血瘀证兔模型血管内皮细胞培养的形态结构改变初探*
作者：陈云波 王 奇 王培训 程淑意 赖世隆 叶正中
单位：陈云波 王 奇 王培训 程淑意 赖世隆(广州中医药大学 广州 510405)；叶正中(广州医学院电镜室 广州 510180)
关键词：血瘀/病理生理学；血管内皮细胞；细胞培养；疾病模型；动物
中国中医基础医学杂志990506 摘 要 目的 探讨血瘀证兔模型血管内皮细胞培养的形态结构改变及建立血瘀证细胞损伤模型的可行性。方法 从兔血瘀证模型直接取材主动脉，进行内皮细胞培养，通过光镜与电镜观察原代和传代培养的内皮细胞形态结构。结果 造型兔原代培养的内皮细胞融合后，光镜下发现呈多角形镶嵌状紧密排列，细胞质中可见有暗色颗粒，极少数细胞形状巨大及混杂有一定数量的平滑肌细胞。电镜检查发现胞体内饮液泡数量增多，少数细胞核形状扭曲，线粒体结构肿胀欠清晰，内质网扩张呈空泡状。且造型兔细胞生长较缓慢，至融合状态的时间较正常兔长。结论 提示造型兔原代培养的血管内皮细胞出现病理性损伤，为建立血瘀证的细胞损伤模型提供了部分实验依据。
, 百拇医药
Preliminary morphological changes on culture of the vascular
endothelial cells from Xueyu-syndrome model in rabbits
Chen Yunbo, Wang Qi, Wang Peixun, et al
(Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405)
Abstract:Objective:To explore morphological changes on culture of the vascular endothelial cells from Xueyu-syndrome model in rabbits.Methods:Endothelial cells obtained from rabbit′s aorta with Xueyu-syndrome model were cultured and identified by light microscopic,electron microscopy and immunofluorescence for rabbits antihuman Ⅷ factor serum.Light microscopic and electron microscopy observed the primary cultured and subcultured endothelial cells.Results:The primary cultured endothelial cells from Xueyu-syndrome model rabbits were round to polygonal in shape,and displayed cobblestone appearance typical for endothelial cells.These cells contained dark granules in the cytoplasm.A few giant endothelial cells and smooth muscle cells were present among typical endothelial cells.Electron microscopic observation revealed that the quantities of endocellular pinocytotic vesicles increased.In a few endothelial cells,nucleusese were distorted in shape,mitochondria swollen in formation and fuzzy,endoplasmic reticula dilated to hollow vesicle in shape.Cell growth of endothelial cells from Xueyu-syndrome model rabbits was slower than that of endothelial cells from normal rabbits.Conclusion:These findings suggest that there is the pathological injury occurring in primary cultured endothelial cells and also provide experimental data for the cellular model of Xueyu-syndrome.
