肿瘤患者术后自身肿瘤杀伤活性检测的临床意义
作者：肖文海 朱红梅 翁晓萌
单位：福建三明市第一医院(三明 365000)；肖文海 翁晓萌 生物治疗研究室；朱红梅 检验科
关键词：肿瘤；T淋巴细胞；预后
肿瘤990515 当前，手术治疗仍然是多种肿瘤的首选治疗方案，但术后却有一定比例局部瘤灶的复发和远处转移灶的出现。自身肿瘤杀伤活性(Autologous tumor-killing activity, ATK)是近年来一个新概念[1]，它是指肿瘤患者外周血淋巴细胞对自身肿瘤细胞的杀伤活性。由于ATK测定更接近患者的体内状态，从而能客观地了解患者体内的抗肿瘤免疫功能情况。本研究通过对38例行根治性手术的肿瘤患者进行ATK测定，并经过2年来的临床追踪观察发现，肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群的变化，以及ATK活性的高低与肿瘤患者的预后密切相关，现报道如下。
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临床资料与方法
一、病例选择 38例进行根治性手术的早、中期恶性肿瘤患者，年龄28～67岁，平均43岁，其中胃癌12例，大肠癌8例，肺癌2例，乳腺癌10例，食管癌6例。所有病人术前未经任何治疗，病灶均为原发且全部都有明确的病理诊断。患者手术后均进行临床追踪观察2年以上，将2年内预后良好，未出现复发与转移的25例患者归为非转移组，其余2年内有复发与转移的13例患者归为转移组。
二、实验方法 手术当日取外周血，按常规分离外周血淋巴细胞(PBLC)，同时将手术切除的新鲜瘤体按文献[2]方法分离得到新鲜肿瘤细胞，即将手术切除的肿瘤组织切成小块，然后用DNA酶、胶原酶和透明质酸酶进行混合消化，制成单细胞悬液，再经Percoll不连续梯度离心和Ficoll/Hypaque分离液分离，在肿瘤细胞层可获得90%以上的肿瘤细胞，细胞活性一般在90%以上。然后按一定数量冻存部分肿瘤细胞，以备术后治疗过程中进行疗效评价及预后判定。
, 百拇医药
患者外周血T淋巴细胞亚群采用我院首创的S-P一步法检测[3]。即分别以鼠抗人CD3、CD4、CD8单克隆抗体为一抗，通过生物素化二抗与链霉菌素一过氧化物酶(S-P)一步偶联法对淋巴细胞进行染色，显微镜下数200个淋巴细胞，计阳性细胞百分率。
患者外周血淋巴细胞对自身肿瘤细胞杀伤活性检测采用微量LDH释放法。将患者PBLC及新鲜肿瘤细胞浓度分别调至4×106/ml和2×106/ml，按表1将细胞、培养液等加入96孔细胞培养板，混匀后，37℃ 5% CO2温育18 h，吸上清放于试管中，加LDH反应液(丙酮酸钠30 mg%，NADH 15 mg 用0.05 mol/L PBS新鲜配制)0.6ml，于分光光度计上取波长340 nm检测其A值。
表1 微量LDH释放法96孔板加样设计
, 百拇医药
PBLC
(4×106/ml)
自身肿瘤细胞
(2×106/ml)
1640培养液
1%
triton-100
活性测定孔
100μl
20μl
80μl
自然释放孔
, 百拇医药
20μl
180μl
最大释放孔
20μl
180μl
三、统计学处理 采用t检验进行统计学分析。
结果与讨论
两组病例检测的外周血T淋巴细胞亚群和ATK活性的结果见表2。
表2 两组病例T细胞亚群及ATK活性比较(
±s%) 组别
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例数
CD3+
CD4+
CD8+
ATK活性
转移组
13
51±6
36±4
31±5
2.8±0.7
, 百拇医药
非转移组
25
53±5
34±5
39±6
11.8±5.7
P值
>0.05
>0.05
<0.01
<0.01
