人类TIMP-2蛋白在SGC-7901细胞中的表达
作者：李 楠 徐采朴 刘为纹 王 鑫
单位：第三军医大学西南医院消化科(重庆 400038) 李楠 现在解放军309医院消化内科(北京 100091)
关键词：基因，TIMP-2；胃肿瘤；基因表达；肿瘤细胞，培养的
肿瘤990512 肿瘤细胞侵袭转移的发生及其机制是近年来肿瘤分子生物学领域的研究热点之一。有人预言，此项研究的不断深入，将为某些疾病的防治，特别是肿瘤的防治开辟一个崭新的领域[1]。TIMP-2为目前影响肿瘤转移相关基因中具有重要意义的一个，被认为是在肿瘤转移中起抑制作用的关键基因，它参与机体的多种生理和病理过程[2，3]。然而关于TIMP-2如何作用和在什么环节上发挥作用，目前尚知之甚少。因此，对TIMP-2作用机制的研究是一关键。构成TIMP-2表达细胞模型，是研究TIMP-2的一个重要手段。本研究将人类TIMP-2 cDNA克隆于逆转录病毒载体pLXSN，经脂质体法导入人胃癌SGC-7901细胞并获得了表达，建立了表达人类TIMP-2蛋白的真核细胞模型，从而为探讨TIMP-2的作用机制及与其它基因间的相互作用提供了条件。
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材料与方法
1.质粒载体
含有TIMP-2 cDNAp片段的质粒pGEM-4Z和逆转录病毒载体pLXSN分别由美国马里兰州国家癌症中心病理研究室Stetler-Stevenson博士和军事医学科学院基础所沈倍奋教授赠送。在pGEM-4Z质粒的EcoRⅠ/Pst Ⅰ位点克隆有791 bp的人类TIMP-2 cDNA，但缺乏能在真核细胞中进行表达的信号肽结构。所得的TIMP-2 cDNA的近3′端6 bp处有一个BamH Ⅰ酶切位点，采用COLD KEY核酸分析软件进行特异性分析，用美国ABI公司DNA自动序列合成仪上合成79 bp的信号肽，两端分别有EcoRⅠ/BamHⅠ的酶切位点，经连接、鉴定，获得人全长阅读框的TIMP-2 cDNA。
2.主要试剂
T4 DNA连接酶购自宝灵曼公司，G418购自Gibco BRL公司，鼠抗人Ⅳ型胶原酶单抗(LgG)由日本名古屋大学分子病研究室提供。λ-DNA/HindⅢ标准购自华美公司。
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3.NIH3T3，SGC-7901细胞株
分别由军事医学科学院基础所和第四军医大学西京医院消化病研究所提供，常规培养于10%新生牛血清的1640培养基中。
4.重组真核表达载体的构建及其转染
用EcoRⅠ切割质粒pGEM-4Z，经低溶点琼脂糖凝胶电泳法分离回收710 bp的含完整开放阅读框的人类TIMP-2 cDNA，然后与经EcoRⅠ线性化的pLXSN连接并转化于大肠杆菌DH5α。经快速细胞破碎法初筛、EcoRⅠ及BamHⅠ酶切等步骤鉴定出TIMP-2 cDNA以正、反向插入的重组真核表达载体pLXSN/TIMP-2。以Liprofeminin脂质体将pLXSN/TIMP-2导入SGC-7901细胞，利用含G418(500 μg/ml)的选择培养基培养2～3周，筛选出G418抗性克隆并行扩大培养。同法筛选出空载体pLXSN转染的SGC-7901细胞。
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5.SDS-PAGE法检测TIMP-2蛋白的表达
按文献[4]的方法提取细胞总蛋白，经用含一定量的Ⅳ型胶原的0.8%的琼脂凝胶电泳，在对照组用MMP-2鼠抗人单克隆抗体作对照，在电泳槽中与转染和未转染组的细胞提取蛋白进行比较，含有TIMP-2基因转染组的细胞降解Ⅳ型胶原的能力明显下降，而未含TIMP-2基因转染组的细胞则能降解Ⅳ型胶原，与对照组相比在降解区带处有相似条带，可以模拟TIMP-2的表达情况。
6.细胞一般生长特性观察
将TIMP-2表达细胞，转染空载体的细胞及未经任何转染的细胞制成单细胞悬液，接种于24孔板，3×104细胞/孔。在正常培养条件下，每隔24 h，取部分孔中的细胞，经台盼蓝染色后，计数细胞，绘制不同时相的细胞数量变化曲线，计算存活细胞百分率。实验设两个平行孔，取其平均值。
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7.细胞侵袭特性观察
