血管紧张素Ⅰ转化酶基因多态性检测及其临床意义
作者：穆红 刘明洲 李雪彪
单位：天津市第一中心医院检验中心
关键词：血管紧张素Ⅰ转化酶；基因多态性
血管紧张素 人类血管紧张素Ⅰ转化酶(ACE)基因有三种类型：插入纯合型(II)，缺失纯合型(DD)，插入/缺失杂合型(I/D)[1]。文献报道血清ACE水平与ACE基因型有相关性，并与心血管病及糖尿病早发肾病有关[2]。我们参考有关文献建立了ACE基因多态性检测方法，初步探讨了不同基因型血清ACE水平及与临床的关系。
1 材料与方法
1.1 研究对象 正常组86例，男50例女36例均为体检健康者。冠心病(CAD)组40例，男18例女22例；慢性肾功能不全组(CRF)61例，男38例女24例，均为门诊及住院确诊病人。取空腹静脉血，EDTA-Na2抗凝(1 mg/ml)。
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1.2 方法
1.2.1 模板DNA提取方法如前报道[3]，引物序列参照文献[1]设计合成。正链5'-CTGCAGACCACTCCCATCCTTCT3'，反义链5'-GATGTGGCATCACATTCGTCAGA 3'，dNTP购自北京天象人生物技术公司，Taq-DNA聚合酶为promega产品，血清ACE活性测定试剂盒购自海军总医院，DNA扩增仪MJ-PTC-150为美国基因公司产。PCR体系含10×缓冲液5 μl，二甲亚砜5 μl，dNTPs各200 μmol/L,MgCl2 1 mmol/L，引物各20 pmol，模板8 μl,Taq酶3 U，加双蒸水至50 μl，混匀加矿物油覆盖。PCR条件∶94°C预变性5分钟后按热循环程序94°C 1分钟，58°C 1分钟，72°C 1.5分钟，循环30次，再72°C延伸10分钟。
1.2.2 ACE基因型判断 扩增产物经2 g/dl琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在紫外透射仪下观察仅有490 bp DNA片段者为ACE基因插入纯合型(I/I)，只有190 bp扩增带者为缺失纯合型(D/D)，490 bp和190 bp并存者为插入/缺失杂合型(I/D)(图1)。
, 百拇医药
M：marker 1,4,7,9:ACE I/I基因型
2，3：ACE D/D基因型 5，6，8：ACE I/D基因型
图1 ACE基因型电泳图
1.2.3 血清ACE活性按试剂盒说明测定。
1.2.4 统计方法 基因型及等位基因比较用χ2检验。ACE活性比较用t检验。
2 结果
2.1 正常人群和疾病组ACE基因型及等位基因分布频率见表1。CAD组DD型基因和D等位基因频率明显高于正常组和CRF组，P<0.05。
表1 ACE基因型与等位基因分布频率
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组 别
n
基因型例数(%)
等位基因频率例数(%)
II
ID
DD
I
D
正常组
冠心病组
肾功能不全组
86
, 百拇医药
40
61
22(25.58)
7(17.50)
23(37.70)
47(54.65)
22(55.0)
29(47.54)
17(19.76)
11(27.50)
9(14.75)
69(71.88)
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36(45.0)
79(62.7)
27(28.12)
44(55.0)
47(37.3)
CAD组与正常组比较：χ2＝6.21，P<0.025 CAD组与CRF组比较：χ2＝4.94，P<0.05
2.2 血清ACE水平与基因型关系依次为DD型>ID型>II型。三型之间均有显著差异，P<0.05，见表2。 表2 ACE基因型及血清ACE水平
基因型
n
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ACE水平(
±s U/L)
II
ID
DD
10
30
16
186.3±84.6
254.2±102.8
349.9±159.4
, 百拇医药
II与ID比较：t＝2.03，P<0.05 ID与DD比较：t＝2.48，P<0.05
3 讨论