结果显示，肿瘤术后转移组CD3+、CD4+与非转移组无明显差异(P>0.05)，而CD8+及ATK活性明显低下，与非转移组相比有非常显著差异(P<0.01)。本试验结果显示，术后2年内有复发与转移的肿瘤患者，其ATK活性及CD8+细胞亚群明显低下，由于目前要将CD8均为阳性的CD8+Tc与CD8+Ts区分开来尚有难度[4]，作者暂且推断肿瘤转移组患者CD8+的低下就是外周血中CD8+Tc的减少，从而导致ATK活性的减低，使术后肿瘤灶残留的肿瘤细胞或释放到血中的肿瘤细胞得以存活而引起复发和转移。有些病人即使无复发与转移，而CD8+细胞及ATK活性低下，其预后都比较差。反之，即使有复发和转移，CD8+细胞和ATK活性较高的病人，一般情况也比较好。可见CD8+细胞及ATK活性的高低与病人预后有关。实验中有4例ATK活性及CD8+细胞低下的病人，术后及时经PHA-CD3AK细胞/或自身肿瘤细胞疫苗的生物免疫治疗后，其CD8+细胞和ATK活性都有明显的提高，随访至今未发现肿瘤的转移与复发，说明经生物治疗诱导出的对自身肿瘤细胞杀伤活性，与其自然存在的对自身肿瘤细胞杀伤活性一样重要，可防止肿瘤的复发和转移。
, http://www.100md.com
本文用患者新鲜的淋巴细胞，在体外杀伤从其自身肿瘤组织分离出来的新鲜肿瘤细胞，进行功能分析，更接近肿瘤患者的体内状态，能更直观地了解患者体内抗肿瘤免疫功能情况，有助于肿瘤患者的临床监测和预后判断。可发现手术后有高度复发危险的病人，以便早期发现复发转移瘤灶，并于术后及时进行生物免疫治疗等综合措施，防止肿瘤的复发与转移。
第一作者简介 肖文海，男，大学本科，主管检验师。
参考文献
1 Uchida A. Biological significance of autologous tumor-killing activity and its induction therapy. Cancer Immunol Immunother, 1993,37:75
2 李莉、李先兴、孔宪涛.人肿瘤浸润的淋巴细胞的分离及培养.中国免疫学杂志，1991，7(5)：294
3 张盛洪、徐潮斌.非流式细胞计检测淋巴细胞亚群若干方法的比较.中国人兽共患病杂志，1995，11(2)：105
4 Nishimura Y, Kamikawaji N, Fujisawa, K et al. Genetic control of immune response and disease and disease susceptibility by the HLA-DQ gene. Res Immunol, 1991,142:459
(收稿：1998-11-02), 百拇医药
单位：福建三明市第一医院(三明 365000)；肖文海 翁晓萌 生物治疗研究室；朱红梅 检验科
关键词：肿瘤；T淋巴细胞；预后
肿瘤990515 当前，手术治疗仍然是多种肿瘤的首选治疗方案，但术后却有一定比例局部瘤灶的复发和远处转移灶的出现。自身肿瘤杀伤活性(Autologous tumor-killing activity, ATK)是近年来一个新概念[1]，它是指肿瘤患者外周血淋巴细胞对自身肿瘤细胞的杀伤活性。由于ATK测定更接近患者的体内状态，从而能客观地了解患者体内的抗肿瘤免疫功能情况。本研究通过对38例行根治性手术的肿瘤患者进行ATK测定，并经过2年来的临床追踪观察发现，肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群的变化，以及ATK活性的高低与肿瘤患者的预后密切相关，现报道如下。
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临床资料与方法
一、病例选择 38例进行根治性手术的早、中期恶性肿瘤患者，年龄28～67岁，平均43岁，其中胃癌12例，大肠癌8例，肺癌2例，乳腺癌10例，食管癌6例。所有病人术前未经任何治疗，病灶均为原发且全部都有明确的病理诊断。患者手术后均进行临床追踪观察2年以上，将2年内预后良好，未出现复发与转移的25例患者归为非转移组，其余2年内有复发与转移的13例患者归为转移组。
二、实验方法 手术当日取外周血，按常规分离外周血淋巴细胞(PBLC)，同时将手术切除的新鲜瘤体按文献[2]方法分离得到新鲜肿瘤细胞，即将手术切除的肿瘤组织切成小块，然后用DNA酶、胶原酶和透明质酸酶进行混合消化，制成单细胞悬液，再经Percoll不连续梯度离心和Ficoll/Hypaque分离液分离，在肿瘤细胞层可获得90%以上的肿瘤细胞，细胞活性一般在90%以上。然后按一定数量冻存部分肿瘤细胞，以备术后治疗过程中进行疗效评价及预后判定。
, 百拇医药
