敏感期内、末单眼斜视和剥夺猫视觉系统脑源性神经营养因子表达机理研究
作者：邵立功 郭静秋
单位：100853北京，中国人民解放军总医院眼科(邵立功)；北京医科大学第一医院小儿眼科(郭静秋)
关键词：斜视；剥夺；脑源性神经营养因子；敏感期
摘要 目的观察和研究敏感期内
摘要 目的观察和研究敏感期内、末不同时限单眼斜视(monocular strabismus，MS)和单眼剥夺(monocular deprivation，MD)幼猫视皮质、外侧膝状体的脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)的可塑性变化。从形态学、分子神经生物学角度探讨不同时限MS和MD幼猫视觉系统神经元可塑性变化机理。方法以免疫细胞化学(streptavidin biotin-peroxidae complex,SABC)技术染色和计算机图像分析方法检测了BDNF在正常和敏感期内、末MS和MD组幼猫同侧视皮质、外侧膝状体的变化规律，数据行t-检验处理。结果在视皮质，光镜下BDNF免疫细胞化学染色呈棕褐色，锥体细胞具有较清晰的突触锥形特征。在MS1和MD1组幼猫的视皮质17区IV层BDNF免疫阳性反应及阳性神经元显著减少，与正常组比较具有非常显著差异性(P〈0.01，P〈0.001)，MS2和MD2组与正常组比较无差异性(P>0.05)。在外侧膝状体，光镜下可见正常组眼输入的A、A1和C层三层中均有BDNF免疫阳性反应和阳性神经元存在，并且以A和A1层染色较浓。大、小细胞均着色，在MS1和MD1组幼猫实验眼输入的外侧膝状体相应层BDNF表达的免疫阳性反应深度及阳性神经元数密度减少，与正常组幼猫眼输入的外侧膝状体相应层比较具有非常显著性差异(P〈0.01)，而MS2和MD2组与正常组比较则无差异性(P>0.05))。结论BDNF对敏感期内所致斜视和剥夺更为敏感，可能原因为BDNFmRNA的表达受视觉信息输入，或受视网膜活性调节，它参与神经环路的形成和突触的活性修饰，并在外侧膝状体形成与视皮质特殊连接过程中及视觉信息输入活性依赖的调节上起着更为重要作用。
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Studies on mechanism of gene expression of BDNF in the visual system of kittens within and the end of crucial periods
SHAO Li Gong GUO Jing Qiu
From theDepartment of Ophthalmology,the General Hospital of People's Liberation Army,Beijing 100853,China
Abstract Objective and Methods To investigate the changes and distribution of gene expression of BDNF(Brain Derived Neurotrophic Factor)in the visual system of the experimental groups with immunocytochemistry SABC technique and computer image Analysis method.changes in number density and IOD(immunopositive concentration)of immunopositive neurons of gene expression of BDNF in the layer IV of visual cortex area 17 and the laminas of lateral geniculate nucl us inputs from N,MS1,MD1,MS2 and MD2 eyes were analysed by Computer Image Analysis System.Results Showed that there are immunopositive neurons which appear as brown colour in the layer Ⅰ ,Ⅱ /Ⅲ ， Ⅳ ， V and VI of visual cortex area 17 and the laminas of lateral geniculate nucl us inputs from the experimental eyes BDNF protein of immunopositive cellular number and concentration in the layer IV of visual cortex area 17 and the laminas oflateral geniculate nucl us inputs from the experimental eyes are the most in N group and the lowest in MS1 and MD1 troups.However,N/MS2 and N/MD2 by comparison have not a significant difference.Conclusion BDNF may make an important role in differentiation,development and forming of synapses united each other of visual system.The studies indicated that changes in gene expression and function of BDNF mRNA are affected by visual exp rience.So,visual disturbance and form deprivation may lead to reduction for gene expression of BDNF protein.Therefore,biological function and activity of BDNF may be based on whether inputs from visual information of retina and experimental eyes of retinal activity are normal or not.