将转染与未转染的SGC-7901肿瘤细胞在培养24 h后用D-Hank′s洗涤3次，计数浓度至5×105/ml，在Boyden Chamber的下室中加入经饥饿(无血清)培养的NIH3T3细胞上清200 μl作趋化因子，上下室之间用Φ为13 mm的无钙聚乙稀吡咯膜分开，上敷有Matrigel胶(人工基底膜，含有Ⅳ型胶原和层粘连蛋白等成份)，上室内加入经计数的待测细胞，放入CO2温箱中6小时拿出，经擦净上层的Matrigel胶，倒置显微镜下计数穿透孔径的细胞数。
结果
一、pLXSN/TIMP-2的构建
将pGEM-4Z质粒中的TIMP-2 cDNA用EcoRⅠ酶切并连入pLXSN逆转录病毒载体的相应位点，转化后挑选转化子培养，以碱裂解法小量提取质粒DNA，经用EcoRⅠ、BamHⅠ酶切后见约800 bp的片断，用EcoRⅠ单酶切获3.1 kb的片断，表明已成功的构建pL-T2重组质粒(见图1)。
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图1 BamHⅠ酶切鉴定TIMP-2 cDNA在重组载体中的插入方向
1,8:λDNA/HindⅢ 2：SGC-7901-T2(BamHⅠ)
3，4：SGC-7901-T2(HamHⅠ/EcoRⅠ) 5,6：空白
7,pGEM-4E-T2(BamH1/EcoRⅠ)
二、人类TIMP-2 cDNA在SGC-7901细胞中的表达
将含有pL-T2和单纯pLXSN质粒的SGC-7901细胞上清经透析袋在PGE20000的试剂中进行浓缩后，经分光光度计上进行定量，再加入含有Ⅳ型胶原的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳后的凝胶经活化24小时后再进行考马斯亮兰染色(见图2)。
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图2 SDS-PAGE检测的人类TIMP-2蛋白在SGC-7901细胞中的表达
1,3:SGC-7901 2：SGC-7901-T2
4：SGC-7901-pLXSN(NeoR)
三、目的基因的整合检测
用pL-T2和pLXSN转染的SGC-7901细胞经G418筛选得到抗G418阳性克隆，为了验证是否目的基因整合到靶细胞基因组DNA中，将转染细胞基因组DNA经EcoRⅠ/XbaⅠ酶切后，Southern Blot杂交及PCR扩增NeoR基因片断两种方法检测外源片断是否整合到靶细胞中(见插页第4页图4)。
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图4 TIMP-2转染SGC-7901细胞Southern Blot检测
1：SGC-7901-T2 2：SGC-7901-T2 3：SGC-7901 4：SGC-7901
四、细胞一般生长特性
在正常培养条件下，3种细胞在各时相点的细胞数间及存活差差异不明显(P>0.05)。表明在正常情况下，人类TIMP-2蛋白的表达对SGC-7901细胞的增殖与存活无明显影响。
五、细胞侵袭特性
SGC-7901/TIMP-2细胞与未转染SGC-7901组和转染空载体组SGC-7901/pLXSN比较有明显差异(见附表)。
附表 各组细胞侵袭能力比较 组 别
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培养时间(h)
细胞数
(×105)
平均侵袭
肿瘤细胞数
SGC-7901
6
2
135.67±21.00
SGC-7901/TIMP-2
6
2
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33.09±11.66*
SGC-7901/pLXSN
6
2
152.18±23.21
*P<0.05讨论
TIMP-2基因以其明确的肿瘤转移抑制功能而受到人们的广泛关注。在生理情况下，它与胶原的代谢、机体骨组织器官的发育、机体寿命的维持、信息分子的信号传导等密切相关；在病理条件下，它与某些疾病，特别是肿瘤的发生、肿瘤细胞的恶性侵袭等表型有关。因此，深入探讨TIMP-2的作用机制，将对了解机体的某些生理和病理过程，乃至在临床上有效地治疗相关疾病产生极其深远的影响[2，3，6]。研究TIMP-2的一个重要手段，就是构建表达TIMP-2的细胞模型，利用模型细胞进行研究。应用此策略，人们已证实了TIMP-2为一抑制癌转移的基因，阐明了TIMP-2蛋白的胞内定位，证明了TIMP-2的3个同源域是其发挥功能所必须的，证实了TIMP-2基因对相同和不同种属肿瘤细胞的恶性生物学表型均有抑制作用，揭示了TIMP-2基因参与肿瘤细胞侵袭行为的事实等等[6，7]。