深低温长期保存角膜穿透性角膜移植术临床报告△
作者：刘红山 龚向明 张壮喜 李献华 季健萍 秦勇 冯宗榴
单位：510110广州市，广州市眼库中山医科大学眼科中心
关键词：角膜；深低温保存；移植
眼科新进展990504
摘要 目的评价深低温长期保存角膜在穿透性角膜移植术中的应有价值。方法应用深低温长期保存21～1230d的供眼角膜行穿透性角膜移植术34例(35眼)。结果术后随访2～30(平均7.3±4.0)mo，角膜植片透明率达82.9%，部分患者视力改善，角膜植片内皮细胞密度达903～3083.7个 . mm-2(平均1641.8±599.3个 . mm-2)。结论深低温长期保存角膜具有较好的临床应用价值。
, 百拇医药
Penetrating keratoplasty with long-term cryopreserved corneas
LIU Hong Shan GONG Xiang Ming ZHANG Zhuang Xi LI Xian Hua JI Jian Ping QIN Yong FENG Zong Liu
From the Guangzhou Eye Bank, Guangzhou 510110,China
Abstract Objective To evaluate the effectiveness of penetrating keratoplasty with long- term cryopreserved corneas.Methods 34 cases(35 eyes)were performed penetrating keratoplasty with human cadaver corneas long- term cryopreserved 21 to 1 230 days,mean 20. 5± 11. 6 months.Results After following- up of 2 to 30 (mean 7.3± 4. 0)months,corneal graft transparent rate was 82.9% ,the visual acuity was improved significantly,graft endothelial density was 903 to 3 083.7(mean1 641.8± 599.3)个 . mm- 2， Conclusion Long- term cryopreserved cornea is very useful on penetrating keratoplasty.
, 百拇医药
Key words cornea cryopreservation transplantatoin
Capella等报导深低温长期保存角膜临床穿透性角膜移植术取得成功30a来，深低温保存角膜技术越来越受到眼科工作者的肯定，我国邱孝芝、王传富、刘金刚等在此领域也进行了探讨，获得了满意的结果[1～4]。我们应用程序冷冻系统对深低温保存技术进行了系列观察，取得了满意疗效，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 供眼角膜及其降温前处理供体年龄6～30a,平均25.9±11.6a。分别于死后0.5～3(1.29±1.12)h摘除眼球，0～4℃湿房保存1.5～20(8.77±3.40)h，然后切取带1～2mm巩膜环的角巩膜帽，置0～4℃角膜冷冻保护剂中按照Capella等人的四步法平衡，各步平衡液的组成成分见表1。
, 百拇医药
以上每步平衡10min，第Ⅲ步结束后，将角膜移入装有2mL第Ⅳ步冷冻保护剂的无菌壁薄而均匀的青霉素瓶中，10min后立即进行程序降温。
表1 四步法平衡液组成
保护剂成分
第Ⅰ步
第Ⅱ步
第Ⅲ步
第Ⅳ步
蔗糖(G/V)
2.5%
5%
7.5%
, 百拇医药
10%
二甲基亚砜(V/V)
2%
4%
6%
7.5%
20%白蛋白(V/V)
98%
96%
94%
92.5%
1.2 角膜的降温及保存平衡后的角膜迅速移入微机监控的程序冷冻系统，同时另设一个装有同样冷冻保护剂的对照瓶，将角膜标本温度探子插入保护剂中，以测定标本中的温度变化。降温时，以角膜保护剂的温度作标准，首先等待温度稳定于4℃，再以2℃ . min-1降温至-30℃，这期间当温度降至-8℃～-14℃，可见3℃～7℃的温度回升的释放热曲线，然后以5℃ . min-1降温至-80℃，其后立即将瓶子浸入液氮中长期保存。本组所用角膜分别保存了21～1230d，平均20.5±11.6mo。