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Key words strabismus;deprivation;brain derived neurotrophic factor period;crucial
儿童弱视主要是在小儿视觉发育敏感期内，由于各种影响视觉发育的眼病和/或视环境的不良，使双眼视长期紊乱、视觉系统神经元功能、形态和神经生化机制异常，临床表现有外眼及眼底检查无特殊变化，又不能完全矫正其低视力(≤0.8)、失立体视和形觉障碍等体征[1]。由此可知，单眼斜视(monocular strabismus, MS)和单眼剥夺(monocular deprivation, MD)对婴幼儿童的危害不仅在于影响单眼视力，并且若不在敏感期内及时治疗病人，则由患眼输入的视觉神经系统发生难以逆转的塑性变化，形成立体视盲，这会使得患病儿童将来参加社会工作和择业受到严重影响。弱视动物模型基础研究可为小儿眼科临床弱视防治工作提供参考依据，并较客观地反映了人类弱视形成的特点，具有指导意义。因此，弱视发病机制的基础研究变得更为重要，它是临床眼科防治弱视亟待解决的关键问题。基于这一观点，本项研究拟应用组织学、免疫细胞化学技术对弱视动物模型的视皮质、外侧膝状体的脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)的变化进行观察研究。从形态学、分子神经生物学角度研究探讨不同时限MS和MD动物模型视觉系统三级神经元及其突触可塑性变化的神经生物机理。
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1 材料与方法
1.1 实验动物和试剂 本实验采用实验用纯种虎皮猫共计32只。其中4～6wk龄幼猫24只，10～12wk龄幼猫8只。动物随机分为5组：(1)正常组(normalgroup,N)；(2)单眼斜视Ⅰ组(monocular strabismus1,MS1)；(3)单眼剥夺Ⅰ组(monocular deprivation1,MD1)。上述3组每组8只为4～6wk龄，共计24只；(4)单眼斜视Ⅱ组(MS2)；(5)单眼剥夺Ⅱ组(MD2)。上述两组每组4只为10～12wk龄，共计8只。实验试剂：(1)常用试剂：为市售纯化学分析试剂，由中国军事医学科学院基础医学研究所提供。(2)主要试剂：SABC(streptavidin biotin-peroxidae complex)博士德生物工程公司，正常羊血清和BDNF抗体购自中山公司。仪器：振动切片机、CQ-970型计算机图像分析仪、Nikon双目自动照像显微镜、脑立体定位仪、石蜡切片机。
1.2 实验方法
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1.2.1 单眼斜视和剥夺性弱视动物模型手术制做和饲养单眼斜视组(MS)动物模型手术制作：在微量噻胺酮(compound ketamine)0.1mL . kg-1肌注麻醉下，结膜下注射少量利多卡因(5g . L-1)，沿角膜缘2mm处剪开球结膜并分离找出一眼外直肌切除，然后再彻底分离周围结缔组织及外侧韧带，术后实验眼形成内斜视。手术眼别分别为右眼6只，左眼6只。其中8只眼为4～6wk幼猫(MS1)，4只眼为10～12wk猫(MS2)。
单眼剥夺组(MD)幼猫为剪除眼睑缘周围毛发后，自内眦到外眦剪除上下睑缘各1～1.5mm，皮下及皮肤分层缝合封闭实验眼。MD眼别：右眼6只，左眼6只。敏感期内(4～6wk)8只眼(MD1)，敏感期末4只眼(10～12wk,MD2)。动物的饲养环境是在宽敞饲养室内。N和MS1，MD1，MS2及MD2组实验猫共同在自然光线环境中散放喂养。
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1.2.2 实验动物的灌注固定和取材实验动物在饲养到第16周时，进行MPCEPs检测，电生理实验后分批灌注固定实验猫并快速取材。(1)动物麻醉后行开胸并剪开心包膜，右心室切开放出心血管系统血液，快速切开左心室并经左心室主动脉插管灌注生理盐水500mL冲洗心血管系统，接快灌注4℃冷固定液(4g . L-1多聚甲醛磷酸缓冲液，pH7.2)，再慢灌注1000mL含4g . L-1多聚甲醛，5g . L-1戊二醛和2g . L-1苦味酸的4℃磷酸缓冲溶液(pH7.2)2h。在4℃冰箱放置过夜后，标本块转至150g . L-1蔗糖溶液(PBSpH7.2)中浸泡12h，待标本块下沉后行振动切片;(2)标本取材顺序为：①开颅取脑垂直脑矢状轴切取视皮质组块，部分切片为平行视皮质17区切取免疫组织化学染色后选取IV层组织切片。②冠状切取同侧和对侧外侧膝状体组织。(3)振动切片，组织片厚35～40μm;(4)免疫细胞化学SABC技术处理切片：①切片入PBS缓冲溶液(0.1mol/L，pH7.2)漂洗;②用甲醇加3g . L-1H2O2处理切片15～30min(室温)封闭内源性过氧化酶的活性;③2g . L-1TritonX-100液中10min(室温);④以正常羊血清孵育15～25min(室温)，以封闭组织中的非特异性抗原;⑤滴加兔抗人第一抗体(1∶500)BDNF抗体，湿盒内孵育1.5h(室温)然后在4℃冰箱过夜;⑥PBS缓冲液充分冲洗，以去除切片上非特异吸附抗体;⑦再经3g . L-1TritonX-100/PBs漂洗2min后，依次加入生物素标记的羊抗兔1gG(1∶200)和SABC复合物(1∶100)中孵育30min(室温);⑧PBS缓冲液漂洗;⑨用DAB-H2O2液显色。试剂组成为DAB50mg，0.05M的TB100mL，300g . L-1H2O230～40μL;⑩将呈色后的组织切片置于流水中，以便终止呈色反应;{11}酒精梯度脱水，Hemo-De透明，DPX封固;{12}光镜下观察计算机图像分析。
