山莨菪碱治疗兔缺血性急性肾功能衰竭的实验研究
作者：刘晓城 唐望先
单位：同济医科大学附属同济医院内科(武汉，430030)
关键词：肾功能衰竭，急性；钙超负荷；三磷酸肌醇；山莨菪碱；超微病理
中国急救医学990501 [摘 要] 目的 探讨山莨菪碱(654-2)治疗缺血性急性肾功能衰竭的机理。方法 用新西兰大白兔制作缺 血性急性肾功能衰竭模型。观察缺血性急性肾功能衰竭组(简称肾衰组)与山莨菪碱治疗组(简称654-2组)肾组织细胞内胞浆游离钙([Ca2+]i)和第二信使—三磷酸肌醇(IP3)的浓度变化及各组肾小管超微病理改变。结果 肾衰组[Ca2+]i为412.1±47.3 nmol/L,IP3为776.0±68.0 pcm，较之对照组的[Ca2+]i(106.1±15.5 nmol/L)、IP3(297.9±54.3 pcm)含量明显增高(均为P<0.01)。654-2组[Ca2+]i为170.9±37.7 nmol/L，IP3为340.1±21.5 pcm，两者较肾衰组显著下降(均为P<0.001)。肾衰组肾小管病理明显重于对照组，654-2组显著轻于肾衰组。结论 654-2能改善缺血性急性肾功能衰竭时肾小管的损伤，能减轻肾组织细胞内钙超负荷，其作用机理与细胞内IP3含量降低有关。
, 百拇医药
An experimental study of the anisodamini hydrobromidum treating rabbits ischemic acute renal failure Liu Xiaocheng，Tang Wangxian. Department of Internal Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
[Abstract] Objective To elucidate mechanism of the Anisodamini Hydrobromidum(654-2)treating ischemic acute renal failure.Methods Ischemic acute renal failure models in rabbits were establishd.Concentration of [Ca2+]i and IP3 in renal histocytes were measured.The changes of renal tubule were ultrapathomorphologically observed.Results The concentrations of intracellular [Ca2+]i [412.1±47.3 nmol/L)，(106.1±15.5 nmol/L)，P<0.01] and IP3[(776.0±68.0 pcm)，(297.9±54.3 pcm)， P<0.001] were increased in renal failure group compared with the contrasted group，concentration of intracellular [Ca2+]i[(170.9±37.7 nmol/L)，(412.1±47.3 nmol/L，P<0.001] and IP3[(340.1±21.5 pcm)，(776.0±68.0 pcm) P<0.01] were decresed in 654-2 treating group compared with the renal failure group.The pathomorphological change was aggravated in renal failure group compared with the contrasted group,was mitigated in 654-2 group compared with the renal failure group.Conclusion 654-2 can alleviate Ca2+-overload in renal histocytes.The mechanism was related to the decrease of concentration of intracellular IP3.
, 百拇医药
