重复PCR指纹技术用于鲍曼不动杆菌基因分型
作者：夏云 张玉洪 余显书 陈宏础
单位：重庆医科大学附一院检验科
关键词：鲍曼不动杆菌；聚合酶链反应；医院感染
临床检验杂志990518 Acinetobacter baumannii(鲍曼不动杆菌)属条件致病菌，近年来随激素及抗生素的广泛应用，所致的医院感染显著增多，特别容易造成重症监护病房(ICU)的暴发流行[1]。建立一种快速、准确的分型方法对于流行病学研究及感染的控制有重要意义。重复PCR指纹技术具有简便、快速、分辨力强的特点[2]。我们采用该法对29株鲍曼不动杆菌作分型研究取得满意效果。
1 材料与方法
1.1 菌株的收集与鉴定 所有菌株均分离自1998年3～7月我院临床各科送检的痰液、脓液、眼分泌物及吸痰清洁液，经ATB细菌鉴定系统鉴定为鲍曼不动杆菌(ID>91.0%)。
, http://www.100md.com
1.2 细菌DNA提取 挑取单个菌落于Eppendorf管中，用生理盐水洗涤1次，加Chex 100液200 μl，混匀，煮沸10分钟，离心取上清液作为模板。
1.3 引物合成 采用与肠杆菌科细菌重复基因保守序列互补的寡核苷酸作上下游引物[3]。引物序列为ERI C1 3′-CACTTAGGGGTCCTCGAATGTA-5′，ERI C2 5′AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′。
1.4 PCR方法 50 μl反应体系中含10×PCR通用缓冲液，dNTP 200 μmol/L，氯化镁1.5 mmol/L，模板5 μl，Taq酶1 U，94°C 3分钟变性后，设94°C 45 s，53°C 45 s，72°C 60 s，35个循环后72°C延伸5 min，产物用3 g/dl琼脂糖电泳，EB染色。
1.5 结果观察 两人各自独立观察结果，电泳条带数量及位置相同者划为同一基因型。
, 百拇医药
2 结果
2.1 本次研究共分离出29株鲍曼不动杆菌，重复PCR指纹技术作基因分型共有5种不同的基因型(见图1)。其中基因型A 19株，占65.5%，基因型B 4株，占13.8%，基因型C 1株，占3.4%，基因型D 1株，占3.4%，基因型E 4株，占13.8%，表明基因型A为优势型。
1 2 3 4 5 6 7
1，6，7，基因型A 2，基因型E
3，基因型B4，基因型C
5，基因型D
*分离自—病人的吸痰清结液
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图1 29株鲍曼不动杆菌重复PCR指纹分型结果
2.2 流行病学调查发现，从肺科ICU分离的15株菌均为A型，表明该型细菌为引起此次肺科ICU鲍曼不动杆菌感染暴发流行的菌株，而其它基因型的菌株则为散发菌株。
2.3 进一步调查发现，从肺科ICU一名病人的吸痰清洁液中分离出一株鲍曼不动杆菌，基因型为A型(图中7)，提示肺科ICU存在鲍曼不动杆菌的交叉污染，可能是导致此次流行的原因。立即对该病房采取相应的消毒措施后，随后四个月未见有新的鲍曼不动杆菌感染病例的发生。
3 讨论
新近研究表明，肠杆菌科细菌基因中存在复制的属间基因保守序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus,ERIC)，不同种细菌ERIC在染色体上的位置不同，用人工合成的与ERIC互补的寡核苷酸为引物扩增细菌的基因组DNA所得到的指纹具有种特异性甚至株特异性，并具有稳定的特点，该技术称为重复PCR指纹(interrepeat PCR fingerprinting)[4]。我们应用该技术对鲍曼不动杆菌作基因分型研究，标本不需经溶菌酶，蛋白酶k消化，酚-氯仿抽提，只需将细菌煮沸裂解即可，一次PCR即能产生特异性指纹，不同批次同一菌株PCR指纹图谱相同，表明该法重复性较高。
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参考文献
1 Bergogae B E,Joly M L.Hospital infection with Acinetobacter spp:an increasing problem.J Hosp Infet,1991,18 suppl A:250
2 Debast S B,Meis J F G M,Melchers W J G,et al.Use of interrepeat PCR fingerprinting to investigate an Acinetobacter baumannii outbreak in an intensive care unit.Scan J Infect Dis,1996,28(2):577
3 Versalovic J,Koeuth T,Lupski J K.Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes.Nucl Acids Res,1991,29(24):6823
4 Lupski J R,Weinstock G M.Short interspersed repetitive DNA sequence in prokargotic genomes.J Bacteriology,1992,174(17):4526
(1998-12-09收稿，1999-06-15修回), http://www.100md.com
单位：重庆医科大学附一院检验科
关键词：鲍曼不动杆菌；聚合酶链反应；医院感染