体内ACE可将血管紧张素Ⅰ(AgⅠ)转化成AgⅡ，使缓激肽灭活，促使血管收缩，醛固酮分泌，刺激心肌和血管平滑肌增生[2]。文献报道[4～6]在肥厚型心肌病和心肌梗死病人中DD型基因和D等位基因频率明显高于对照组，作者提出DD型基因是心血管病和2型糖尿病早发肾病及视网膜病变的潜在危险因素。本研究结果与文献报道相似，DD型血清ACE水平显著高于II型，CAD组中DD型基因和D等位基因明显高于其它两组。因致心血管病的危险因素诸多，血清ACE水平升高的机制尚不清，我们认为ACE基因型与心血管病的关系尚待进一步探讨。本文运用一对特异引物扩增ACE基因内一段Alu序列的插入/缺失多态性，操作简捷，结果易判断，适合临床实验室应用。
参考文献
, http://www.100md.com
1 Rigat B,Hubert C,Corvol P,et al.PCR detection of the insertion/deletion polymorphism of the human angiotensin converting enzyme gene.Nucleic Acid Res,1992,20:1433
2 项坤三.血管紧张素Ⅰ转换酶基因与糖尿病，心血管疾病的关系.中华内分泌代谢杂志，1997，13(1)：48
3 穆红，刘明洲，邓芝惠.聚合酶链反应限制性内切酶消化法监测人载脂蛋白E基因多态性.临床检验杂志，1998，16(2)：75
4 Marre M,Bernadet P,Gallois Y,et al.Relationships between angiotensin I converting enzyme gene polymorphism,plasma levels,and diabetic retinal and renal complications.Diabetes,1994,43:384
5 Iwai N,Ohmichi N,Nakamura Y,et al.DD genotype of the angiotensin-converting enzyme gene is a risk factor for left ventriclar hypertrophy,Circulation,1994,25(1):2622
6 陆林，于全德，况少青，等.血管紧张素转化酶基因的插入/缺失多态性与心肌梗塞关系的研究.中华心血管病杂志，1997，25(1)：33
(1998-08-03收稿，1999-05-27修回), http://www.100md.com
单位：天津市第一中心医院检验中心
关键词：血管紧张素Ⅰ转化酶；基因多态性
血管紧张素 人类血管紧张素Ⅰ转化酶(ACE)基因有三种类型：插入纯合型(II)，缺失纯合型(DD)，插入/缺失杂合型(I/D)[1]。文献报道血清ACE水平与ACE基因型有相关性，并与心血管病及糖尿病早发肾病有关[2]。我们参考有关文献建立了ACE基因多态性检测方法，初步探讨了不同基因型血清ACE水平及与临床的关系。
1 材料与方法
1.1 研究对象 正常组86例，男50例女36例均为体检健康者。冠心病(CAD)组40例，男18例女22例；慢性肾功能不全组(CRF)61例，男38例女24例，均为门诊及住院确诊病人。取空腹静脉血，EDTA-Na2抗凝(1 mg/ml)。
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1.2 方法
1.2.1 模板DNA提取方法如前报道[3]，引物序列参照文献[1]设计合成。正链5'-CTGCAGACCACTCCCATCCTTCT3'，反义链5'-GATGTGGCATCACATTCGTCAGA 3'，dNTP购自北京天象人生物技术公司，Taq-DNA聚合酶为promega产品，血清ACE活性测定试剂盒购自海军总医院，DNA扩增仪MJ-PTC-150为美国基因公司产。PCR体系含10×缓冲液5 μl，二甲亚砜5 μl，dNTPs各200 μmol/L,MgCl2 1 mmol/L，引物各20 pmol，模板8 μl,Taq酶3 U，加双蒸水至50 μl，混匀加矿物油覆盖。PCR条件∶94°C预变性5分钟后按热循环程序94°C 1分钟，58°C 1分钟，72°C 1.5分钟，循环30次，再72°C延伸10分钟。
1.2.2 ACE基因型判断 扩增产物经2 g/dl琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在紫外透射仪下观察仅有490 bp DNA片段者为ACE基因插入纯合型(I/I)，只有190 bp扩增带者为缺失纯合型(D/D)，490 bp和190 bp并存者为插入/缺失杂合型(I/D)(图1)。
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M：marker 1,4,7,9:ACE I/I基因型
2，3：ACE D/D基因型 5，6，8：ACE I/D基因型