[Key words] Renal failure，acute Ca2+-overload Inositol 1，4，5-triphosphate Anisodamini hydrobromidum Ultrapathology
本文采用肾缺血—再灌流方法制作缺血性急性肾功能衰竭动物模型[1]。观察654-2对肾组织细胞内游离钙[Ca2+]i和三磷酸肌醇(IP3)的含量及对肾小管超微病理改变的影响，探讨654-2治疗缺血性急性肾功能衰竭的机理。
1 资料与方法
1.1 试剂 654-2 注射液(杭州民生药厂)。Ca荧光指示剂：Fura-2/Am(中国医学科学院药物研究所提供)。负载液(NaCl，KCl，MgCl2，Hepes，葡萄糖，牛血清白蛋白，二乙酰三胺五乙酸，丙磺舒)pH调至7.0～7.2。Triton-100，Dowes 1×8Formate微型沉析柱(Sigma公司提供)。放射标记物：3H-肌醇(中国军事医学科学院提供)。
, 百拇医药
1.2 仪器 ①β液闪仪，FJ-1067 BG型。②F-3000型单波长荧光分光光度计Japan Hitach 1-8234)。③OPTON EM10C透射电镜。
1.3 实验动物与分组 健康新西兰大白兔21只(由同济医院实验动物房提供)，雌雄不拘，体重1.8～2.5 kg。戊巴比妥钠(30 mg/kg)耳静脉麻醉。在腹部正中切口，游离双肾肾动脉。将实验动物随机分为三组(各组n=7)均取左肾研究。①对照组：游离双肾肾动脉，于120 min后在钳夹右肾动脉的同时切取左肾。②肾衰组：同时钳夹双肾动脉，缺血60 min后，松开左肾动脉夹，再灌注60 min，取左肾。③654-2治疗组：同时钳夹双动脉，缺血60 min，于开始再灌注前2 min，耳静脉注射654-2(2.13 mg/kg)，然后再灌注60 min，取左肾。
1.4 肾组织细胞悬液的制备 依照文献[2]的方法制备。
, 百拇医药
1.5 细胞鉴定 ①光镜。②苔盼蓝拒染试验：计算未着色细胞的百分比。
1.6 细胞内游离钙浓度测定 ①条件：发射光波长500 nm，激发光波长300～400 nm，发射光光栅5 nm，扫描速度240 nm/min，反应时间2 min。②样品处理：将细胞悬液的细胞浓度调至1×109/L，离心，去除上清液，加Fura-2/Am及适量负载液，混匀，置37℃水浴中，温浴45 min，持续均匀轻振，使Fura-2/Am进入细胞内并充分反应。温浴后离心去除上清液，用悬浮液(负载液中加CaCl2)冲洗2次，然后再加适量悬浮液，保持37℃，1 h内测完。③测定：将待测样品移入10 mm石英比色池内，混匀，测定静息荧光值Fmin，加triton-100破坏细胞膜，测定Fmax，再加EGTA(6 mmol/L)以测定Fmin。④结果计算：[Ca2+]i=Kd×(F-Fmin/(Fmax-F)，Kd为解离常数(值为224 nmol)。
, 百拇医药
1.7 细胞内IP3浓度测定 对样品的处理及测定，参照文献[3]并略加改进，细胞培养时间缩短为4 h。
1.8 组织标本处理 1 mm3大小的肾皮质数块，迅速投入2.5%戊二醛缓冲液中，固定2 h，蔗糖冲洗液冲洗，1%OsO4后固定2 h，逐级酒精丙酮脱水，Epon812包埋，超薄切片，铅铀双染，OPTON EM10C透射电镜观察。
1.9 统计方法实验数据用
±s表示，数据组间比较用Student-t检验。
2 结果
2.1 肾组织细胞鉴定 本试验分离所得细胞悬液中肾组织细胞为单个悬浮细胞。苔盼蓝拒染试验揭示细胞活性达90%以上。光镜下每视野完整肾组织细胞与残留血细胞及细胞碎片比较，本试验肾组织细胞纯度达99%以上。
, 百拇医药
2.2 各组肾组织细胞内IP3浓度、[Ca2+]i浓度 结果见附表。
附表 各组肾组织细胞内[Ca2+]i、IP3浓度(±s) 组别
n
[Ca2+]i(nmol/L)
IP3(pcm)
对照组
7
106.1±15.5
, 百拇医药
297.9±54.3
肾衰组
7
412.1±47.3*
776.0±68.0*
654-2治疗组
7
170.9±37.7△
340.1±21.5△
注：与对照组比较*P<0.01；与肾衰组比较△P<0.01。