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1.2.3 计算机图像分析免疫细胞化学(1)免疫细胞化学结果分析程序：参照细胞构筑学特点，将N.MS1.MD1，MS2和MD2组内每只幼猫同侧视皮质和外侧膝状体组织连续切片各5张，在QTM970型图像分析仪的10×40倍光镜视野下，测量其BDNF蛋白在上述解剖部位表达的单位面积内的积分光密度(IOD/Area)及数密度(Numberical Density)，数密度用：免疫阳性细胞数/视野内面积表示。每张切片选取5个视野。(2)统计学分析处理：所有数值均以均数±标准差(x±s)表示。应用美国SAS公司SAS6.04版PC统计软件包在P586/133Hz计算机上进行t检验处理。
2 结果
BDNF与NGF及NT-3同属NGF家族具有同源性及相互交叉的分子生物学特性[3，4]。BDNF与NGF及NT-3的不同点是它的分布广，BDNF免疫阳性反应遍及视皮质全层及外侧膝状体A、A1和C层。在视皮质，光镜下BDNF免疫组织化学染色表征呈棕褐色，神经元轴树突触不明显，但在锥体细胞则具有较清晰的突触锥形特征。在MS1和MD1组幼猫的视皮质17区IV层BDNF免疫阳性反应及阳性神经元显著减少，与N组比较具有非常显著差异性(P〈0.01，P〈0.001)，而MS2和MD2组与N组比较无差异性(P〈0.05)。在外侧膝状体，光镜下可见N组幼猫正常眼输入的A、A1和C层3层中均有BDNF免疫阳性反应和BDNF免疫阳性神经元存在，并且以A和A1层免疫染色更浓，大、小细胞均着色，而C层染色较淡，免疫阳性细胞少，这可能是由于视束到达外侧膝状体的终末所致。在MS1和MD1组幼猫实验眼输入的外铡膝状体相应层BDNF表达产物的免疫阳性反应深度及免疫阳性神经元数密度减少，与N组幼猫外侧膝状体相应层比较具有非常显著性差异(P〈0.01)，MS2和MD2组与N组比较无差异性(P>0.05)。
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本实验结果显示了BDNF对敏感期内所致斜视和剥夺更为敏感，其可能原因为BDNFmRNA的表达受视觉信息输入或受视网膜活性调节。
3 讨论
脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)在中枢神经系统发育早期具有高表达特征。BDNF有使CNS(中枢神经系统)神经元分化、增殖及成熟的作用，并且BDNF与NGF和NT-3通过高亲和力受体有交互作用[5，6]。本实验结果敏感期内所致的单眼斜视和剥夺幼猫其视觉系统三级神经元的BDNF免疫阳反应浓度和免疫阳性细胞数密度与正常对照组比显著下降，与Schoups等[7]实验结果相符。Schoups等发现经黑暗处置或通过注射河豚鱼毒素(TTX)阻滞视网膜输入至视皮质过程可使BDNFmRNA表达降到50%。而敏感期内单眼剥夺也可使视皮质BDNFmRNA表达显著减少[8]。在CNS正常情况下，BDNF可达每克脑组织含1～10mg . g-1脑组织，BDNF和它的受体trkB广泛地存在于视觉神经系统，其活性主要依赖视网膜的功能是否正常，即由视信息的输入调节，实验证明在黑暗中处置的鼠在曝光后可引起视皮质的BDNFmRNA表达变化[9]。
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本实验在正常组幼猫可见BDNF反应细胞呈现于整个视路，可以认定BDNF参与视觉系统的全部发育过程。BDNF在视皮质的表达出现于Ⅱ-Ⅲ/Ⅳ、V和VI层，本实验敏感期末单眼斜视及剥夺组猫视觉系统三级神经元及突触的BDNF免疫阳性反应浓度及免疫阳性细胞数密度与正常对照组比较未见显著性变化(P>0.05)，可见BDNF在敏感期末所受影响甚小。
Hallbook等[10]认为BDNF在视觉系统的表达，其基础水平受视网膜活性的调制。BDNF在视皮质的免疫反应分布，各家报导不一。有人认为BDNF蛋白主要存在于锥体细胞集中的V层。BDNF对视皮质的塑性效应具有重要意义，BDNF参与并影响视皮质的发育及外侧膝状体神经元轴突的分离。在发育中BDNF可能是完成LGN神经元突触发育的重要因子[11]。BDNF和其受体trkB出现在视皮质水平主要存在于锥体细胞和GABA能神经元，有些谷氨酸能神经元也有BDNF和trkB的复合表达[12]，BDNF在锥体细胞的表达可调制GABA能神经元神经递质和神经肽的产生。BDNF对单眼剥夺动物视皮质眼优势柱可塑性变化的显著效应是由于它直接作用于视皮质神经元，BDNF可调节突触后的GABA、Glu和Ach的释放[13]。在单眼剥夺幼猫，外源性提供BDNF可以引起眼优势漂移向剥夺眼，在视皮质注入GABA拮抗剂则可再生产眼优势向对侧眼的逆转[14]。以本实验结果看，BDNF对敏感期内动物视觉系统的发育有着重要作用。外源提供BDNF可拮抗视觉发育敏感期内的斜视和剥夺效应，同理视环境的紊乱也制约着内源性BDNF的表达及其受体trkB的活性及数量变化。如果在视觉发育的敏感期内，早期人为外源提供BDNF并矫正视环境系系乱(如矫正斜视及剥夺)有希望可逆转其斜视和剥夺所产生的弱视效应。
