大黄提取液抗柯萨奇病毒B3的实验研究
作者：申元英 杨占秋 刘建军 邱雨石 肖红 文利 毛琳
单位：湖北医科大学病毒研究所 湖北430071
关键词：大黄提取液；柯萨奇病毒B3；细胞培养；抗病毒作用
北京中医药大学学报990525 摘要：采用微量细胞培养法观察细胞病变效应(Cytopathic effect，CPE)，测定经不同剂量大黄提取液作用后的病毒滴度，用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)检测药物作用后细胞冻融液中的病毒核酸(CVB-RNA)，研究大黄提取液的抗柯萨奇病毒B组(CVB)作用，探讨其抗病毒作用机制。结果：不同剂量大黄提取液和病毒作用后，细胞均出现CPE；不同剂量药物作用于细胞后，不能阻止CVB3感染； 当CVB3感染细胞后， 大黄提取液能阻止病毒增殖， 并表现出一定的量效关系， 其治疗指数(TI)＝10。提示大黄提取液不能直接杀灭CVB3，不能阻止CVB3吸附、穿入易感细胞，而通过阻止CVB3核酸复制或/和以后环节发挥抗病毒作用。
, http://www.100md.com
Anti-Coxsackievirus B3 Activity of Rheum Offinicale Extraction in Vitro
Shen Yuanying(申元英), Yang Zhanqiu(杨占秋), Liu Jianjun(刘建军), et al.
(Hubei Medical University, Hubei 430071)
ABSTRACT: To research antiviral effect of Rheum offinicale extraction on coxsackievirus B3 (CVB3 ) and elucidate its antiviral mechanism. Cytopathic effect (CPE) was observed and infectious virus was titered by micro-well cells culture, CVB-RNA was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) in Hep-2 cells supernatant. The results showed CPE can not be observed, infectious viral titer is less than 1 logarithm unit and CVB-RNA is detectable in 10-3 dilution of viral titered microwell at 8 μg/mL. These results suggested that Rheum offinicale extraction can interrupt viral biosynthese other than killing directly CVB3 or interfere in viral absorption and penetrance, especially can interrupt viral nucleic acid amplification or/and the last stage of viral replication cirle.
, 百拇医药
KEY WORDS: Rheum offinicale extraction; Coxsackievirus B3; Micro-well cells culture; Antiviral activity
柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus group B type 3，CVB3)是病毒性心肌炎的主要病原体[1，2]，病毒持续感染可导致扩张型心肌病[3，4]。目前，临床缺乏有效的抗病毒治疗药物。在研究大黄的抗病毒作用中，罗氏[5]等研究发现：大黄在动物体外、体内有抗疱疹病毒作用；为了寻找病毒性心肌炎新的治疗药物，我们进一步观察了大黄对CVB3的抗病毒作用。
1 材料
1.1 细胞：Hep-2细胞由武汉大学培养物保藏中心提供。细胞生长液为含10%新生牛血清RPMI-1640、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素，细胞维持液除含2%新生牛血清外，其他成分同细胞生长液。
, http://www.100md.com
1.2 病毒：CVB3为湖北医科大学病毒研究所保存。CVB3经Hep-2细胞增殖后滴定其滴度为107 TCID50/mL。
1.3 大黄提取液：由湖北中医学院程科力教授提供，经鉴定其有效成分为大黄素，1 μL提取液相当于生药1 μg。
1.4 引物：按参考文献[6]设计，其序列选自CVB基因组的5′非编码区(5′NC)，其序列及定位为：
CX1 5′-CCCCGGACTGAGTATCAATA-3′(180-199)
CX2 5′-GCAGTTAGGATTAGCCGCAT-3′(479-460)
, 百拇医药
引物由上海细胞生物研究所合成。
1.5 主要试剂：RPMI-1640、新生牛血清为GIBCO公司产品；禽类反转录酶(AMVRT)、RNA酶抑制剂(RNasin)、三磷酸脱氧核苷(dNTP)均为Promega公司产品；TaqDNA聚合酶为Biostar公司产品。
2 方法