, http://www.100md.com 结果 ①肾组织细胞内IP3浓度：肾衰组较对照组增高，差异有极显著意义(P<0.01)；654-2治疗组较肾衰组明显下降，差异有极显著意义(P<0.001)。②肾组织细胞内[Ca2+]i浓度：肾衰组较对照组升高，差异有极显著意义(P<0.01)；654-2治疗组较肾衰组明显降低，差异有极显著意义(P<0.001)。③对照组的肾小管结构基本正常，近端肾小管腔面微绒毛排列紧密规则(见图1)。上皮细胞内各种细胞器结构清晰，基底面细胞膜内陷形成内褶，其间有大量纵行排行的线粒体 。细胞相邻面可见连热接复合体。肾衰组肾小管上皮细胞损伤严重(见图2)。部分肾小管上皮细胞膜破裂，有时可见整个细胞从基底上脱离，肾小管间质水肿明显，有较多白细胞浸润，并可见灶状出血和坏死。654-2组(见图3)肾小管上皮细胞轻度水肿，胞浆内线粒体轻度肿胀，部分线粒体嵴变短或消失。肾小管腔面微绒毛排列较规则。基底部质膜内褶缩短，基膜尚规则，部分小管腔内有絮状物堵塞。肾小管间质轻度水肿，无炎性细胞浸润。
, 百拇医药
图1 对照组(EN×4000)
图2 肾衰组(EN×4000)
图3 654-2组(EN×3150)
3 讨论
本文采用缺血—再灌流方法制作缺血性急性肾功能衰竭模型获得成功[1]。电镜显示，肾衰组的病理损伤明显重于对照组，而654-2组病理损伤显著减轻。资料表明[4]，大量白细胞粘附、浸润于缺血区，介导释放自由基和其他氧的还原型产物是缺血性急性肾衰时组织损伤的重要原因之一。研究还表明[5]，完整细胞的脱落可能与细胞和细胞间、细胞和基质间粘附性减弱有关。认为缺血性急性肾衰时肾小管上皮系统完整性的破坏及其屏障功能的丧失不仅与以往公认的肾小管上皮细胞的坏死崩解有关，而且还可能与完整上皮细胞从肾小管基膜上的脱离有关。654-2组的病理与肾衰组比较，组织损伤明显减轻，而且发现654-2组既无白细胞的浸润，亦无完整细胞的脱离。说明654-2对防止急性肾衰时肾小管的损伤有确实的积极作用，并提示这一作用可能与654-2阻止白细胞浸润和改善细胞与细胞间，细胞与基质间的粘附性有关，微绒毛是维持肾小管功能的重要结构。正常微绒毛可使近端肾小管腔面的表面积增加40倍，从而大大增加了肾小管上皮细胞和小管液的接触面积，有利于被动重吸收物质的弥散，同时微绒毛表面还有多种载体，与某些物质的主动重吸收有关。654-2组微绒毛的状况明显好于急性肾衰组，说明654-2有保护微绒毛的作用。结果还显示，肾衰组肾组织细胞内[Ca2+]i明显升高，说明钙超负荷也是缺血性急性肾功能衰竭的重要发生机理之一。
, http://www.100md.com
由于临床上病人常常于缺血发生后才到医院就诊，所以我们采用再灌注前2 min给药，使实验尽可能贴近临床。结果表明，给予654-2治疗后肾组织细胞内[Ca2+]i明显下降，说明654-2有减轻钙超负荷的作用，同时IP3浓度也显著下降，与肾衰未治疗组相比，差异均有极显著性意义。IP3为细胞内信息传递的第二信使，可特异性地诱发细胞内贮存钙池释放[Ca2+]i，也可以通过使内质网释放Ca2+而为Ca2+的内流提供信号，同时IP3的代谢产物IP4也具有促进外钙内流的作用。揭示：654-2减轻钙超负荷保护肾脏的作用与IP3的降低有关。其机理我们认为可能是通过阻断细胞表面M受体，继而抑制细胞内IP3产生所致。
国家自然科学基金资助课题(No.39170371)
, 百拇医药
参考文献
1 刘晓城，汪琼玲，唐望先.缺血性急性肾功能衰竭时肾小管的超微病理变化.同济医科大学学报，1995，24(3)：196
2 刘晓城，唐望先，汪琼玲.三磷酸肌醇与钙超载在急性肾缺血及再灌流损伤中的作用.同济医科大学学报，1996，25(5)：344
3 李品兰.三磷酸肌醇在IL-2诱导的T细胞增殖分化中的信息传递作用.中国免疫学杂志，1990，6：338
4 张帆综述，王家马 龙审校.氧自由基与肝缺血再灌注损伤.国外医学消化系统疾病分册，1989，9(4)：199
5 候凡凡综述，张训审校.急性肾衰发病机理的新进展——肾小管上皮细胞粘附性改变.国外医学泌尿系统分册，1993，13(6)：263
(收稿：1999-03-24), http://www.100md.com
单位：同济医科大学附属同济医院内科(武汉，430030)
关键词：肾功能衰竭，急性；钙超负荷；三磷酸肌醇；山莨菪碱；超微病理