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参考文献：
1 邵立功.弱视猫视皮质17区神经元c-fos基因表达特性的研究.中华眼科杂志1993;29(6)：366-369.
2 郭静秋.全国小儿眼科新进展会议汇编资料(讲演报告).1993年10月.
3 Rodriguez TA,Dechant G, Barde YA.Binding of brain derived neurotrophic factor to nerve growth factor receptor.Neuron 1990;4:487- 492.
4 Barbacid M.The trk family of neurotrophin receptors.J Neurobiol 1994;25:1386- 1403.
, http://www.100md.com 5 Maisonpierre PC,Belluscio L.,Squinto S,et al.Neurotrophin- 3;aneurotrophic factor related to NGF and BDNF.Science 1990;247:1446- 1451.
6 Maisonpierre PC,Belluscio L,Friedman B.,et al.NT- 3,BDNF and NGF in the developing rat nervous system:parallel as well as reciprocal patterns of expression.Neuron 1990;5:501- 509.
7 Schoups AA,Elliot RC,Friedman WJ,et al.NGF anf BDNF are differentially modulated by visual experience in the developing geniculo- cortical pathway.Dev.Brain Res 1995;86:326- 334.
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8 Bozzi Y,Pizzorusso T,Rossi FM,et al.Monocular deprivation decreases the expression of messenger RNA for brain- derived neurotrophic factor in the rat visual cortex.Neurosci 1995;69:1133- 1144.
9 Castren E,Zafra F,Thoenen H,et al.Light regulates expression of brain derived neurotrophic factor mRNA in rat visual cortex. Proc Natl Acad Sci 1992;89:9444- 9448.
10 Hallbook F, Carri NG.BDNF mRNA expression is regulated by neuronal activityin the avain visual system.Soc Neurosci Abstr 1995;21:125.
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11 Allendorfer KL,Cabelli RJ,Escandon E,et al.Regulation of neurotrophin receptors during the maturation of the mammalian visual system.J Neurosci 1994;14:1795- 1811.
12 Kokaia ZJ,Bengzon M,Matsis M.et al.Coexpression of meurotrophins and their receptors in neurons of the central nervous system.Proc Natl Acad Sci 1993;90:6711- 6715.
13 Stoop R,and Poo MM.Potentiation of transmitter release by ciliary neurotrophic factor requires somatic signalling.Science 1995;267:695- 698.
14 Galuskei RAW,Kim DS, Casten E,et al.Chronic infusion of brain derived neurotrophic factor induces paradoxical ocular dominance shifts in the kitten visual cortex.Soc Neurosci Abstr 1994;21:136- 139.