患者外周血T淋巴细胞亚群采用我院首创的S-P一步法检测[3]。即分别以鼠抗人CD3、CD4、CD8单克隆抗体为一抗，通过生物素化二抗与链霉菌素一过氧化物酶(S-P)一步偶联法对淋巴细胞进行染色，显微镜下数200个淋巴细胞，计阳性细胞百分率。
患者外周血淋巴细胞对自身肿瘤细胞杀伤活性检测采用微量LDH释放法。将患者PBLC及新鲜肿瘤细胞浓度分别调至4×106/ml和2×106/ml，按表1将细胞、培养液等加入96孔细胞培养板，混匀后，37℃ 5% CO2温育18 h，吸上清放于试管中，加LDH反应液(丙酮酸钠30 mg%，NADH 15 mg 用0.05 mol/L PBS新鲜配制)0.6ml，于分光光度计上取波长340 nm检测其A值。
表1 微量LDH释放法96孔板加样设计
, 百拇医药
PBLC
(4×106/ml)
自身肿瘤细胞
(2×106/ml)
1640培养液
1%
triton-100
活性测定孔
100μl
20μl
80μl
自然释放孔
, 百拇医药
20μl
180μl
最大释放孔
20μl
180μl
三、统计学处理 采用t检验进行统计学分析。
结果与讨论
两组病例检测的外周血T淋巴细胞亚群和ATK活性的结果见表2。
表2 两组病例T细胞亚群及ATK活性比较(
±s%) 组别, http://www.100md.com
例数
CD3+
CD4+
CD8+
ATK活性
转移组
13
51±6
36±4
31±5
2.8±0.7
, 百拇医药
非转移组
25
53±5
34±5
39±6
11.8±5.7
P值
>0.05
>0.05
<0.01
<0.01
结果显示，肿瘤术后转移组CD3+、CD4+与非转移组无明显差异(P>0.05)，而CD8+及ATK活性明显低下，与非转移组相比有非常显著差异(P<0.01)。本试验结果显示，术后2年内有复发与转移的肿瘤患者，其ATK活性及CD8+细胞亚群明显低下，由于目前要将CD8均为阳性的CD8+Tc与CD8+Ts区分开来尚有难度[4]，作者暂且推断肿瘤转移组患者CD8+的低下就是外周血中CD8+Tc的减少，从而导致ATK活性的减低，使术后肿瘤灶残留的肿瘤细胞或释放到血中的肿瘤细胞得以存活而引起复发和转移。有些病人即使无复发与转移，而CD8+细胞及ATK活性低下，其预后都比较差。反之，即使有复发和转移，CD8+细胞和ATK活性较高的病人，一般情况也比较好。可见CD8+细胞及ATK活性的高低与病人预后有关。实验中有4例ATK活性及CD8+细胞低下的病人，术后及时经PHA-CD3AK细胞/或自身肿瘤细胞疫苗的生物免疫治疗后，其CD8+细胞和ATK活性都有明显的提高，随访至今未发现肿瘤的转移与复发，说明经生物治疗诱导出的对自身肿瘤细胞杀伤活性，与其自然存在的对自身肿瘤细胞杀伤活性一样重要，可防止肿瘤的复发和转移。
, http://www.100md.com
本文用患者新鲜的淋巴细胞，在体外杀伤从其自身肿瘤组织分离出来的新鲜肿瘤细胞，进行功能分析，更接近肿瘤患者的体内状态，能更直观地了解患者体内抗肿瘤免疫功能情况，有助于肿瘤患者的临床监测和预后判断。可发现手术后有高度复发危险的病人，以便早期发现复发转移瘤灶，并于术后及时进行生物免疫治疗等综合措施，防止肿瘤的复发与转移。
第一作者简介 肖文海，男，大学本科，主管检验师。
参考文献
1 Uchida A. Biological significance of autologous tumor-killing activity and its induction therapy. Cancer Immunol Immunother, 1993,37:75
2 李莉、李先兴、孔宪涛.人肿瘤浸润的淋巴细胞的分离及培养.中国免疫学杂志，1991，7(5)：294
3 张盛洪、徐潮斌.非流式细胞计检测淋巴细胞亚群若干方法的比较.中国人兽共患病杂志，1995，11(2)：105
4 Nishimura Y, Kamikawaji N, Fujisawa, K et al. Genetic control of immune response and disease and disease susceptibility by the HLA-DQ gene. Res Immunol, 1991,142:459
(收稿：1998-11-02), 百拇医药