关于TIMP-2的作用机制虽有多种推测，但总的来说，尚不清楚。因此，对TIMP-2作用机制的研究仍是今后研究的焦点。本研究使人类TIMP-2 cDNA在人胃癌SGC-7901细胞中获得了表达，建立了表达TIMP-2蛋白真核细胞模型，从而为探讨TIMP-2的作用机制及其与其它基因间的关系奠定了基础。实验中之所以使用SGC-7901细胞，原因在于该细胞具有肿瘤细胞恶性侵袭的作用，而且肿瘤细胞本身有TIMP-2表达。因此，在使用TIMP-2基因转染后，还可以研究TIMP-2对肿瘤细胞侵袭行为的影响观察，为阐明TIMP-2作用机制积累资料。
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体外研究表明，单独TIMP-2基因转染对细胞增殖无明显影响，本实验结果也支持这一观点。在SGC-7901细胞受pLXSN/TIMP-2转染后，于正常培养条件下，细胞生长及存活率的动态变化均与对照细胞无明显差异。至于这些体外实验结果能否反映体内情况，尚有待于进一步研究。最近Zeng等[8]的研究发现，TIMP-2可参与新生小血管的形成，参与创伤的修复等过程，并且协同TIMP-1和MMP-2共同调节肿瘤细胞的侵袭表型。这提示，TIMP-2可能在某种程度上参与了肿瘤细胞增殖的调控，只是这种作用只有当其它基因与之协同时才能明显表现。
作者简介：李 楠，男，医学博士，副主任医师。
参考文献
[1]Dougles B.Invasion and metastasis.Cancer Metas Rev,1996,15:77
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[2]Takahia T,Hiroshy S,Motoharm S, et al. Molecular biology of matrix metalloproteinases(MMPs) and tissue inhibitor of metalloproteinases(TIMPs)，and the regulations of these gene in tumor tissues.Jpa J Clin Med,1995,53:1791
[3]Lenegel E,Gum R,Juarez J, et al. Induration of Mr92,000 type Ⅳ collagenase expression in a squamous cell carcinoma cell line by fibroblasts.Cancer Res,1995,55(4);963
[4]Albini Y,Lcmcn HK.A rapid in vitro assay for quantification the invasion potential of tumor cell.Cancer Res,1987;47:3229
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[5]李楠，王鑫，冯东晓，等.TIMP-2基因逆转录病毒载体的构建.军事医学院院刊，1996，1：80
[6]Carlod PS，Normal HA,Parmender P,et al. Prostate cancer progression,metastasis and gene expression in transgenic mice.Cancer Res,1997,57(5):900
[7]Hee J,Sook B, Ho Y, et al. Anti-invasive activity of wrosli and correlates with the reduction expression of matrix metalloproteinase-9(MMP-9)in HT-1080 human fibrosarcoma cells.Cancer Res,1995,55(10):2218
[8]Zeng G,Millis AJ. Expression of T2-KDa gelatinase and TIMP-2 in early and late passage human fibroblasts.Exp Cell,1994,213(1):148
(收稿日期：1998-10-16 修回日期：1998-12-20), http://www.100md.com