收稿1999-02-10, 百拇医药
单位：100853北京，中国人民解放军总医院眼科(邵立功)；北京医科大学第一医院小儿眼科(郭静秋)
关键词：斜视；剥夺；脑源性神经营养因子；敏感期
摘要 目的观察和研究敏感期内
摘要 目的观察和研究敏感期内、末不同时限单眼斜视(monocular strabismus，MS)和单眼剥夺(monocular deprivation，MD)幼猫视皮质、外侧膝状体的脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)的可塑性变化。从形态学、分子神经生物学角度探讨不同时限MS和MD幼猫视觉系统神经元可塑性变化机理。方法以免疫细胞化学(streptavidin biotin-peroxidae complex,SABC)技术染色和计算机图像分析方法检测了BDNF在正常和敏感期内、末MS和MD组幼猫同侧视皮质、外侧膝状体的变化规律，数据行t-检验处理。结果在视皮质，光镜下BDNF免疫细胞化学染色呈棕褐色，锥体细胞具有较清晰的突触锥形特征。在MS1和MD1组幼猫的视皮质17区IV层BDNF免疫阳性反应及阳性神经元显著减少，与正常组比较具有非常显著差异性(P〈0.01，P〈0.001)，MS2和MD2组与正常组比较无差异性(P>0.05)。在外侧膝状体，光镜下可见正常组眼输入的A、A1和C层三层中均有BDNF免疫阳性反应和阳性神经元存在，并且以A和A1层染色较浓。大、小细胞均着色，在MS1和MD1组幼猫实验眼输入的外侧膝状体相应层BDNF表达的免疫阳性反应深度及阳性神经元数密度减少，与正常组幼猫眼输入的外侧膝状体相应层比较具有非常显著性差异(P〈0.01)，而MS2和MD2组与正常组比较则无差异性(P>0.05))。结论BDNF对敏感期内所致斜视和剥夺更为敏感，可能原因为BDNFmRNA的表达受视觉信息输入，或受视网膜活性调节，它参与神经环路的形成和突触的活性修饰，并在外侧膝状体形成与视皮质特殊连接过程中及视觉信息输入活性依赖的调节上起着更为重要作用。
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Studies on mechanism of gene expression of BDNF in the visual system of kittens within and the end of crucial periods
SHAO Li Gong GUO Jing Qiu
From theDepartment of Ophthalmology,the General Hospital of People's Liberation Army,Beijing 100853,China
Abstract Objective and Methods To investigate the changes and distribution of gene expression of BDNF(Brain Derived Neurotrophic Factor)in the visual system of the experimental groups with immunocytochemistry SABC technique and computer image Analysis method.changes in number density and IOD(immunopositive concentration)of immunopositive neurons of gene expression of BDNF in the layer IV of visual cortex area 17 and the laminas of lateral geniculate nucl us inputs from N,MS1,MD1,MS2 and MD2 eyes were analysed by Computer Image Analysis System.Results Showed that there are immunopositive neurons which appear as brown colour in the layer Ⅰ ,Ⅱ /Ⅲ ， Ⅳ ， V and VI of visual cortex area 17 and the laminas of lateral geniculate nucl us inputs from the experimental eyes BDNF protein of immunopositive cellular number and concentration in the layer IV of visual cortex area 17 and the laminas oflateral geniculate nucl us inputs from the experimental eyes are the most in N group and the lowest in MS1 and MD1 troups.However,N/MS2 and N/MD2 by comparison have not a significant difference.Conclusion BDNF may make an important role in differentiation,development and forming of synapses united each other of visual system.The studies indicated that changes in gene expression and function of BDNF mRNA are affected by visual exp rience.So,visual disturbance and form deprivation may lead to reduction for gene expression of BDNF protein.Therefore,biological function and activity of BDNF may be based on whether inputs from visual information of retina and experimental eyes of retinal activity are normal or not.