2.1 药物毒性测定：分别按下列剂量将大黄有效成分提取液加入到含细胞维持液的Hep-2细胞孔：5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90 mg/L，每一药物剂量设4个重复孔，于37℃、5% CO2培养箱中培养3 d，每天观察细胞毒性。
2.2 体外抗病毒实验：拟定大黄对CVB3作用方式并分3个组。①药物直接作用组：将1000 TCID50/mL CVB3 0.1 mL/孔加入到含2、4、6、8、10 mg/L的大黄提取液中，37℃作用90 min，随后加到生长良好的Hep-2单层细胞孔中，37℃、5% CO2培养36 h后观察CPE；②药物抗病毒吸附组：分别将2、4、6、8、10 mg/L药液加到Hep-2单层细胞孔中，37℃吸附90 min，弃上清，再加1000 TCID50/mL CVB3 0.1 mL/孔，37℃吸附90 min后，弃上清，加细胞维持液，37℃、5% CO2培养36 h观察CPE；③药物抗病毒生物合成组：于Hep-2单层细胞孔中加入1000 TCID50/mL CVB3 0.1 mL/孔，37℃吸附90 min，弃上清，每孔加入含2、4、6、8、10 mg/L的含药物维持液，37℃、5% CO2培养36 h后观察CPE。每孔剂量设4个重复孔，同时设细胞对照及病毒对照。
, 百拇医药
2.3 病毒滴定：将各剂量药物抗病毒生物合成组细胞培养物冻融4次，各取0.1 mL按10-1稀释，滴定细胞冻融液中病毒滴度。
2.4 病毒核酸检测：取上述细胞冻融液0.2 mL，根据文献[6]方法抽提CVB3-RNA，逆转录合成cDNA，PCR扩增。扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射反射仪上观察，300碱基对(bp)处有橙色条带者为阳性。
3 结果
3.1 药物对Hep-2细胞的毒性试验：大黄对Hep-2细胞的半数中毒浓度(TD50)为40 mg/L。
3.2 药物抗病毒作用方式：①药物直接作用组：各细胞孔均出现细胞皱缩、变圆、碎裂、脱落等CPE。②药物抗病毒吸附组：各细胞亦均出现典型CPE。③药物抗病毒生物合成组：随药物剂量加大，细胞病变数减少，其中药物半数有效浓度(ED50)为4 mg/L，故其治疗指数
。
, 百拇医药
2.3 细胞冻融液中病毒滴度：见表1。
2.4 细胞冻融液中CVB3-RNA检测结果：见表1。
表1 大黄提取液对CVB3生物合成的影响 组别
药物剂量
mg/L
CPE
病毒滴度
CVB3-RNA
(阳性稀释度)
大黄提取液
2
, 百拇医药
+++
3.7
10-6
大黄提取液
4
++
2.5
10-6
大黄提取液
6
+
1.7
10-5
, 百拇医药
大黄提取液
8
-
<1
10-3
大黄提取液
10
-
<1
10-1
细胞对照
—
-
, 百拇医药
—
—
病毒对照
—
++++
6
10-6
注：+～++++分别表示25%、50%、75%、>80%的细胞出现CPE
3 讨论
大黄系蓼科多年生草本植物，分布很广，主要成分为蒽醌衍生物(含2%～4%)，主要包括大黄素、大黄酸、芦荟大黄素等。体外实验发现：大黄素、大黄酸和芦荟大黄素对葡萄球菌、链球菌、白喉杆菌、痢疾杆菌有较强的抗菌作有。抑制作用的原理为：蒽醌类衍生物对细菌核酸和蛋白质合成有明显抑制作用[8]。
, 百拇医药
本研究表明：大黄对Hep-2细胞的半数中毒剂量(TD50)为：40mg/L，而其抗病毒作用的半数有效剂量(ED50)为：4mg/L， 故其TI＝10。在大黄剂量为2～10 mg/L中，随药物浓度升高其细胞裂解液中病毒滴度逐渐下降，表现出量效关系。当药物剂量为8 mg/L时，细胞裂解中无病毒可检出。采用RT-PCR对病毒滴定之上清进行CVB3-RNA检测发现，随药物剂量加大，上清中可检出的滴度下降，说明大黄能有效抑制病毒核酸复制。由于病毒对照孔CVB3-RNA为阳性，细胞对照孔CVB3-RNA为阴性，说明RT-PCR具有高度特异性及敏感性。Schwaiger[9]等研究发现：采用RT-PCR可检出10个病毒颗粒的CVB-RNA，故RT-PCR可为临床药物疗效判断提供新的手段。
根据大黄对CVB3作用方式的结果，我们推测：①大黄不能直接杀灭CVB3；②大黄不能封闭细胞表面的CVB3受体，故不能阻止病毒吸附、穿入易感细胞；③大黄通过抑制CVB3核酸复制或/和以后环节发挥抗病毒作用。
, 百拇医药
湖北省教委资助项目(NO.98A051)
作者简介：申元英，女，36岁，医学硕士，讲师；现工作单位：云南大理医学院; 云南671000
参考文献
1 Mcmanus B M，Chow L H，Wilson J E，et al.Directed myocardial injury by enterovirus:A central role in the evolution of murine myocarditis. Clin Immunol ＆ Immunopathol,1993,68(2):159～169
2 Sato S, Tsntsumi R,Burne A, et al. Persistence of replicating Coxsackievirus B3 in the athymic murine heart is associated with development of myocarditis lesion. J Gen Virol,1994,75:2911～2924
, 百拇医药
3 Kandolf R, Kingel K, Zell R, et al. Molecular mechanisms in the path ogenesis of enterovirus heart disease: acute and persistent infection.Clin Immunol ＆ Immunopathol,1993,68(2):153～158