单位：第三军医大学西南医院消化科(重庆 400038) 李楠 现在解放军309医院消化内科(北京 100091)
关键词：基因，TIMP-2；胃肿瘤；基因表达；肿瘤细胞，培养的
肿瘤990512 肿瘤细胞侵袭转移的发生及其机制是近年来肿瘤分子生物学领域的研究热点之一。有人预言，此项研究的不断深入，将为某些疾病的防治，特别是肿瘤的防治开辟一个崭新的领域[1]。TIMP-2为目前影响肿瘤转移相关基因中具有重要意义的一个，被认为是在肿瘤转移中起抑制作用的关键基因，它参与机体的多种生理和病理过程[2，3]。然而关于TIMP-2如何作用和在什么环节上发挥作用，目前尚知之甚少。因此，对TIMP-2作用机制的研究是一关键。构成TIMP-2表达细胞模型，是研究TIMP-2的一个重要手段。本研究将人类TIMP-2 cDNA克隆于逆转录病毒载体pLXSN，经脂质体法导入人胃癌SGC-7901细胞并获得了表达，建立了表达人类TIMP-2蛋白的真核细胞模型，从而为探讨TIMP-2的作用机制及与其它基因间的相互作用提供了条件。
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材料与方法
1.质粒载体
含有TIMP-2 cDNAp片段的质粒pGEM-4Z和逆转录病毒载体pLXSN分别由美国马里兰州国家癌症中心病理研究室Stetler-Stevenson博士和军事医学科学院基础所沈倍奋教授赠送。在pGEM-4Z质粒的EcoRⅠ/Pst Ⅰ位点克隆有791 bp的人类TIMP-2 cDNA，但缺乏能在真核细胞中进行表达的信号肽结构。所得的TIMP-2 cDNA的近3′端6 bp处有一个BamH Ⅰ酶切位点，采用COLD KEY核酸分析软件进行特异性分析，用美国ABI公司DNA自动序列合成仪上合成79 bp的信号肽，两端分别有EcoRⅠ/BamHⅠ的酶切位点，经连接、鉴定，获得人全长阅读框的TIMP-2 cDNA。
2.主要试剂
T4 DNA连接酶购自宝灵曼公司，G418购自Gibco BRL公司，鼠抗人Ⅳ型胶原酶单抗(LgG)由日本名古屋大学分子病研究室提供。λ-DNA/HindⅢ标准购自华美公司。
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3.NIH3T3，SGC-7901细胞株
分别由军事医学科学院基础所和第四军医大学西京医院消化病研究所提供，常规培养于10%新生牛血清的1640培养基中。
4.重组真核表达载体的构建及其转染
用EcoRⅠ切割质粒pGEM-4Z，经低溶点琼脂糖凝胶电泳法分离回收710 bp的含完整开放阅读框的人类TIMP-2 cDNA，然后与经EcoRⅠ线性化的pLXSN连接并转化于大肠杆菌DH5α。经快速细胞破碎法初筛、EcoRⅠ及BamHⅠ酶切等步骤鉴定出TIMP-2 cDNA以正、反向插入的重组真核表达载体pLXSN/TIMP-2。以Liprofeminin脂质体将pLXSN/TIMP-2导入SGC-7901细胞，利用含G418(500 μg/ml)的选择培养基培养2～3周，筛选出G418抗性克隆并行扩大培养。同法筛选出空载体pLXSN转染的SGC-7901细胞。
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5.SDS-PAGE法检测TIMP-2蛋白的表达
按文献[4]的方法提取细胞总蛋白，经用含一定量的Ⅳ型胶原的0.8%的琼脂凝胶电泳，在对照组用MMP-2鼠抗人单克隆抗体作对照，在电泳槽中与转染和未转染组的细胞提取蛋白进行比较，含有TIMP-2基因转染组的细胞降解Ⅳ型胶原的能力明显下降，而未含TIMP-2基因转染组的细胞则能降解Ⅳ型胶原，与对照组相比在降解区带处有相似条带，可以模拟TIMP-2的表达情况。
6.细胞一般生长特性观察
将TIMP-2表达细胞，转染空载体的细胞及未经任何转染的细胞制成单细胞悬液，接种于24孔板，3×104细胞/孔。在正常培养条件下，每隔24 h，取部分孔中的细胞，经台盼蓝染色后，计数细胞，绘制不同时相的细胞数量变化曲线，计算存活细胞百分率。实验设两个平行孔，取其平均值。
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7.细胞侵袭特性观察