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Key words strabismus;deprivation;brain derived neurotrophic factor period;crucial
儿童弱视主要是在小儿视觉发育敏感期内，由于各种影响视觉发育的眼病和/或视环境的不良，使双眼视长期紊乱、视觉系统神经元功能、形态和神经生化机制异常，临床表现有外眼及眼底检查无特殊变化，又不能完全矫正其低视力(≤0.8)、失立体视和形觉障碍等体征[1]。由此可知，单眼斜视(monocular strabismus, MS)和单眼剥夺(monocular deprivation, MD)对婴幼儿童的危害不仅在于影响单眼视力，并且若不在敏感期内及时治疗病人，则由患眼输入的视觉神经系统发生难以逆转的塑性变化，形成立体视盲，这会使得患病儿童将来参加社会工作和择业受到严重影响。弱视动物模型基础研究可为小儿眼科临床弱视防治工作提供参考依据，并较客观地反映了人类弱视形成的特点，具有指导意义。因此，弱视发病机制的基础研究变得更为重要，它是临床眼科防治弱视亟待解决的关键问题。基于这一观点，本项研究拟应用组织学、免疫细胞化学技术对弱视动物模型的视皮质、外侧膝状体的脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)的变化进行观察研究。从形态学、分子神经生物学角度研究探讨不同时限MS和MD动物模型视觉系统三级神经元及其突触可塑性变化的神经生物机理。
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1 材料与方法
1.1 实验动物和试剂 本实验采用实验用纯种虎皮猫共计32只。其中4～6wk龄幼猫24只，10～12wk龄幼猫8只。动物随机分为5组：(1)正常组(normalgroup,N)；(2)单眼斜视Ⅰ组(monocular strabismus1,MS1)；(3)单眼剥夺Ⅰ组(monocular deprivation1,MD1)。上述3组每组8只为4～6wk龄，共计24只；(4)单眼斜视Ⅱ组(MS2)；(5)单眼剥夺Ⅱ组(MD2)。上述两组每组4只为10～12wk龄，共计8只。实验试剂：(1)常用试剂：为市售纯化学分析试剂，由中国军事医学科学院基础医学研究所提供。(2)主要试剂：SABC(streptavidin biotin-peroxidae complex)博士德生物工程公司，正常羊血清和BDNF抗体购自中山公司。仪器：振动切片机、CQ-970型计算机图像分析仪、Nikon双目自动照像显微镜、脑立体定位仪、石蜡切片机。
1.2 实验方法
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1.2.1 单眼斜视和剥夺性弱视动物模型手术制做和饲养单眼斜视组(MS)动物模型手术制作：在微量噻胺酮(compound ketamine)0.1mL . kg-1肌注麻醉下，结膜下注射少量利多卡因(5g . L-1)，沿角膜缘2mm处剪开球结膜并分离找出一眼外直肌切除，然后再彻底分离周围结缔组织及外侧韧带，术后实验眼形成内斜视。手术眼别分别为右眼6只，左眼6只。其中8只眼为4～6wk幼猫(MS1)，4只眼为10～12wk猫(MS2)。
单眼剥夺组(MD)幼猫为剪除眼睑缘周围毛发后，自内眦到外眦剪除上下睑缘各1～1.5mm，皮下及皮肤分层缝合封闭实验眼。MD眼别：右眼6只，左眼6只。敏感期内(4～6wk)8只眼(MD1)，敏感期末4只眼(10～12wk,MD2)。动物的饲养环境是在宽敞饲养室内。N和MS1，MD1，MS2及MD2组实验猫共同在自然光线环境中散放喂养。
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1.2.2 实验动物的灌注固定和取材实验动物在饲养到第16周时，进行MPCEPs检测，电生理实验后分批灌注固定实验猫并快速取材。(1)动物麻醉后行开胸并剪开心包膜，右心室切开放出心血管系统血液，快速切开左心室并经左心室主动脉插管灌注生理盐水500mL冲洗心血管系统，接快灌注4℃冷固定液(4g . L-1多聚甲醛磷酸缓冲液，pH7.2)，再慢灌注1000mL含4g . L-1多聚甲醛，5g . L-1戊二醛和2g . L-1苦味酸的4℃磷酸缓冲溶液(pH7.2)2h。在4℃冰箱放置过夜后，标本块转至150g . L-1蔗糖溶液(PBSpH7.2)中浸泡12h，待标本块下沉后行振动切片;(2)标本取材顺序为：①开颅取脑垂直脑矢状轴切取视皮质组块，部分切片为平行视皮质17区切取免疫组织化学染色后选取IV层组织切片。②冠状切取同侧和对侧外侧膝状体组织。(3)振动切片，组织片厚35～40μm;(4)免疫细胞化学SABC技术处理切片：①切片入PBS缓冲溶液(0.1mol/L，pH7.2)漂洗;②用甲醇加3g . L-1H2O2处理切片15～30min(室温)封闭内源性过氧化酶的活性;③2g . L-1TritonX-100液中10min(室温);④以正常羊血清孵育15～25min(室温)，以封闭组织中的非特异性抗原;⑤滴加兔抗人第一抗体(1∶500)BDNF抗体，湿盒内孵育1.5h(室温)然后在4℃冰箱过夜;⑥PBS缓冲液充分冲洗，以去除切片上非特异吸附抗体;⑦再经3g . L-1TritonX-100/PBs漂洗2min后，依次加入生物素标记的羊抗兔1gG(1∶200)和SABC复合物(1∶100)中孵育30min(室温);⑧PBS缓冲液漂洗;⑨用DAB-H2O2液显色。试剂组成为DAB50mg，0.05M的TB100mL，300g . L-1H2O230～40μL;⑩将呈色后的组织切片置于流水中，以便终止呈色反应;{11}酒精梯度脱水，Hemo-De透明，DPX封固;{12}光镜下观察计算机图像分析。