中国急救医学990501 [摘 要] 目的 探讨山莨菪碱(654-2)治疗缺血性急性肾功能衰竭的机理。方法 用新西兰大白兔制作缺 血性急性肾功能衰竭模型。观察缺血性急性肾功能衰竭组(简称肾衰组)与山莨菪碱治疗组(简称654-2组)肾组织细胞内胞浆游离钙([Ca2+]i)和第二信使—三磷酸肌醇(IP3)的浓度变化及各组肾小管超微病理改变。结果 肾衰组[Ca2+]i为412.1±47.3 nmol/L,IP3为776.0±68.0 pcm，较之对照组的[Ca2+]i(106.1±15.5 nmol/L)、IP3(297.9±54.3 pcm)含量明显增高(均为P<0.01)。654-2组[Ca2+]i为170.9±37.7 nmol/L，IP3为340.1±21.5 pcm，两者较肾衰组显著下降(均为P<0.001)。肾衰组肾小管病理明显重于对照组，654-2组显著轻于肾衰组。结论 654-2能改善缺血性急性肾功能衰竭时肾小管的损伤，能减轻肾组织细胞内钙超负荷，其作用机理与细胞内IP3含量降低有关。
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An experimental study of the anisodamini hydrobromidum treating rabbits ischemic acute renal failure Liu Xiaocheng，Tang Wangxian. Department of Internal Medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
[Abstract] Objective To elucidate mechanism of the Anisodamini Hydrobromidum(654-2)treating ischemic acute renal failure.Methods Ischemic acute renal failure models in rabbits were establishd.Concentration of [Ca2+]i and IP3 in renal histocytes were measured.The changes of renal tubule were ultrapathomorphologically observed.Results The concentrations of intracellular [Ca2+]i [412.1±47.3 nmol/L)，(106.1±15.5 nmol/L)，P<0.01] and IP3[(776.0±68.0 pcm)，(297.9±54.3 pcm)， P<0.001] were increased in renal failure group compared with the contrasted group，concentration of intracellular [Ca2+]i[(170.9±37.7 nmol/L)，(412.1±47.3 nmol/L，P<0.001] and IP3[(340.1±21.5 pcm)，(776.0±68.0 pcm) P<0.01] were decresed in 654-2 treating group compared with the renal failure group.The pathomorphological change was aggravated in renal failure group compared with the contrasted group,was mitigated in 654-2 group compared with the renal failure group.Conclusion 654-2 can alleviate Ca2+-overload in renal histocytes.The mechanism was related to the decrease of concentration of intracellular IP3.
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[Key words] Renal failure，acute Ca2+-overload Inositol 1，4，5-triphosphate Anisodamini hydrobromidum Ultrapathology