图1 ACE基因型电泳图
1.2.3 血清ACE活性按试剂盒说明测定。
1.2.4 统计方法 基因型及等位基因比较用χ2检验。ACE活性比较用t检验。
2 结果
2.1 正常人群和疾病组ACE基因型及等位基因分布频率见表1。CAD组DD型基因和D等位基因频率明显高于正常组和CRF组，P<0.05。
表1 ACE基因型与等位基因分布频率
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组 别
n
基因型例数(%)
等位基因频率例数(%)
II
ID
DD
I
D
正常组
冠心病组
肾功能不全组
86
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40
61
22(25.58)
7(17.50)
23(37.70)
47(54.65)
22(55.0)
29(47.54)
17(19.76)
11(27.50)
9(14.75)
69(71.88)
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36(45.0)
79(62.7)
27(28.12)
44(55.0)
47(37.3)
CAD组与正常组比较：χ2＝6.21，P<0.025 CAD组与CRF组比较：χ2＝4.94，P<0.05
2.2 血清ACE水平与基因型关系依次为DD型>ID型>II型。三型之间均有显著差异，P<0.05，见表2。 表2 ACE基因型及血清ACE水平
基因型
n
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ACE水平(
±s U/L)II
ID
DD
10
30
16
186.3±84.6
254.2±102.8
349.9±159.4
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II与ID比较：t＝2.03，P<0.05 ID与DD比较：t＝2.48，P<0.05
3 讨论
体内ACE可将血管紧张素Ⅰ(AgⅠ)转化成AgⅡ，使缓激肽灭活，促使血管收缩，醛固酮分泌，刺激心肌和血管平滑肌增生[2]。文献报道[4～6]在肥厚型心肌病和心肌梗死病人中DD型基因和D等位基因频率明显高于对照组，作者提出DD型基因是心血管病和2型糖尿病早发肾病及视网膜病变的潜在危险因素。本研究结果与文献报道相似，DD型血清ACE水平显著高于II型，CAD组中DD型基因和D等位基因明显高于其它两组。因致心血管病的危险因素诸多，血清ACE水平升高的机制尚不清，我们认为ACE基因型与心血管病的关系尚待进一步探讨。本文运用一对特异引物扩增ACE基因内一段Alu序列的插入/缺失多态性，操作简捷，结果易判断，适合临床实验室应用。
参考文献
, http://www.100md.com
1 Rigat B,Hubert C,Corvol P,et al.PCR detection of the insertion/deletion polymorphism of the human angiotensin converting enzyme gene.Nucleic Acid Res,1992,20:1433
2 项坤三.血管紧张素Ⅰ转换酶基因与糖尿病，心血管疾病的关系.中华内分泌代谢杂志，1997，13(1)：48
3 穆红，刘明洲，邓芝惠.聚合酶链反应限制性内切酶消化法监测人载脂蛋白E基因多态性.临床检验杂志，1998，16(2)：75
4 Marre M,Bernadet P,Gallois Y,et al.Relationships between angiotensin I converting enzyme gene polymorphism,plasma levels,and diabetic retinal and renal complications.Diabetes,1994,43:384
5 Iwai N,Ohmichi N,Nakamura Y,et al.DD genotype of the angiotensin-converting enzyme gene is a risk factor for left ventriclar hypertrophy,Circulation,1994,25(1):2622
6 陆林，于全德，况少青，等.血管紧张素转化酶基因的插入/缺失多态性与心肌梗塞关系的研究.中华心血管病杂志，1997，25(1)：33
(1998-08-03收稿，1999-05-27修回), http://www.100md.com