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1.3 受眼条件34例(35眼)接受治疗的患者，男18例，女16例；年龄分别为11—79(平均41.3±18.5)a。其中，感染性角膜溃疡合并穿孔21例，陈旧性角膜瘢痕12例，角膜营养不良1例(2眼)。中取出装有角膜的瓶子，放入55℃～60℃的温水中轻轻摆动，角膜周围仅存薄冰时，将角膜移入预冷的20%白蛋白中保存备用。术中取出角膜，轻轻吸除表面的血清白蛋白，于内皮面涂适量的透明质酸钠，应用真空角膜环钻由内皮面制作角膜植片，除2例为7mm×11mm的扇形角膜植片外其余为7.5～10mm的圆形植片。另外，对于细菌、真菌感染病例术中应用抗生素或抗真菌药物行眼内冲洗，其它操作同常规穿透性角膜移植术。
1.5 术后处理及观察常规单眼绷带包扎，每日换药1次，d2或d3以局部用药为主，药物选用皮质类固醇激素及抗生素或/和抗真菌或抗病毒类，1mo以后加用环胞霉素A局部应用；术手3～6mo拆除角膜缝线，2mo后应用角膜内皮细胞分析仪(EM-1000和EM-1020)进行植片光学区角膜内皮细胞分析。
, 百拇医药
2 结果
术后分别随访2～30(平均7.3±4.0)mo，得出如下结果：
2.1 角膜植片的透明性 35眼中，29眼保持角膜植片透明，透明率82.9%.术后早期除个别患者植片轻度水肿外，多数保持良好透明性。
2.2 视力变化 手术前后视力变化见表2。手术前后盲目率比较有显著性差异(χ2=16.9697，P〈0.0001)。35眼中16眼视力无改变，其中弱视3眼，白内障或者瞳孔膜闭7眼，青光眼性视神经萎缩2眼，感染控制不良3眼，植片感染1眼。
表2 手术前后变化
无光感
-0.05
-0.1
, 百拇医药
-0.3
盲目率(%)
术前
32
2
1
91.4
术后
16
2
7
10
45.7
, 百拇医药 2.3 角膜植片内皮细胞分析 术后2～9(平均4.9±2.7)mo随机选出13眼进行角膜内皮细胞分析，共分析细胞数136±38个，平均面积为679.0±227.1μm2,平均密度为1641.8±599.3个 . mm-2，面积标准为251.2±116.8μm2，差变异系数为35.9%±7.2%，最小细胞为209.7±57.9μm2，最大细胞1708.3±716.8μm2，五角、六角、七角细胞率分别为21.6%±4.1%、55.6%±7.5%和18.3%±3.7%.平均角膜内皮细胞密度分别为903～3083.72个 . mm-2。
2.4 移植免疫排斥反应 35眼中6眼发生内皮型移植免疫排斥反应，发生率17.1%，发生时间为术手1.5mo1眼、4mo2眼、6mo2眼、2a1眼。
2.5 角膜植片失败的原因 35眼中，29眼植片透明、7眼植片混浊。失败原因分别为术前眼内感染术后控制不良3眼、植片感染1眼、不能控制的高眼压1眼、移植免疫排斥反应植片失败1眼，严重角膜内皮损伤1眼。
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3 讨论
3.1 角膜病是我国主要致盲性眼病之一，角膜移植术是角膜盲复明治疗的主要手段，在我国供眼角膜收集比较困难，偶尔取到供眼又不能及时找到手术对象，时间的延长导致角膜内皮细胞活性丧失。深低温长期保存角膜技术可最长时间地延长库存角膜内皮细胞活性，可最大程度地满足供眼贮存的需要，并可为角膜病医生提供按计划和需要进行角膜移植术的条件，是眼库长期保存角膜活性的理想方法之一。1965年Capella等人创立并报导深低温保存角膜进行角膜移植术30a来，国内外学者在此领域里进行了一些基础和应用研究，并取得了较好的效果，从80年代开始我国邱孝芝、王传富、刘金刚等人也进行了一些深入的研究，取得了满意的效果[2～4]。我们应用控制降温速率理想的微机监控程序冷冻系统成功进行了供眼角膜的程序降温，在降温过程中可随意控制和改变降温的速率，在降温过程中可直接观察冷冻保护剂中的温度变化，是研究深低温保存角膜的理想设备，我们在降温过程中观察到的冷冻保护剂由液相向固相转变时的释放热曲线则是其中的例子，这是缓慢降温、减少冷冻保护剂冰晶形成和促其玻璃化(Vitrification)形成的标志，这在以往国内报道中是不明显的。
, 百拇医药