4 Androletti L, Hober D, Bocguart P, et al.Experimental CVB3-induced Chronic myocarditis in two murine strains:evidence of interrelationships between virus replication and myocardial damage in persistent cardiac infection. J Med Virol,1997,52:206～214
, 百拇医药
5 罗 军，陈安慎，杨占秋，等.中药大黄抗单纯疱疹病毒的实验研究.中华传染病杂志，1991，9(3)：160～163
6 Severini G M, Mestroni L, Falaschi A, et al.Nested Polymerase chain reaction for high sensitivity detection of enteroviral RNA in biological Samples. J Clin Microbiol,1993,31:1345～1349
7 宋婕萍，刘建军，杨占秋，等.RT-PCR检测CVB-RNA方法的建立.湖北医科大学学报，1998，19(4)：192～196
8 崔树德.中药大全.哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，1989.177～180
9 Schwalger A, Vmlauft F, Weyrer J, et al. Detection of enteroviral ribonucleic acid in myocardial biopsies from patients with idiopathic dilated cardiomyopathy by polymerase chain reaction. Am heart J,1993,126:406～416
收稿日期：1998-12-29, http://www.100md.com
单位：湖北医科大学病毒研究所 湖北430071
关键词：大黄提取液；柯萨奇病毒B3；细胞培养；抗病毒作用
北京中医药大学学报990525 摘要：采用微量细胞培养法观察细胞病变效应(Cytopathic effect，CPE)，测定经不同剂量大黄提取液作用后的病毒滴度，用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)检测药物作用后细胞冻融液中的病毒核酸(CVB-RNA)，研究大黄提取液的抗柯萨奇病毒B组(CVB)作用，探讨其抗病毒作用机制。结果：不同剂量大黄提取液和病毒作用后，细胞均出现CPE；不同剂量药物作用于细胞后，不能阻止CVB3感染； 当CVB3感染细胞后， 大黄提取液能阻止病毒增殖， 并表现出一定的量效关系， 其治疗指数(TI)＝10。提示大黄提取液不能直接杀灭CVB3，不能阻止CVB3吸附、穿入易感细胞，而通过阻止CVB3核酸复制或/和以后环节发挥抗病毒作用。
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Anti-Coxsackievirus B3 Activity of Rheum Offinicale Extraction in Vitro
Shen Yuanying(申元英), Yang Zhanqiu(杨占秋), Liu Jianjun(刘建军), et al.
(Hubei Medical University, Hubei 430071)
ABSTRACT: To research antiviral effect of Rheum offinicale extraction on coxsackievirus B3 (CVB3 ) and elucidate its antiviral mechanism. Cytopathic effect (CPE) was observed and infectious virus was titered by micro-well cells culture, CVB-RNA was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) in Hep-2 cells supernatant. The results showed CPE can not be observed, infectious viral titer is less than 1 logarithm unit and CVB-RNA is detectable in 10-3 dilution of viral titered microwell at 8 μg/mL. These results suggested that Rheum offinicale extraction can interrupt viral biosynthese other than killing directly CVB3 or interfere in viral absorption and penetrance, especially can interrupt viral nucleic acid amplification or/and the last stage of viral replication cirle.