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Key words: Blood stasis, Pathophysiology Vascular endothelial cell Cell culture Disease models,Animal
血瘀证实质的研究在中医、中西医领域一直受到广泛关注，在功能与形态方面均取得了较大的进展。我们以往的研究证实血瘀证动物病理状态的形成与血管内皮细胞的损伤有密切的关系[1]。但其损伤的确切机制仍有很多问题尚未阐明。本研究运用细胞培养方法，从血瘀证兔模型直接取材主动脉内皮细胞进行培养，通过光镜与电镜观察，以探讨血瘀证血管内皮细胞的形态结构、生长特征等变化及用内皮细胞培养方法建立血瘀证细胞模型的可行性。
材料与方法
1 材料
1.1 实验动物 新西兰纯种兔，雄性，体重1kg左右，购自广东省卫生厅医用实验动物场。
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1.2 试剂 199培养液，购自GIBCO公司，批号：60N5315。胎牛血清、超级新生牛血清由杭州四季青生物工程材料研究所提供，批号：930315。胶原酶Ⅱ型购自SIGMA公司，批号：30H6812。胰蛋白酶购自EML公司，批号：210294。兔抗人第Ⅷ因子相关抗原抗血清由上海生物制品研究所提供。羊抗兔IgG荧光抗体由军事医科院微生物流行病研究所提供，批号：9305。牛血清白蛋白由新疆生化厂生产，批号：891211。去甲肾上腺素由广州明兴制药厂生产，批号：920916-1。
2 方法
2.1 动物分组及造型 20只新西兰兔随机均分为正常对照组和血瘀造型组。按我们以前报道的血瘀证兔模型造型方法[2]，于兔耳静脉缓慢注射去甲肾上腺素0.1mg/kg/日，连续20d；于造模第1天同时静注牛血清白蛋白250mg/kg，间隔10d，再注射1次，共2次。正常对照组于同期注射等量生理盐水。
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2.2 原代内皮细胞培养 每次实验取造型组和对照组新西兰兔各1只，分别分离出主动脉，置于含抗菌素的Hank’s液中，用眼科镊翻转主动脉，使血管内膜朝外，结扎主动脉两端，装入盛有0.125%胰蛋白酶的离心管中，37℃水浴振荡5min，用玻棒将主动脉挑入含0.1%胶原酶的离心管中，水浴振荡15min。将两支含细胞液的离心管800～1000r/min离心5min，去上清液。用含10%小牛血清199培养液洗涤细胞，再离心一次，倾去上清液。
用2ml含20%胎牛血清199培养液稀释细胞，计细胞数，调整达5万～10万/ml，使消化后的正常和造型组内皮细胞数目大致相等。以3ml细胞液种于直径35mm塑料培养皿(Nuclon公司)，在5%CO2培养箱中(37℃)静置培养。
2.3 细胞传代培养 细胞原代培养8d～10d后，细胞呈单层密集生长近亚融合时，进行传代繁殖。传代时，将细胞数调至10万/ml～15万/ml左右。
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2.4 细胞冻存和复苏 细胞悬液用含10%二甲基亚砜的199培养液吹打制成单细胞悬液，使密度为50万/ml～100万/mL将1ml悬液封存于塑料冷冻管内，置4℃1h，20℃30min，-70℃30min，再放入液氮中储存。
复苏 从液氮中取出冷冻管，迅速放入39℃温水中融化，然后在无菌条件下将细胞悬液吸入离心管中，离心去上清液，除去二甲基亚砜，换入20%胎牛血清199培养液，稀释细胞数为20万/ml，以3ml细胞液接种于培养瓶内，置37℃5%CO2温箱中静置培养。
2.5 内皮细胞生长率的测定 传代培养至第五代的正常组、造型组内皮细胞制备细胞悬液，使其密度约为6.5万/ml，接种于16个15ml培养瓶内，每瓶2ml。在1d～8d内，每天收集2瓶细胞进行消化，计细胞数取其平均值，在坐标纸上绘制曲线。
2.6 内皮细胞的鉴定[3]及形态学观察
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2.6.1 倒置显微镜观察内皮细胞的形态学和生长特征
2.6.2 电镜检查 原代或传代的兔内皮细胞生长成单层时，用0.25%胰蛋白酶与0.04%EDTA等量混合消化单层细胞1min，离心去上清。加2.5%戊二醛固定2h，进行常规透射电镜制样后，于日电JEM-100CXⅡ/T透射电镜观察。扫描电镜样品经临界点干燥、离子镀膜制成后，于日电JSM-J300型扫描电镜观察。