本文采用肾缺血—再灌流方法制作缺血性急性肾功能衰竭动物模型[1]。观察654-2对肾组织细胞内游离钙[Ca2+]i和三磷酸肌醇(IP3)的含量及对肾小管超微病理改变的影响，探讨654-2治疗缺血性急性肾功能衰竭的机理。
1 资料与方法
1.1 试剂 654-2 注射液(杭州民生药厂)。Ca荧光指示剂：Fura-2/Am(中国医学科学院药物研究所提供)。负载液(NaCl，KCl，MgCl2，Hepes，葡萄糖，牛血清白蛋白，二乙酰三胺五乙酸，丙磺舒)pH调至7.0～7.2。Triton-100，Dowes 1×8Formate微型沉析柱(Sigma公司提供)。放射标记物：3H-肌醇(中国军事医学科学院提供)。
, 百拇医药
1.2 仪器 ①β液闪仪，FJ-1067 BG型。②F-3000型单波长荧光分光光度计Japan Hitach 1-8234)。③OPTON EM10C透射电镜。
1.3 实验动物与分组 健康新西兰大白兔21只(由同济医院实验动物房提供)，雌雄不拘，体重1.8～2.5 kg。戊巴比妥钠(30 mg/kg)耳静脉麻醉。在腹部正中切口，游离双肾肾动脉。将实验动物随机分为三组(各组n=7)均取左肾研究。①对照组：游离双肾肾动脉，于120 min后在钳夹右肾动脉的同时切取左肾。②肾衰组：同时钳夹双肾动脉，缺血60 min后，松开左肾动脉夹，再灌注60 min，取左肾。③654-2治疗组：同时钳夹双动脉，缺血60 min，于开始再灌注前2 min，耳静脉注射654-2(2.13 mg/kg)，然后再灌注60 min，取左肾。
1.4 肾组织细胞悬液的制备 依照文献[2]的方法制备。
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1.5 细胞鉴定 ①光镜。②苔盼蓝拒染试验：计算未着色细胞的百分比。
1.6 细胞内游离钙浓度测定 ①条件：发射光波长500 nm，激发光波长300～400 nm，发射光光栅5 nm，扫描速度240 nm/min，反应时间2 min。②样品处理：将细胞悬液的细胞浓度调至1×109/L，离心，去除上清液，加Fura-2/Am及适量负载液，混匀，置37℃水浴中，温浴45 min，持续均匀轻振，使Fura-2/Am进入细胞内并充分反应。温浴后离心去除上清液，用悬浮液(负载液中加CaCl2)冲洗2次，然后再加适量悬浮液，保持37℃，1 h内测完。③测定：将待测样品移入10 mm石英比色池内，混匀，测定静息荧光值Fmin，加triton-100破坏细胞膜，测定Fmax，再加EGTA(6 mmol/L)以测定Fmin。④结果计算：[Ca2+]i=Kd×(F-Fmin/(Fmax-F)，Kd为解离常数(值为224 nmol)。
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1.7 细胞内IP3浓度测定 对样品的处理及测定，参照文献[3]并略加改进，细胞培养时间缩短为4 h。
1.8 组织标本处理 1 mm3大小的肾皮质数块，迅速投入2.5%戊二醛缓冲液中，固定2 h，蔗糖冲洗液冲洗，1%OsO4后固定2 h，逐级酒精丙酮脱水，Epon812包埋，超薄切片，铅铀双染，OPTON EM10C透射电镜观察。
1.9 统计方法实验数据用
±s表示，数据组间比较用Student-t检验。2 结果
2.1 肾组织细胞鉴定 本试验分离所得细胞悬液中肾组织细胞为单个悬浮细胞。苔盼蓝拒染试验揭示细胞活性达90%以上。光镜下每视野完整肾组织细胞与残留血细胞及细胞碎片比较，本试验肾组织细胞纯度达99%以上。
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2.2 各组肾组织细胞内IP3浓度、[Ca2+]i浓度 结果见附表。
附表 各组肾组织细胞内[Ca2+]i、IP3浓度(
±s) 组别n
[Ca2+]i(nmol/L)
IP3(pcm)
对照组
7
106.1±15.5
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297.9±54.3
肾衰组
7
412.1±47.3*
776.0±68.0*
654-2治疗组
7
170.9±37.7△
340.1±21.5△
注：与对照组比较*P<0.01；与肾衰组比较△P<0.01。