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1.2.3 计算机图像分析免疫细胞化学(1)免疫细胞化学结果分析程序：参照细胞构筑学特点，将N.MS1.MD1，MS2和MD2组内每只幼猫同侧视皮质和外侧膝状体组织连续切片各5张，在QTM970型图像分析仪的10×40倍光镜视野下，测量其BDNF蛋白在上述解剖部位表达的单位面积内的积分光密度(IOD/Area)及数密度(Numberical Density)，数密度用：免疫阳性细胞数/视野内面积表示。每张切片选取5个视野。(2)统计学分析处理：所有数值均以均数±标准差(x±s)表示。应用美国SAS公司SAS6.04版PC统计软件包在P586/133Hz计算机上进行t检验处理。
2 结果
BDNF与NGF及NT-3同属NGF家族具有同源性及相互交叉的分子生物学特性[3，4]。BDNF与NGF及NT-3的不同点是它的分布广，BDNF免疫阳性反应遍及视皮质全层及外侧膝状体A、A1和C层。在视皮质，光镜下BDNF免疫组织化学染色表征呈棕褐色，神经元轴树突触不明显，但在锥体细胞则具有较清晰的突触锥形特征。在MS1和MD1组幼猫的视皮质17区IV层BDNF免疫阳性反应及阳性神经元显著减少，与N组比较具有非常显著差异性(P〈0.01，P〈0.001)，而MS2和MD2组与N组比较无差异性(P〈0.05)。在外侧膝状体，光镜下可见N组幼猫正常眼输入的A、A1和C层3层中均有BDNF免疫阳性反应和BDNF免疫阳性神经元存在，并且以A和A1层免疫染色更浓，大、小细胞均着色，而C层染色较淡，免疫阳性细胞少，这可能是由于视束到达外侧膝状体的终末所致。在MS1和MD1组幼猫实验眼输入的外铡膝状体相应层BDNF表达产物的免疫阳性反应深度及免疫阳性神经元数密度减少，与N组幼猫外侧膝状体相应层比较具有非常显著性差异(P〈0.01)，MS2和MD2组与N组比较无差异性(P>0.05)。
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本实验结果显示了BDNF对敏感期内所致斜视和剥夺更为敏感，其可能原因为BDNFmRNA的表达受视觉信息输入或受视网膜活性调节。
3 讨论
脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)在中枢神经系统发育早期具有高表达特征。BDNF有使CNS(中枢神经系统)神经元分化、增殖及成熟的作用，并且BDNF与NGF和NT-3通过高亲和力受体有交互作用[5，6]。本实验结果敏感期内所致的单眼斜视和剥夺幼猫其视觉系统三级神经元的BDNF免疫阳反应浓度和免疫阳性细胞数密度与正常对照组比显著下降，与Schoups等[7]实验结果相符。Schoups等发现经黑暗处置或通过注射河豚鱼毒素(TTX)阻滞视网膜输入至视皮质过程可使BDNFmRNA表达降到50%。而敏感期内单眼剥夺也可使视皮质BDNFmRNA表达显著减少[8]。在CNS正常情况下，BDNF可达每克脑组织含1～10mg . g-1脑组织，BDNF和它的受体trkB广泛地存在于视觉神经系统，其活性主要依赖视网膜的功能是否正常，即由视信息的输入调节，实验证明在黑暗中处置的鼠在曝光后可引起视皮质的BDNFmRNA表达变化[9]。
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本实验在正常组幼猫可见BDNF反应细胞呈现于整个视路，可以认定BDNF参与视觉系统的全部发育过程。BDNF在视皮质的表达出现于Ⅱ-Ⅲ/Ⅳ、V和VI层，本实验敏感期末单眼斜视及剥夺组猫视觉系统三级神经元及突触的BDNF免疫阳性反应浓度及免疫阳性细胞数密度与正常对照组比较未见显著性变化(P>0.05)，可见BDNF在敏感期末所受影响甚小。
Hallbook等[10]认为BDNF在视觉系统的表达，其基础水平受视网膜活性的调制。BDNF在视皮质的免疫反应分布，各家报导不一。有人认为BDNF蛋白主要存在于锥体细胞集中的V层。BDNF对视皮质的塑性效应具有重要意义，BDNF参与并影响视皮质的发育及外侧膝状体神经元轴突的分离。在发育中BDNF可能是完成LGN神经元突触发育的重要因子[11]。BDNF和其受体trkB出现在视皮质水平主要存在于锥体细胞和GABA能神经元，有些谷氨酸能神经元也有BDNF和trkB的复合表达[12]，BDNF在锥体细胞的表达可调制GABA能神经元神经递质和神经肽的产生。BDNF对单眼剥夺动物视皮质眼优势柱可塑性变化的显著效应是由于它直接作用于视皮质神经元，BDNF可调节突触后的GABA、Glu和Ach的释放[13]。在单眼剥夺幼猫，外源性提供BDNF可以引起眼优势漂移向剥夺眼，在视皮质注入GABA拮抗剂则可再生产眼优势向对侧眼的逆转[14]。以本实验结果看，BDNF对敏感期内动物视觉系统的发育有着重要作用。外源提供BDNF可拮抗视觉发育敏感期内的斜视和剥夺效应，同理视环境的紊乱也制约着内源性BDNF的表达及其受体trkB的活性及数量变化。如果在视觉发育的敏感期内，早期人为外源提供BDNF并矫正视环境系系乱(如矫正斜视及剥夺)有希望可逆转其斜视和剥夺所产生的弱视效应。