3.2 我们应用深低温长期保存近2a(最长达41mo)的角膜为34例(35眼)患者成功施行了穿透性角膜移植术，术后植片透明率达82.9%，这与新鲜供眼角膜施行的结果是相近的。术后3～6mo的角膜内皮细胞密度达1641.8个 . mm-2，除2眼因为术后早期发生内皮型移植免疫排斥反应细胞密度在900个 . mm-2以上外，其余均在1000个 . mm-2以上，最高达3083.72个 . mm-2，这与以往同类报道相比有了提高。本组一角膜穿孔患者，穿透性角膜移植术1a进行了白内障囊外摘除术联合后房型人工晶体植入术，术后3mo角膜内皮细胞密度仍有1489.02个 . mm-2。如无意外，相信这样的角膜内皮细胞密度在未来的岁月里足以维持角膜透明。组织学研究发现深低温保存角膜细胞间隙加大，细胞器部分肿胀，提示组织的抗机械性损伤能力下降[5]。以往的报道显示术后早期角膜植片水肿，本组除个别病例外多数保持良好透明性，这可能与术中加强了角膜内皮保护有关。
, 百拇医药
作者简介：刘红山，男，36岁，汉族，中山医科大学眼科研究生毕业，现任广州市眼库主任、广东省视光学会隐形眼镜专业委员会常务委员、广东省视光学会屈光专业委员会常务委员和广东省中西医结合学会眼科专业委员会委员。从事眼科工作15年，在眼部烧伤、角膜病及其角膜移植手术和眼库技术方面有一定成绩。先后发表“角膜上皮移植术联合干燥保存板层角膜移植术治疗陈旧性眼部烧伤”、“角膜移植术治疗角膜穿孔”、“碱性化学伤兔眼模型的实验研究”、“中国正常人角膜内皮细胞的计算机分析”等学术论文10余篇。先后承担广东省和广州市重点科技攻关项目和科技新星项目3项，获得广州市科技进步奖1项。
参考文献：
1 Capella JA.Preservation of viable corneal tissue.Arch Ophthalmol 1965;74:669.
2 邱孝芝.深低温保存角膜的实验研究.中华眼科杂志1987；21：301.
3 王传富.深低温长期保存角膜穿透移植的研究.中华眼科杂志1990；26：17.
4 刘金刚，刘作斌.低温医学.北京:人民卫生出版社1993:24.
5 石珍荣.深低温冷冻保存角膜的超微结构观察.青岛医学院学报1989；25：18.
收稿1999-02-12, 百拇医药
单位：510110广州市，广州市眼库中山医科大学眼科中心
关键词：角膜；深低温保存；移植
眼科新进展990504
摘要 目的评价深低温长期保存角膜在穿透性角膜移植术中的应有价值。方法应用深低温长期保存21～1230d的供眼角膜行穿透性角膜移植术34例(35眼)。结果术后随访2～30(平均7.3±4.0)mo，角膜植片透明率达82.9%，部分患者视力改善，角膜植片内皮细胞密度达903～3083.7个 . mm-2(平均1641.8±599.3个 . mm-2)。结论深低温长期保存角膜具有较好的临床应用价值。
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Penetrating keratoplasty with long-term cryopreserved corneas
LIU Hong Shan GONG Xiang Ming ZHANG Zhuang Xi LI Xian Hua JI Jian Ping QIN Yong FENG Zong Liu
From the Guangzhou Eye Bank, Guangzhou 510110,China
Abstract Objective To evaluate the effectiveness of penetrating keratoplasty with long- term cryopreserved corneas.Methods 34 cases(35 eyes)were performed penetrating keratoplasty with human cadaver corneas long- term cryopreserved 21 to 1 230 days,mean 20. 5± 11. 6 months.Results After following- up of 2 to 30 (mean 7.3± 4. 0)months,corneal graft transparent rate was 82.9% ,the visual acuity was improved significantly,graft endothelial density was 903 to 3 083.7(mean1 641.8± 599.3)个 . mm- 2， Conclusion Long- term cryopreserved cornea is very useful on penetrating keratoplasty.