, http://www.100md.com 结果 ①肾组织细胞内IP3浓度：肾衰组较对照组增高，差异有极显著意义(P<0.01)；654-2治疗组较肾衰组明显下降，差异有极显著意义(P<0.001)。②肾组织细胞内[Ca2+]i浓度：肾衰组较对照组升高，差异有极显著意义(P<0.01)；654-2治疗组较肾衰组明显降低，差异有极显著意义(P<0.001)。③对照组的肾小管结构基本正常，近端肾小管腔面微绒毛排列紧密规则(见图1)。上皮细胞内各种细胞器结构清晰，基底面细胞膜内陷形成内褶，其间有大量纵行排行的线粒体 。细胞相邻面可见连热接复合体。肾衰组肾小管上皮细胞损伤严重(见图2)。部分肾小管上皮细胞膜破裂，有时可见整个细胞从基底上脱离，肾小管间质水肿明显，有较多白细胞浸润，并可见灶状出血和坏死。654-2组(见图3)肾小管上皮细胞轻度水肿，胞浆内线粒体轻度肿胀，部分线粒体嵴变短或消失。肾小管腔面微绒毛排列较规则。基底部质膜内褶缩短，基膜尚规则，部分小管腔内有絮状物堵塞。肾小管间质轻度水肿，无炎性细胞浸润。
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图1 对照组(EN×4000)
图2 肾衰组(EN×4000)
图3 654-2组(EN×3150)
3 讨论
本文采用缺血—再灌流方法制作缺血性急性肾功能衰竭模型获得成功[1]。电镜显示，肾衰组的病理损伤明显重于对照组，而654-2组病理损伤显著减轻。资料表明[4]，大量白细胞粘附、浸润于缺血区，介导释放自由基和其他氧的还原型产物是缺血性急性肾衰时组织损伤的重要原因之一。研究还表明[5]，完整细胞的脱落可能与细胞和细胞间、细胞和基质间粘附性减弱有关。认为缺血性急性肾衰时肾小管上皮系统完整性的破坏及其屏障功能的丧失不仅与以往公认的肾小管上皮细胞的坏死崩解有关，而且还可能与完整上皮细胞从肾小管基膜上的脱离有关。654-2组的病理与肾衰组比较，组织损伤明显减轻，而且发现654-2组既无白细胞的浸润，亦无完整细胞的脱离。说明654-2对防止急性肾衰时肾小管的损伤有确实的积极作用，并提示这一作用可能与654-2阻止白细胞浸润和改善细胞与细胞间，细胞与基质间的粘附性有关，微绒毛是维持肾小管功能的重要结构。正常微绒毛可使近端肾小管腔面的表面积增加40倍，从而大大增加了肾小管上皮细胞和小管液的接触面积，有利于被动重吸收物质的弥散，同时微绒毛表面还有多种载体，与某些物质的主动重吸收有关。654-2组微绒毛的状况明显好于急性肾衰组，说明654-2有保护微绒毛的作用。结果还显示，肾衰组肾组织细胞内[Ca2+]i明显升高，说明钙超负荷也是缺血性急性肾功能衰竭的重要发生机理之一。
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由于临床上病人常常于缺血发生后才到医院就诊，所以我们采用再灌注前2 min给药，使实验尽可能贴近临床。结果表明，给予654-2治疗后肾组织细胞内[Ca2+]i明显下降，说明654-2有减轻钙超负荷的作用，同时IP3浓度也显著下降，与肾衰未治疗组相比，差异均有极显著性意义。IP3为细胞内信息传递的第二信使，可特异性地诱发细胞内贮存钙池释放[Ca2+]i，也可以通过使内质网释放Ca2+而为Ca2+的内流提供信号，同时IP3的代谢产物IP4也具有促进外钙内流的作用。揭示：654-2减轻钙超负荷保护肾脏的作用与IP3的降低有关。其机理我们认为可能是通过阻断细胞表面M受体，继而抑制细胞内IP3产生所致。
国家自然科学基金资助课题(No.39170371)
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参考文献
1 刘晓城，汪琼玲，唐望先.缺血性急性肾功能衰竭时肾小管的超微病理变化.同济医科大学学报，1995，24(3)：196
2 刘晓城，唐望先，汪琼玲.三磷酸肌醇与钙超载在急性肾缺血及再灌流损伤中的作用.同济医科大学学报，1996，25(5)：344
3 李品兰.三磷酸肌醇在IL-2诱导的T细胞增殖分化中的信息传递作用.中国免疫学杂志，1990，6：338
4 张帆综述，王家马 龙审校.氧自由基与肝缺血再灌注损伤.国外医学消化系统疾病分册，1989，9(4)：199
5 候凡凡综述，张训审校.急性肾衰发病机理的新进展——肾小管上皮细胞粘附性改变.国外医学泌尿系统分册，1993，13(6)：263
(收稿：1999-03-24), http://www.100md.com