2.6.3 第Ⅷ因子间接免疫荧光检查 将造型组内皮细胞传代培养于4片盖玻片上，用PBS轻轻冲洗，丙酮固定15min后再用PBS冲洗3次，加兔抗人第Ⅷ因子相关抗原抗血清(原液1∶4稀释)37℃孵育60min。用PBS再洗3次，滤纸吸干，加羊抗兔IgG荧光抗体(原液1∶16稀释)37℃，30min，PBS冲洗吸干，用纯甘油和PBS按1∶9配制的缓冲液封片检查。以上程序中免去兔抗人第Ⅷ因子血清处理的为对照1，免去羊抗兔IgG荧光抗体处理的为对照2，只加PBS孵育的为对照3。以上玻片在荧光显微镜(Nikon LABOPHOT附ET-D)下检查，高压汞灯光源为HBO100W/L，滤色块为B，主波长495nm。
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结果
1 原代培养内皮细胞的形态学特征
1.1 倒置显微镜观察正常对照组原代培养的内皮细胞，初为圆形或椭圆形，单个或数十个成团沉于培养皿底部。静置培养24小时换液后，视野下可见由数个或数十个数量不均匀的贴壁细胞组成大小不同的多边形“集落”。细胞透明呈扁平状、多角形镶嵌状紧密排列，胞核居中明显，无重叠生长现象，偶见极少量长棱形纤维细胞(图1)。等量种植的造型组内皮细胞，初始镜下观察有较多的细胞碎片，细胞成团现象少于对照组。24h换液后，视野下贴壁细胞数量较少，细胞集落较小，集落中细胞轮廓比对照组明显，部分内皮细胞的胞质中可见有暗色颗粒，极少数细胞形状巨大，有一定数量的平滑肌细胞混杂于内皮细胞集落之间(图2)。
1.2 扫描和透射电镜观察 扫描电镜观察，正常组贴壁内皮细胞呈薄片状多角形或短梭形，细胞表面有少量丝状突起。核微隆起，呈椭圆形，有的细胞核有两个以上的核仁(图3)。造型组贴壁内皮细胞中间杂一些有较粗大指状突起的内皮细胞。质膜面可见有小泡状突起或小泡状凹陷及细长的长沟(图4)。透射电镜观察到正常组内皮细胞表面有较丰富的微绒毛，胞质内含有数量不同、大小不等的吞饮泡，有一定数目的线粒体，并可见粗、滑面内质网及核糖体、少量高尔基体(图5)。未见到Weibel氏小体。核形态多样，有圆形、椭圆形。有较长的微丝束分布于胞浆内。造型组内皮细胞表面部分微绒毛末端膨大，多数内皮细胞质内吞饮泡数量较多，少数基质密度不密均，核形态除椭圆形外，还有一些呈扭曲、凹陷或不规则形。部分内皮细胞线粒体数目较少，结构肿胀欠清晰，粗面内质网数目少并有扩张，平滑内质网明显扩张呈空泡状(图6)。未见到Weibel氏小体。有少数细胞有密体、密斑样结构，说明混杂有平滑肌细胞。
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2 传代培养内皮细胞的形态学特征
2.1 倒置显微镜观察 正常组第5代的内皮细胞呈扁平的长梭形和多角形，还可见到一些较大的椭圆形细胞，镶嵌状排列，彼此不重叠，整个视野大多数内皮细胞形状要比原代培养的略大(图7)。造型组传代培养的内皮细胞形态与正常组基本类似，少数未融合的细胞边缘呈指状，胞浆丰富。仍混杂少量的平滑肌细胞(图8)。
2.2 扫描和透射电镜观察 扫描电镜观察正常组传代培养的大多数内皮细胞与原代培养的类似，但一些内皮细胞有指状突起(图9)。造型组传代后的内皮细胞形状大小较一致，指状突起的内皮细胞比原代培养的减少，胞核大多微隆起(图10)。透射电镜观察正常组传代培养的内皮细胞内部结构与原代培养的基本相似，造型组传代后内皮细胞中的吞饮泡的数量比原代减少，核多呈肾形或椭圆形，大多可见到一定数量的粗面内质网(图11)。
3 第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检查
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荧光显微镜下可见细胞核周呈黄绿色发亮荧光环，胞浆为淡黄绿色，细胞轮廓清楚(图12)。作为对照的内皮细胞各片子中，偶见发亮的自发荧光斑点，未见细胞轮廓，证明培养的细胞为内皮细胞。
图1～12 血瘀证兔模型血管内皮细胞培养的形态结构改变
4 原代和传代内皮细胞的生长特点
正常组主动脉消化后细胞数目为24.83±7.99万/每只兔(n=10)，造型组主动脉消化后细胞数目为31.65±7.17万/每只兔(n=10)。Wilcoxon秩和检验，P=0.045。
