080
Abstract Objective To study the characteristic of airway inflammation in macroscopic aspect from asthmatic patients, the relationship between visual aspect and mucosal cytology were evaluated.Methods After the visual scoring of airway inflammation by Dahl endoscopic scoring system through fiberoptic bronchoscopy, the mucosal biopsies were performed and used for HE histochemical staining and EG2 immunohistochemical staining to calculate the inflammational cells. The significance between asthmatic group and control group was compared. The relationship among Dahl scoring, inflammational cell counts of airway mucus, and clinical grades were analyzed.Results The Dalh scoring in asthmatic group was 7.35±0.88, which was higher significantly than that in control group 1.06±0.36 (P<0.05). The Dahl scoring in asthmatic group was correlated with the clinical grades (r=0.73，P<0.05). The number of eosinophils in airway mucus from asthmatic group was much higher than that from control group (P<0.05), and the number of eosinophils in airway mucus from asthmatic group was correlated with clinical grades (r=0.65，P<0.05).Conclusion Using a visual scoring in asthmatic patients is a kind of objective macroscopic inflammatory parameter, which might represent a useful indicator of the severity of asthma.
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Key words Bronchial asthma Airway inflammation Dahl score
支气管哮喘的基本病理特征是气道慢性非特异性炎症。研究表明，哮喘病人支气管肺泡灌洗液和气道粘膜中炎性细胞数增加，炎性细胞与哮喘临床症状有明显相关性[1～3]，并且哮喘气道的宏观观察指标与临床症状也存在一定的相关性[1，2]，本文拟在比较利用Dahl[4]肉眼评分系统，研究肉眼宏观观察与气道粘膜炎性细胞以及与临床表现的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料 将受试对象分为两组，哮喘组B组：10例，男性7例，女性3例，平均年龄33±3.4岁，诊断参照1997年中华医学会推荐的支气管哮喘诊断标准，病情按照非急性发作期进行分级[5]。根据NHLBI提出纤维支气管镜检查哮喘病人的指南，本实验选择临床分级在1～3级的病人；非哮喘对照组A组：8例，男4例，女4例，平均年龄34±2.5岁，大部分是肺内局部阴影需作纤维支气管镜检查的非哮喘患者。所有受试对象实验前2个月内未用皮质激素，支气管镜检查的前一天进行肺通气功能测定和组织胺吸入支气管激发试验(FEV1<预计值60%时，改作支气管扩张剂吸入试验)。详细情况见表1。
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表1 纤维支气管镜检查的哮喘组病人基本情况表 序号
年龄
(岁)
性别
FEV1占
预计值%
PD20FEV1
(μmol组胺)
病情
分级
1
18
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33±3.4
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1.2 纤维支气管镜检查前准备 ①受试者检查当天早晨空腹；②术前半小时口服安定2.5 mg，阿托品0.3mg；③术前给予5%利多卡因2 mL加0.5%舒喘灵0.5～1.0 mL混合后雾化吸入；④2%利多卡因局部麻醉咽喉部，麻黄素和2%利多卡因处理鼻腔；⑤术中给予2～4 L/min氧气吸入，监测SaO2、心率；⑥固定地选择一位富有经验的医师(病情分析和纤维支气管镜操作是不同的检查者，相互双盲)。
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1.3 样本的处理 按操作常规进行纤维支气管镜检查(PENTAX p-30型)，经声门后，对气管和支气管进行肉眼评分，然后在右上叶嵴钳取2块粘膜组织，放入1%多聚甲醛中固定。固定好的组织块酒精梯度脱水、透明处理、浸蜡和石蜡包埋后，连续切3张片(4 μm/张)，第1张片用HE染色，其余用链霉素抗生物素-过氧化酶连接法免疫组化技术进行染色。
1.4 链霉素抗生素-过氧化酶连接法(SP) 免疫组化大致过程(SP试剂盒，Dako公司)：石蜡包埋的组织切片经脱蜡、水化、漂洗和用微波修复抗原法修复抗原后，依次加入过氧化物酶阻断剂、非免疫动物血清、第2和第3张片分别加入PBS和抗EG2单抗(羊抗入EG2单克隆抗体，浓度1∶5，Pharmingen公司)、生物素标记的第2抗体、链霉素亲和素-连接氧化物酶、DAB显色，苏木素染色，加抗EG2单抗的玻片再经伊红染色；DAB显色，阳性反应呈棕褐色，加抗EG2单抗的玻片经伊红染色，阳性反应呈棕红色颗粒。