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Key words cornea cryopreservation transplantatoin
Capella等报导深低温长期保存角膜临床穿透性角膜移植术取得成功30a来，深低温保存角膜技术越来越受到眼科工作者的肯定，我国邱孝芝、王传富、刘金刚等在此领域也进行了探讨，获得了满意的结果[1～4]。我们应用程序冷冻系统对深低温保存技术进行了系列观察，取得了满意疗效，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 供眼角膜及其降温前处理供体年龄6～30a,平均25.9±11.6a。分别于死后0.5～3(1.29±1.12)h摘除眼球，0～4℃湿房保存1.5～20(8.77±3.40)h，然后切取带1～2mm巩膜环的角巩膜帽，置0～4℃角膜冷冻保护剂中按照Capella等人的四步法平衡，各步平衡液的组成成分见表1。
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以上每步平衡10min，第Ⅲ步结束后，将角膜移入装有2mL第Ⅳ步冷冻保护剂的无菌壁薄而均匀的青霉素瓶中，10min后立即进行程序降温。
表1 四步法平衡液组成
保护剂成分
第Ⅰ步
第Ⅱ步
第Ⅲ步
第Ⅳ步
蔗糖(G/V)
2.5%
5%
7.5%
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10%
二甲基亚砜(V/V)
2%
4%
6%
7.5%
20%白蛋白(V/V)
98%
96%
94%
92.5%
1.2 角膜的降温及保存平衡后的角膜迅速移入微机监控的程序冷冻系统，同时另设一个装有同样冷冻保护剂的对照瓶，将角膜标本温度探子插入保护剂中，以测定标本中的温度变化。降温时，以角膜保护剂的温度作标准，首先等待温度稳定于4℃，再以2℃ . min-1降温至-30℃，这期间当温度降至-8℃～-14℃，可见3℃～7℃的温度回升的释放热曲线，然后以5℃ . min-1降温至-80℃，其后立即将瓶子浸入液氮中长期保存。本组所用角膜分别保存了21～1230d，平均20.5±11.6mo。
, http://www.100md.com
1.3 受眼条件34例(35眼)接受治疗的患者，男18例，女16例；年龄分别为11—79(平均41.3±18.5)a。其中，感染性角膜溃疡合并穿孔21例，陈旧性角膜瘢痕12例，角膜营养不良1例(2眼)。中取出装有角膜的瓶子，放入55℃～60℃的温水中轻轻摆动，角膜周围仅存薄冰时，将角膜移入预冷的20%白蛋白中保存备用。术中取出角膜，轻轻吸除表面的血清白蛋白，于内皮面涂适量的透明质酸钠，应用真空角膜环钻由内皮面制作角膜植片，除2例为7mm×11mm的扇形角膜植片外其余为7.5～10mm的圆形植片。另外，对于细菌、真菌感染病例术中应用抗生素或抗真菌药物行眼内冲洗，其它操作同常规穿透性角膜移植术。
1.5 术后处理及观察常规单眼绷带包扎，每日换药1次，d2或d3以局部用药为主，药物选用皮质类固醇激素及抗生素或/和抗真菌或抗病毒类，1mo以后加用环胞霉素A局部应用；术手3～6mo拆除角膜缝线，2mo后应用角膜内皮细胞分析仪(EM-1000和EM-1020)进行植片光学区角膜内皮细胞分析。
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2 结果
术后分别随访2～30(平均7.3±4.0)mo，得出如下结果：
2.1 角膜植片的透明性 35眼中，29眼保持角膜植片透明，透明率82.9%.术后早期除个别患者植片轻度水肿外，多数保持良好透明性。
2.2 视力变化 手术前后视力变化见表2。手术前后盲目率比较有显著性差异(χ2=16.9697，P〈0.0001)。35眼中16眼视力无改变，其中弱视3眼，白内障或者瞳孔膜闭7眼，青光眼性视神经萎缩2眼，感染控制不良3眼，植片感染1眼。
表2 手术前后变化
无光感
-0.05
-0.1
, 百拇医药
-0.3
盲目率(%)
术前
32
2
1
91.4
术后
16
2
7
10
45.7