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KEY WORDS: Rheum offinicale extraction; Coxsackievirus B3; Micro-well cells culture; Antiviral activity
柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus group B type 3，CVB3)是病毒性心肌炎的主要病原体[1，2]，病毒持续感染可导致扩张型心肌病[3，4]。目前，临床缺乏有效的抗病毒治疗药物。在研究大黄的抗病毒作用中，罗氏[5]等研究发现：大黄在动物体外、体内有抗疱疹病毒作用；为了寻找病毒性心肌炎新的治疗药物，我们进一步观察了大黄对CVB3的抗病毒作用。
1 材料
1.1 细胞：Hep-2细胞由武汉大学培养物保藏中心提供。细胞生长液为含10%新生牛血清RPMI-1640、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素，细胞维持液除含2%新生牛血清外，其他成分同细胞生长液。
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1.2 病毒：CVB3为湖北医科大学病毒研究所保存。CVB3经Hep-2细胞增殖后滴定其滴度为107 TCID50/mL。
1.3 大黄提取液：由湖北中医学院程科力教授提供，经鉴定其有效成分为大黄素，1 μL提取液相当于生药1 μg。
1.4 引物：按参考文献[6]设计，其序列选自CVB基因组的5′非编码区(5′NC)，其序列及定位为：
CX1 5′-CCCCGGACTGAGTATCAATA-3′(180-199)
CX2 5′-GCAGTTAGGATTAGCCGCAT-3′(479-460)
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引物由上海细胞生物研究所合成。
1.5 主要试剂：RPMI-1640、新生牛血清为GIBCO公司产品；禽类反转录酶(AMVRT)、RNA酶抑制剂(RNasin)、三磷酸脱氧核苷(dNTP)均为Promega公司产品；TaqDNA聚合酶为Biostar公司产品。
2 方法
2.1 药物毒性测定：分别按下列剂量将大黄有效成分提取液加入到含细胞维持液的Hep-2细胞孔：5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90 mg/L，每一药物剂量设4个重复孔，于37℃、5% CO2培养箱中培养3 d，每天观察细胞毒性。
2.2 体外抗病毒实验：拟定大黄对CVB3作用方式并分3个组。①药物直接作用组：将1000 TCID50/mL CVB3 0.1 mL/孔加入到含2、4、6、8、10 mg/L的大黄提取液中，37℃作用90 min，随后加到生长良好的Hep-2单层细胞孔中，37℃、5% CO2培养36 h后观察CPE；②药物抗病毒吸附组：分别将2、4、6、8、10 mg/L药液加到Hep-2单层细胞孔中，37℃吸附90 min，弃上清，再加1000 TCID50/mL CVB3 0.1 mL/孔，37℃吸附90 min后，弃上清，加细胞维持液，37℃、5% CO2培养36 h观察CPE；③药物抗病毒生物合成组：于Hep-2单层细胞孔中加入1000 TCID50/mL CVB3 0.1 mL/孔，37℃吸附90 min，弃上清，每孔加入含2、4、6、8、10 mg/L的含药物维持液，37℃、5% CO2培养36 h后观察CPE。每孔剂量设4个重复孔，同时设细胞对照及病毒对照。
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2.3 病毒滴定：将各剂量药物抗病毒生物合成组细胞培养物冻融4次，各取0.1 mL按10-1稀释，滴定细胞冻融液中病毒滴度。
2.4 病毒核酸检测：取上述细胞冻融液0.2 mL，根据文献[6]方法抽提CVB3-RNA，逆转录合成cDNA，PCR扩增。扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射反射仪上观察，300碱基对(bp)处有橙色条带者为阳性。
3 结果
3.1 药物对Hep-2细胞的毒性试验：大黄对Hep-2细胞的半数中毒浓度(TD50)为40 mg/L。
3.2 药物抗病毒作用方式：①药物直接作用组：各细胞孔均出现细胞皱缩、变圆、碎裂、脱落等CPE。②药物抗病毒吸附组：各细胞亦均出现典型CPE。③药物抗病毒生物合成组：随药物剂量加大，细胞病变数减少，其中药物半数有效浓度(ED50)为4 mg/L，故其治疗指数
。, 百拇医药
2.3 细胞冻融液中病毒滴度：见表1。
2.4 细胞冻融液中CVB3-RNA检测结果：见表1。
表1 大黄提取液对CVB3生物合成的影响 组别
药物剂量
mg/L
CPE
病毒滴度
CVB3-RNA
(阳性稀释度)
大黄提取液
2
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3.7
10-6
大黄提取液
4
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2.5
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大黄提取液
6
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大黄提取液
8
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大黄提取液