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参考文献：
1 邵立功.弱视猫视皮质17区神经元c-fos基因表达特性的研究.中华眼科杂志1993;29(6)：366-369.
2 郭静秋.全国小儿眼科新进展会议汇编资料(讲演报告).1993年10月.
3 Rodriguez TA,Dechant G, Barde YA.Binding of brain derived neurotrophic factor to nerve growth factor receptor.Neuron 1990;4:487- 492.
4 Barbacid M.The trk family of neurotrophin receptors.J Neurobiol 1994;25:1386- 1403.
, http://www.100md.com 5 Maisonpierre PC,Belluscio L.,Squinto S,et al.Neurotrophin- 3;aneurotrophic factor related to NGF and BDNF.Science 1990;247:1446- 1451.
6 Maisonpierre PC,Belluscio L,Friedman B.,et al.NT- 3,BDNF and NGF in the developing rat nervous system:parallel as well as reciprocal patterns of expression.Neuron 1990;5:501- 509.
7 Schoups AA,Elliot RC,Friedman WJ,et al.NGF anf BDNF are differentially modulated by visual experience in the developing geniculo- cortical pathway.Dev.Brain Res 1995;86:326- 334.
, 百拇医药
8 Bozzi Y,Pizzorusso T,Rossi FM,et al.Monocular deprivation decreases the expression of messenger RNA for brain- derived neurotrophic factor in the rat visual cortex.Neurosci 1995;69:1133- 1144.
9 Castren E,Zafra F,Thoenen H,et al.Light regulates expression of brain derived neurotrophic factor mRNA in rat visual cortex. Proc Natl Acad Sci 1992;89:9444- 9448.
10 Hallbook F, Carri NG.BDNF mRNA expression is regulated by neuronal activityin the avain visual system.Soc Neurosci Abstr 1995;21:125.
, 百拇医药
11 Allendorfer KL,Cabelli RJ,Escandon E,et al.Regulation of neurotrophin receptors during the maturation of the mammalian visual system.J Neurosci 1994;14:1795- 1811.
12 Kokaia ZJ,Bengzon M,Matsis M.et al.Coexpression of meurotrophins and their receptors in neurons of the central nervous system.Proc Natl Acad Sci 1993;90:6711- 6715.
13 Stoop R,and Poo MM.Potentiation of transmitter release by ciliary neurotrophic factor requires somatic signalling.Science 1995;267:695- 698.
14 Galuskei RAW,Kim DS, Casten E,et al.Chronic infusion of brain derived neurotrophic factor induces paradoxical ocular dominance shifts in the kitten visual cortex.Soc Neurosci Abstr 1994;21:136- 139.
收稿1999-02-10, 百拇医药