临床检验杂志990518 Acinetobacter baumannii(鲍曼不动杆菌)属条件致病菌，近年来随激素及抗生素的广泛应用，所致的医院感染显著增多，特别容易造成重症监护病房(ICU)的暴发流行[1]。建立一种快速、准确的分型方法对于流行病学研究及感染的控制有重要意义。重复PCR指纹技术具有简便、快速、分辨力强的特点[2]。我们采用该法对29株鲍曼不动杆菌作分型研究取得满意效果。
1 材料与方法
1.1 菌株的收集与鉴定 所有菌株均分离自1998年3～7月我院临床各科送检的痰液、脓液、眼分泌物及吸痰清洁液，经ATB细菌鉴定系统鉴定为鲍曼不动杆菌(ID>91.0%)。
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1.2 细菌DNA提取 挑取单个菌落于Eppendorf管中，用生理盐水洗涤1次，加Chex 100液200 μl，混匀，煮沸10分钟，离心取上清液作为模板。
1.3 引物合成 采用与肠杆菌科细菌重复基因保守序列互补的寡核苷酸作上下游引物[3]。引物序列为ERI C1 3′-CACTTAGGGGTCCTCGAATGTA-5′，ERI C2 5′AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′。
1.4 PCR方法 50 μl反应体系中含10×PCR通用缓冲液，dNTP 200 μmol/L，氯化镁1.5 mmol/L，模板5 μl，Taq酶1 U，94°C 3分钟变性后，设94°C 45 s，53°C 45 s，72°C 60 s，35个循环后72°C延伸5 min，产物用3 g/dl琼脂糖电泳，EB染色。
1.5 结果观察 两人各自独立观察结果，电泳条带数量及位置相同者划为同一基因型。
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2 结果
2.1 本次研究共分离出29株鲍曼不动杆菌，重复PCR指纹技术作基因分型共有5种不同的基因型(见图1)。其中基因型A 19株，占65.5%，基因型B 4株，占13.8%，基因型C 1株，占3.4%，基因型D 1株，占3.4%，基因型E 4株，占13.8%，表明基因型A为优势型。
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1，6，7，基因型A 2，基因型E
3，基因型B4，基因型C
5，基因型D
*分离自—病人的吸痰清结液
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图1 29株鲍曼不动杆菌重复PCR指纹分型结果
2.2 流行病学调查发现，从肺科ICU分离的15株菌均为A型，表明该型细菌为引起此次肺科ICU鲍曼不动杆菌感染暴发流行的菌株，而其它基因型的菌株则为散发菌株。
2.3 进一步调查发现，从肺科ICU一名病人的吸痰清洁液中分离出一株鲍曼不动杆菌，基因型为A型(图中7)，提示肺科ICU存在鲍曼不动杆菌的交叉污染，可能是导致此次流行的原因。立即对该病房采取相应的消毒措施后，随后四个月未见有新的鲍曼不动杆菌感染病例的发生。
3 讨论
新近研究表明，肠杆菌科细菌基因中存在复制的属间基因保守序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus,ERIC)，不同种细菌ERIC在染色体上的位置不同，用人工合成的与ERIC互补的寡核苷酸为引物扩增细菌的基因组DNA所得到的指纹具有种特异性甚至株特异性，并具有稳定的特点，该技术称为重复PCR指纹(interrepeat PCR fingerprinting)[4]。我们应用该技术对鲍曼不动杆菌作基因分型研究，标本不需经溶菌酶，蛋白酶k消化，酚-氯仿抽提，只需将细菌煮沸裂解即可，一次PCR即能产生特异性指纹，不同批次同一菌株PCR指纹图谱相同，表明该法重复性较高。
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参考文献
1 Bergogae B E,Joly M L.Hospital infection with Acinetobacter spp:an increasing problem.J Hosp Infet,1991,18 suppl A:250
2 Debast S B,Meis J F G M,Melchers W J G,et al.Use of interrepeat PCR fingerprinting to investigate an Acinetobacter baumannii outbreak in an intensive care unit.Scan J Infect Dis,1996,28(2):577
3 Versalovic J,Koeuth T,Lupski J K.Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes.Nucl Acids Res,1991,29(24):6823
4 Lupski J R,Weinstock G M.Short interspersed repetitive DNA sequence in prokargotic genomes.J Bacteriology,1992,174(17):4526
(1998-12-09收稿，1999-06-15修回), http://www.100md.com