正常组原代培养的内皮细胞在培养瓶中静止2h～3h后，已有部分粘附、贴壁，8小时大部分细胞粘附，少数细胞开始伸展，到24小时左右细胞全部伸展，并开始分裂。接种时未分散的成团内皮细胞所形成的多边形集落生长较快，培养4d～6d后，细胞生长迅速，集落增大，某些数量较多的细胞集落之间接近融合；到7d～8d，整个培养皿底细胞近亚融合或融合状态。造型组的内皮细胞生长较缓慢，至融合状态一般需12d～13d。
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正常组传代培养的内皮细胞在培养瓶中静置0.5h～1h左右，开始贴壁生长，至3d～4d，瓶底内皮细胞已近融合状态。测定第5代内皮细胞的生长率表明，内皮细胞的生长高峰在2d～7d。冻存复苏内皮细胞的生长特点与传代内皮细胞的相似。造型组第五代内皮细胞的生长潜伏期、指数增长期和生长稳定期均比同代的对照组要推迟1d～2d(图13)。
图13 第五代内皮细胞的生长曲线
讨论
目前，血瘀证实验研究多进行在体实验研究，至今已复制多种血瘀证动物模型。以往我们也用去甲肾上腺素、牛血清白蛋白诱发慢性血瘀证兔模型，并用于活血化瘀方药的研究[4]。这些研究对探讨血瘀证实质及活血化瘀方药的作用机理起到了积极的推动作用。但由于在体实验受神经、体液等因素的影响，使其对血瘀证实质及活血化瘀方药作用机理的阐明受到一定的限制，而细胞培养技术可人为控制、干预各种影响因素，观察处理因素对细胞、组织的直接作用，弥补在体实验之不足。两者相互结合、补充，可使血瘀证实质及活血化瘀方药的作用机理研究更深入、更全面[5、6]。用内皮细胞培养方法进行疾病的发病机理或药物作用机理的研究，国内外已有较多的报道。目前大多数人均从正常动物或人身上取材、培养，然后在培养的内皮细胞中加入高脂血清等处理因素造成细胞的病理损伤。这些研究方法发展至今已较为成熟、稳定，仍发挥着重要的作用。但其不足之处是这种病理性损伤不能直接反应体内的病理状态。
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本研究从已造模的整体血瘀证兔主动脉直接取材，进行细胞培养，并与正常兔主动脉血管内皮细胞培养进行对照，观察“血瘀证”兔模型主动脉内皮细胞原代和传代培养后的形态学改变(有关培养的内皮细胞分泌血管活性物质的研究将在另文发表)，以期观察的结果能保持血瘀证的整体病理特征，更为接近体内的病理状态。此外，本研究每次实验用一个动物取材进行培养，有助于排除个体差异及其他影响因素。
与正常兔比较，造型兔原代细胞培养发现大多数内皮细胞饮液泡数量增多，部分内皮细胞胞质内有暗色颗粒，胞核形状扭曲，线粒体结构肿胀欠清晰，内质网扩张呈空泡状，提示造型兔原代培养融合的内皮细胞损伤，这与血瘀证整体动物模型的病理改变相一致[1]。尤其是部分内皮细胞体积增大，与Tokunaga用动脉粥样硬化病人的内皮细胞进行培养所观察到的含有巨大变异细胞结果相近[7]，但本研究未发现有多核细胞。造型兔主动脉消化后得到的细胞数比正常兔多，也提示由于造型兔主动脉内膜的病理损伤，使胰蛋白酶和胶原酶消化后脱落的内皮细胞的数量增多。造型组在原代培养时生长缓慢，至融合状态的时间比正常组平均要长5天，培养至第五代时内皮细胞的生长曲线表明造型组内皮细胞的生长速度已逐渐接近正常组。
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本实验内皮细胞传代结果表明，原代培养时内皮细胞所表现的病理特征并未随传代而得以完全保留，损伤的内皮细胞随着细胞传代而被逐渐淘汰，这是否是由于细胞生长过程中其自身的新陈代谢作用及培养液中所含的营养因素如胎牛血清等导致细胞的自我修复，尚有待进一步研究。
综上所述，造型兔的主动脉内皮细胞易于消化，原代培养时内皮细胞生长减慢，出现病理性损伤，细胞传代后具有一定的自我修复能力。我们的研究结果对血瘀证的实质研究提供了进一步的实验依据，并为建立血瘀证的细胞损伤模型进行了有益的尝试。
致谢：本研究得到上海第二医科大学黄桂秋、徐德敏老师，上海医科大学陈思白老师，中山医科大学刘青老师及解放军总医院景京同志的大力支持和帮助，在此致以衷心感谢。
* 本项目为国家自然科学基金、国家中医药管理局及广东省自然科学基金资助
作者简介：陈云波，男，35岁，讲师。1986年毕业于华南师范大学生物系。现在广州中医药大学临床流行病学应用研究室从事老年脑病及证候的中西医结合基础研究工作。
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参考文献