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细胞对照
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病毒对照
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6
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注：+～++++分别表示25%、50%、75%、>80%的细胞出现CPE
3 讨论
大黄系蓼科多年生草本植物，分布很广，主要成分为蒽醌衍生物(含2%～4%)，主要包括大黄素、大黄酸、芦荟大黄素等。体外实验发现：大黄素、大黄酸和芦荟大黄素对葡萄球菌、链球菌、白喉杆菌、痢疾杆菌有较强的抗菌作有。抑制作用的原理为：蒽醌类衍生物对细菌核酸和蛋白质合成有明显抑制作用[8]。
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本研究表明：大黄对Hep-2细胞的半数中毒剂量(TD50)为：40mg/L，而其抗病毒作用的半数有效剂量(ED50)为：4mg/L， 故其TI＝10。在大黄剂量为2～10 mg/L中，随药物浓度升高其细胞裂解液中病毒滴度逐渐下降，表现出量效关系。当药物剂量为8 mg/L时，细胞裂解中无病毒可检出。采用RT-PCR对病毒滴定之上清进行CVB3-RNA检测发现，随药物剂量加大，上清中可检出的滴度下降，说明大黄能有效抑制病毒核酸复制。由于病毒对照孔CVB3-RNA为阳性，细胞对照孔CVB3-RNA为阴性，说明RT-PCR具有高度特异性及敏感性。Schwaiger[9]等研究发现：采用RT-PCR可检出10个病毒颗粒的CVB-RNA，故RT-PCR可为临床药物疗效判断提供新的手段。
根据大黄对CVB3作用方式的结果，我们推测：①大黄不能直接杀灭CVB3；②大黄不能封闭细胞表面的CVB3受体，故不能阻止病毒吸附、穿入易感细胞；③大黄通过抑制CVB3核酸复制或/和以后环节发挥抗病毒作用。
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湖北省教委资助项目(NO.98A051)
作者简介：申元英，女，36岁，医学硕士，讲师；现工作单位：云南大理医学院; 云南671000
参考文献
1 Mcmanus B M，Chow L H，Wilson J E，et al.Directed myocardial injury by enterovirus:A central role in the evolution of murine myocarditis. Clin Immunol ＆ Immunopathol,1993,68(2):159～169
2 Sato S, Tsntsumi R,Burne A, et al. Persistence of replicating Coxsackievirus B3 in the athymic murine heart is associated with development of myocarditis lesion. J Gen Virol,1994,75:2911～2924
, 百拇医药
3 Kandolf R, Kingel K, Zell R, et al. Molecular mechanisms in the path ogenesis of enterovirus heart disease: acute and persistent infection.Clin Immunol ＆ Immunopathol,1993,68(2):153～158
4 Androletti L, Hober D, Bocguart P, et al.Experimental CVB3-induced Chronic myocarditis in two murine strains:evidence of interrelationships between virus replication and myocardial damage in persistent cardiac infection. J Med Virol,1997,52:206～214
, 百拇医药
5 罗 军，陈安慎，杨占秋，等.中药大黄抗单纯疱疹病毒的实验研究.中华传染病杂志，1991，9(3)：160～163
6 Severini G M, Mestroni L, Falaschi A, et al.Nested Polymerase chain reaction for high sensitivity detection of enteroviral RNA in biological Samples. J Clin Microbiol,1993,31:1345～1349
7 宋婕萍，刘建军，杨占秋，等.RT-PCR检测CVB-RNA方法的建立.湖北医科大学学报，1998，19(4)：192～196
8 崔树德.中药大全.哈尔滨：黑龙江科学技术出版社，1989.177～180
9 Schwalger A, Vmlauft F, Weyrer J, et al. Detection of enteroviral ribonucleic acid in myocardial biopsies from patients with idiopathic dilated cardiomyopathy by polymerase chain reaction. Am heart J,1993,126:406～416
收稿日期：1998-12-29, http://www.100md.com