将转染与未转染的SGC-7901肿瘤细胞在培养24 h后用D-Hank′s洗涤3次，计数浓度至5×105/ml，在Boyden Chamber的下室中加入经饥饿(无血清)培养的NIH3T3细胞上清200 μl作趋化因子，上下室之间用Φ为13 mm的无钙聚乙稀吡咯膜分开，上敷有Matrigel胶(人工基底膜，含有Ⅳ型胶原和层粘连蛋白等成份)，上室内加入经计数的待测细胞，放入CO2温箱中6小时拿出，经擦净上层的Matrigel胶，倒置显微镜下计数穿透孔径的细胞数。
结果
一、pLXSN/TIMP-2的构建
将pGEM-4Z质粒中的TIMP-2 cDNA用EcoRⅠ酶切并连入pLXSN逆转录病毒载体的相应位点，转化后挑选转化子培养，以碱裂解法小量提取质粒DNA，经用EcoRⅠ、BamHⅠ酶切后见约800 bp的片断，用EcoRⅠ单酶切获3.1 kb的片断，表明已成功的构建pL-T2重组质粒(见图1)。
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图1 BamHⅠ酶切鉴定TIMP-2 cDNA在重组载体中的插入方向
1,8:λDNA/HindⅢ 2：SGC-7901-T2(BamHⅠ)
3，4：SGC-7901-T2(HamHⅠ/EcoRⅠ) 5,6：空白
7,pGEM-4E-T2(BamH1/EcoRⅠ)
二、人类TIMP-2 cDNA在SGC-7901细胞中的表达
将含有pL-T2和单纯pLXSN质粒的SGC-7901细胞上清经透析袋在PGE20000的试剂中进行浓缩后，经分光光度计上进行定量，再加入含有Ⅳ型胶原的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳后的凝胶经活化24小时后再进行考马斯亮兰染色(见图2)。
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图2 SDS-PAGE检测的人类TIMP-2蛋白在SGC-7901细胞中的表达
1,3:SGC-7901 2：SGC-7901-T2
4：SGC-7901-pLXSN(NeoR)
三、目的基因的整合检测
用pL-T2和pLXSN转染的SGC-7901细胞经G418筛选得到抗G418阳性克隆，为了验证是否目的基因整合到靶细胞基因组DNA中，将转染细胞基因组DNA经EcoRⅠ/XbaⅠ酶切后，Southern Blot杂交及PCR扩增NeoR基因片断两种方法检测外源片断是否整合到靶细胞中(见插页第4页图4)。
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图4 TIMP-2转染SGC-7901细胞Southern Blot检测
1：SGC-7901-T2 2：SGC-7901-T2 3：SGC-7901 4：SGC-7901
四、细胞一般生长特性
在正常培养条件下，3种细胞在各时相点的细胞数间及存活差差异不明显(P>0.05)。表明在正常情况下，人类TIMP-2蛋白的表达对SGC-7901细胞的增殖与存活无明显影响。
五、细胞侵袭特性
SGC-7901/TIMP-2细胞与未转染SGC-7901组和转染空载体组SGC-7901/pLXSN比较有明显差异(见附表)。
附表 各组细胞侵袭能力比较 组 别
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培养时间(h)
细胞数
(×105)
平均侵袭
肿瘤细胞数
SGC-7901
6
2
135.67±21.00
SGC-7901/TIMP-2
6
2
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33.09±11.66*
SGC-7901/pLXSN
6
2
152.18±23.21
*P<0.05讨论
TIMP-2基因以其明确的肿瘤转移抑制功能而受到人们的广泛关注。在生理情况下，它与胶原的代谢、机体骨组织器官的发育、机体寿命的维持、信息分子的信号传导等密切相关；在病理条件下，它与某些疾病，特别是肿瘤的发生、肿瘤细胞的恶性侵袭等表型有关。因此，深入探讨TIMP-2的作用机制，将对了解机体的某些生理和病理过程，乃至在临床上有效地治疗相关疾病产生极其深远的影响[2，3，6]。研究TIMP-2的一个重要手段，就是构建表达TIMP-2的细胞模型，利用模型细胞进行研究。应用此策略，人们已证实了TIMP-2为一抑制癌转移的基因，阐明了TIMP-2蛋白的胞内定位，证明了TIMP-2的3个同源域是其发挥功能所必须的，证实了TIMP-2基因对相同和不同种属肿瘤细胞的恶性生物学表型均有抑制作用，揭示了TIMP-2基因参与肿瘤细胞侵袭行为的事实等等[6，7]。