[1] 王奇，郑忠，梁伟雄，等.“血瘀证”兔模型的组织形态学观察.中西医结合杂志(基础理论研究特集).1993；1：306～308
[2] 赖世隆，王奇，梁伟雄，等.去甲肾上腺素、牛血清白蛋白诱发血瘀证动物模型的研究.广州中医学院学报 1993；10(4)：206～210
[3] Jaffe EA,Nachman RL,Becker CG,et al.Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins-Identification by morphological and immundogic criteria.J Clin Inverst 1973;52:2754～2756
[4] 王奇，梁伟雄，谭芬来，等.活血化瘀复方对血瘀证兔模型作用的实验研究.中药新药与临床药理 1991；2(2)：37～40
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[5] 陈云波，王奇，赖世隆.从血管内皮细胞功能改变看血瘀证实质及活血化瘀机理.中国中医基础医学杂志 1996；2(1)：37～38
[6] 李连达.组织和细胞培养技术的应用.陈可冀等主编.血瘀证与活血化瘀研究.第1版.上海：上海科技出版社，1990：103～109
[7] Tokunaga O,Fan J,Watanaba T.Atherosclerosis-and age-related mulitinucleated variant endothelial cells in primary culture from human aorta.Am J Pathol.1989:135:967～76
(收稿日期 1999—12—03 修回日期 1999—02—30), http://www.100md.com
单位：陈云波 王 奇 王培训 程淑意 赖世隆(广州中医药大学 广州 510405)；叶正中(广州医学院电镜室 广州 510180)
关键词：血瘀/病理生理学；血管内皮细胞；细胞培养；疾病模型；动物
中国中医基础医学杂志990506 摘 要 目的 探讨血瘀证兔模型血管内皮细胞培养的形态结构改变及建立血瘀证细胞损伤模型的可行性。方法 从兔血瘀证模型直接取材主动脉，进行内皮细胞培养，通过光镜与电镜观察原代和传代培养的内皮细胞形态结构。结果 造型兔原代培养的内皮细胞融合后，光镜下发现呈多角形镶嵌状紧密排列，细胞质中可见有暗色颗粒，极少数细胞形状巨大及混杂有一定数量的平滑肌细胞。电镜检查发现胞体内饮液泡数量增多，少数细胞核形状扭曲，线粒体结构肿胀欠清晰，内质网扩张呈空泡状。且造型兔细胞生长较缓慢，至融合状态的时间较正常兔长。结论 提示造型兔原代培养的血管内皮细胞出现病理性损伤，为建立血瘀证的细胞损伤模型提供了部分实验依据。
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Preliminary morphological changes on culture of the vascular
endothelial cells from Xueyu-syndrome model in rabbits
Chen Yunbo, Wang Qi, Wang Peixun, et al
(Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405)
Abstract:Objective:To explore morphological changes on culture of the vascular endothelial cells from Xueyu-syndrome model in rabbits.Methods:Endothelial cells obtained from rabbit′s aorta with Xueyu-syndrome model were cultured and identified by light microscopic,electron microscopy and immunofluorescence for rabbits antihuman Ⅷ factor serum.Light microscopic and electron microscopy observed the primary cultured and subcultured endothelial cells.Results:The primary cultured endothelial