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1.5 数据处理 采用SPSS软件处理，数据表示为±s，两组间均数比较采用LSD检验，相关分析采用Spearman等级相关分析。
2 结果
2.1 Dahl评分 哮喘组Dahl积分为7.35±0.88，明显高于对照组1.06±0.36(P<0.05)，并且哮喘组Dahl积分与病情程度呈正相关(r=0.73，P<0.05)，见图1。
2.2 两组气道粘膜炎性细胞数及EG2阳性细胞数 详见表2。EG2阳性细胞数与病情程度显著相关(r=0.65，P<0.05)。
图1 哮喘组纤支镜检查Dahl积分与病情的关系
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(Spearman等级相关r=0.73，P<0.05。
X轴代表病情分级，Y轴代表Dahl积分)
表2 对照组与哮喘组支气管粘膜活检组织炎性细胞数以及EG2
阳性细胞数(炎性细胞计数表示为：基底膜下 个/mm2) 组别
总细胞数
×103
EG+2细胞
×103
嗜酸粒细胞
, 百拇医药
×103
淋巴细胞
×103
巨噬细胞
×103
中性粒细胞
×103
A组(n=8)
1.38±0.41
0.08±0.02
0.19±0.10
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0.61±0.54
0.27±0.13
B组(n=10)
8.70±1.73*
0.89±0.30*
1.79±0.70*
3.63±1.34*
2.52±0.50*
0.93±0.32*
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注：两组间比较 *P<0.053 讨论
哮喘的气道炎症病理主要表现为上皮脱屑、大量炎性细胞浸润、毛细血管扩张和组织充血水肿等。50年代初有学者肉眼观察到哮喘气道粘膜的炎症情况，并试图作客观的评价，90年代早期Godard[1]报道了气道炎症肉眼评分与Aas临床症状评分之间有一定的相关性，但是Aas临床评分需要综合评价1 a以上的哮喘症状，而且计分繁杂，不利于在临床的推广应用。本实验选用Dahl等[4]报道的评分标准，临床评价参考1997年中华医学会推荐的标准，简单易计算并能够综合长期和(或)短期的症状。结果提示：哮喘病人的Dahl积分明显高于非哮喘组，并且Dahl积分与临床积分之间存在明显相关性。该结果与1993年Vyve等[2]的研究结果相同。但是本研究中，所采用的客观评价气道粘膜肉眼观察计分和临床计分系统的指标与Godard、Vyve采用的均有不同；Vyve用过度分泌、过度充血、水肿和易脆性等为指标，临床评分仍沿用Aas标准。本研究进一步证实肉眼观察气道粘膜的变化对判断哮喘病情轻重有一定的使用价值。
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哮喘气道的慢性炎症由肥大细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞等参与形成，哮喘病人的BAL和气道粘膜组织中嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等明显增加[1～4]，Laitinen等[3]认为哮喘病人气道粘膜活检组织的主要优点之一既真正反映了气道炎症的确切部位，并且，哮喘炎性细胞的活化状态与哮喘的临床症状关系密切。嗜酸性粒细胞是支气管哮喘气道炎症形成和维持的主要效应细胞，通过释放具有细胞毒作用的蛋白颗粒如ECP、MBP和炎性介质等引起气道上皮脱屑、气道反应性增高和气道平滑肌收缩等，EG2是抗ECP的抗体，通过识别ECP的18 Kda反映活化分泌状态的嗜酸性粒细胞，研究表明过敏性和内源性哮喘气道EG2细胞计数能够较好地反映哮喘的病情程度[6]。本实验也发现EG2计数与哮喘的病情存在显著正相关，未发现Dahl积分与FEV1、PD20和EG2细胞之间有显著相关性。本研究利用中华医学会推荐的标准，证实了肉眼评价能够较好地反映哮喘病情的严重程度，是一个重要的判断临床病情的辅助指标，但是肉眼观察气道炎症仍有其一定的局限性。
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参考文献
1 Godard P, Chanez P, Horst V, et al. Description and validation of an endoscopic score to assess airway inflammation in asthmatic patients (Abstract). Am Rev Respirs Dis, 1990, 141:501A
2 Vyve TV, Chanez P, Lacoste JY, et al. Assessment of airway inflammtion in asthmatic patients by visual endoscopic scoring systems. Eur Respir J, 1993,6:1116
3 Laitinen A, Laetinen LA, Virtanen IT. Bronchil Biopsies. In: Asthma. Edited by Barnes PJ, Grunstein MM, Leff AR, et al. Lippincott Raven Publishers: Philadelphia, 1997. 209～223
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4 Dahl RB, Venge P. Bronchoalveolar lavage studies. Eur Respir Rev, 1991,1(4):272
5 支气管哮喘防治指南，支气管哮喘的定义、诊断、治疗、疗效判断标准及教育和管理方案.中华结核和呼吸杂志，1997，20(10)：261
6 Azzawi M, Bradley B, Jeffery PK, et al. Identification of activated T lymphocytes and eosinophils in bronchial biopsies in stable atopic asthma. Am Rev Respir Dis, 1990, 142:1407, 百拇医药