关于TIMP-2的作用机制虽有多种推测，但总的来说，尚不清楚。因此，对TIMP-2作用机制的研究仍是今后研究的焦点。本研究使人类TIMP-2 cDNA在人胃癌SGC-7901细胞中获得了表达，建立了表达TIMP-2蛋白真核细胞模型，从而为探讨TIMP-2的作用机制及其与其它基因间的关系奠定了基础。实验中之所以使用SGC-7901细胞，原因在于该细胞具有肿瘤细胞恶性侵袭的作用，而且肿瘤细胞本身有TIMP-2表达。因此，在使用TIMP-2基因转染后，还可以研究TIMP-2对肿瘤细胞侵袭行为的影响观察，为阐明TIMP-2作用机制积累资料。
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体外研究表明，单独TIMP-2基因转染对细胞增殖无明显影响，本实验结果也支持这一观点。在SGC-7901细胞受pLXSN/TIMP-2转染后，于正常培养条件下，细胞生长及存活率的动态变化均与对照细胞无明显差异。至于这些体外实验结果能否反映体内情况，尚有待于进一步研究。最近Zeng等[8]的研究发现，TIMP-2可参与新生小血管的形成，参与创伤的修复等过程，并且协同TIMP-1和MMP-2共同调节肿瘤细胞的侵袭表型。这提示，TIMP-2可能在某种程度上参与了肿瘤细胞增殖的调控，只是这种作用只有当其它基因与之协同时才能明显表现。
作者简介：李 楠，男，医学博士，副主任医师。
参考文献
[1]Dougles B.Invasion and metastasis.Cancer Metas Rev,1996,15:77
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[2]Takahia T,Hiroshy S,Motoharm S, et al. Molecular biology of matrix metalloproteinases(MMPs) and tissue inhibitor of metalloproteinases(TIMPs)，and the regulations of these gene in tumor tissues.Jpa J Clin Med,1995,53:1791
[3]Lenegel E,Gum R,Juarez J, et al. Induration of Mr92,000 type Ⅳ collagenase expression in a squamous cell carcinoma cell line by fibroblasts.Cancer Res,1995,55(4);963
[4]Albini Y,Lcmcn HK.A rapid in vitro assay for quantification the invasion potential of tumor cell.Cancer Res,1987;47:3229
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[5]李楠，王鑫，冯东晓，等.TIMP-2基因逆转录病毒载体的构建.军事医学院院刊，1996，1：80
[6]Carlod PS，Normal HA,Parmender P,et al. Prostate cancer progression,metastasis and gene expression in transgenic mice.Cancer Res,1997,57(5):900
[7]Hee J,Sook B, Ho Y, et al. Anti-invasive activity of wrosli and correlates with the reduction expression of matrix metalloproteinase-9(MMP-9)in HT-1080 human fibrosarcoma cells.Cancer Res,1995,55(10):2218
[8]Zeng G,Millis AJ. Expression of T2-KDa gelatinase and TIMP-2 in early and late passage human fibroblasts.Exp Cell,1994,213(1):148
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