, 百拇医药 2.3 角膜植片内皮细胞分析 术后2～9(平均4.9±2.7)mo随机选出13眼进行角膜内皮细胞分析，共分析细胞数136±38个，平均面积为679.0±227.1μm2,平均密度为1641.8±599.3个 . mm-2，面积标准为251.2±116.8μm2，差变异系数为35.9%±7.2%，最小细胞为209.7±57.9μm2，最大细胞1708.3±716.8μm2，五角、六角、七角细胞率分别为21.6%±4.1%、55.6%±7.5%和18.3%±3.7%.平均角膜内皮细胞密度分别为903～3083.72个 . mm-2。
2.4 移植免疫排斥反应 35眼中6眼发生内皮型移植免疫排斥反应，发生率17.1%，发生时间为术手1.5mo1眼、4mo2眼、6mo2眼、2a1眼。
2.5 角膜植片失败的原因 35眼中，29眼植片透明、7眼植片混浊。失败原因分别为术前眼内感染术后控制不良3眼、植片感染1眼、不能控制的高眼压1眼、移植免疫排斥反应植片失败1眼，严重角膜内皮损伤1眼。
, http://www.100md.com
3 讨论
3.1 角膜病是我国主要致盲性眼病之一，角膜移植术是角膜盲复明治疗的主要手段，在我国供眼角膜收集比较困难，偶尔取到供眼又不能及时找到手术对象，时间的延长导致角膜内皮细胞活性丧失。深低温长期保存角膜技术可最长时间地延长库存角膜内皮细胞活性，可最大程度地满足供眼贮存的需要，并可为角膜病医生提供按计划和需要进行角膜移植术的条件，是眼库长期保存角膜活性的理想方法之一。1965年Capella等人创立并报导深低温保存角膜进行角膜移植术30a来，国内外学者在此领域里进行了一些基础和应用研究，并取得了较好的效果，从80年代开始我国邱孝芝、王传富、刘金刚等人也进行了一些深入的研究，取得了满意的效果[2～4]。我们应用控制降温速率理想的微机监控程序冷冻系统成功进行了供眼角膜的程序降温，在降温过程中可随意控制和改变降温的速率，在降温过程中可直接观察冷冻保护剂中的温度变化，是研究深低温保存角膜的理想设备，我们在降温过程中观察到的冷冻保护剂由液相向固相转变时的释放热曲线则是其中的例子，这是缓慢降温、减少冷冻保护剂冰晶形成和促其玻璃化(Vitrification)形成的标志，这在以往国内报道中是不明显的。
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3.2 我们应用深低温长期保存近2a(最长达41mo)的角膜为34例(35眼)患者成功施行了穿透性角膜移植术，术后植片透明率达82.9%，这与新鲜供眼角膜施行的结果是相近的。术后3～6mo的角膜内皮细胞密度达1641.8个 . mm-2，除2眼因为术后早期发生内皮型移植免疫排斥反应细胞密度在900个 . mm-2以上外，其余均在1000个 . mm-2以上，最高达3083.72个 . mm-2，这与以往同类报道相比有了提高。本组一角膜穿孔患者，穿透性角膜移植术1a进行了白内障囊外摘除术联合后房型人工晶体植入术，术后3mo角膜内皮细胞密度仍有1489.02个 . mm-2。如无意外，相信这样的角膜内皮细胞密度在未来的岁月里足以维持角膜透明。组织学研究发现深低温保存角膜细胞间隙加大，细胞器部分肿胀，提示组织的抗机械性损伤能力下降[5]。以往的报道显示术后早期角膜植片水肿，本组除个别病例外多数保持良好透明性，这可能与术中加强了角膜内皮保护有关。
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作者简介：刘红山，男，36岁，汉族，中山医科大学眼科研究生毕业，现任广州市眼库主任、广东省视光学会隐形眼镜专业委员会常务委员、广东省视光学会屈光专业委员会常务委员和广东省中西医结合学会眼科专业委员会委员。从事眼科工作15年，在眼部烧伤、角膜病及其角膜移植手术和眼库技术方面有一定成绩。先后发表“角膜上皮移植术联合干燥保存板层角膜移植术治疗陈旧性眼部烧伤”、“角膜移植术治疗角膜穿孔”、“碱性化学伤兔眼模型的实验研究”、“中国正常人角膜内皮细胞的计算机分析”等学术论文10余篇。先后承担广东省和广州市重点科技攻关项目和科技新星项目3项，获得广州市科技进步奖1项。
参考文献：
1 Capella JA.Preservation of viable corneal tissue.Arch Ophthalmol 1965;74:669.
2 邱孝芝.深低温保存角膜的实验研究.中华眼科杂志1987；21：301.
3 王传富.深低温长期保存角膜穿透移植的研究.中华眼科杂志1990；26：17.
4 刘金刚，刘作斌.低温医学.北京:人民卫生出版社1993:24.
5 石珍荣.深低温冷冻保存角膜的超微结构观察.青岛医学院学报1989；25：18.
收稿1999-02-12, 百拇医药