cells from Xueyu-syndrome model rabbits were round to polygonal in shape,and displayed cobblestone appearance typical for endothelial cells.These cells contained dark granules in the cytoplasm.A few giant endothelial cells and smooth muscle cells were present among typical endothelial cells.Electron microscopic observation revealed that the quantities of endocellular pinocytotic vesicles increased.In a few endothelial cells,nucleusese were distorted in shape,mitochondria swollen in formation and fuzzy,endoplasmic reticula dilated to hollow vesicle in shape.Cell growth of endothelial cells from Xueyu-syndrome model rabbits was slower than that of endothelial cells from normal rabbits.Conclusion:These findings suggest that there is the pathological injury occurring in primary cultured endothelial cells and also provide experimental data for the cellular model of Xueyu-syndrome.
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血瘀证实质的研究在中医、中西医领域一直受到广泛关注，在功能与形态方面均取得了较大的进展。我们以往的研究证实血瘀证动物病理状态的形成与血管内皮细胞的损伤有密切的关系[1]。但其损伤的确切机制仍有很多问题尚未阐明。本研究运用细胞培养方法，从血瘀证兔模型直接取材主动脉内皮细胞进行培养，通过光镜与电镜观察，以探讨血瘀证血管内皮细胞的形态结构、生长特征等变化及用内皮细胞培养方法建立血瘀证细胞模型的可行性。
材料与方法
1 材料
1.1 实验动物 新西兰纯种兔，雄性，体重1kg左右，购自广东省卫生厅医用实验动物场。
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1.2 试剂 199培养液，购自GIBCO公司，批号：60N5315。胎牛血清、超级新生牛血清由杭州四季青生物工程材料研究所提供，批号：930315。胶原酶Ⅱ型购自SIGMA公司，批号：30H6812。胰蛋白酶购自EML公司，批号：210294。兔抗人第Ⅷ因子相关抗原抗血清由上海生物制品研究所提供。羊抗兔IgG荧光抗体由军事医科院微生物流行病研究所提供，批号：9305。牛血清白蛋白由新疆生化厂生产，批号：891211。去甲肾上腺素由广州明兴制药厂生产，批号：920916-1。
2 方法
2.1 动物分组及造型 20只新西兰兔随机均分为正常对照组和血瘀造型组。按我们以前报道的血瘀证兔模型造型方法[2]，于兔耳静脉缓慢注射去甲肾上腺素0.1mg/kg/日，连续20d；于造模第1天同时静注牛血清白蛋白250mg/kg，间隔10d，再注射1次，共2次。正常对照组于同期注射等量生理盐水。
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2.2 原代内皮细胞培养 每次实验取造型组和对照组新西兰兔各1只，分别分离出主动脉，置于含抗菌素的Hank’s液中，用眼科镊翻转主动脉，使血管内膜朝外，结扎主动脉两端，装入盛有0.125%胰蛋白酶的离心管中，37℃水浴振荡5min，用玻棒将主动脉挑入含0.1%胶原酶的离心管中，水浴振荡15min。将两支含细胞液的离心管800～1000r/min离心5min，去上清液。用含10%小牛血清199培养液洗涤细胞，再离心一次，倾去上清液。
用2ml含20%胎牛血清199培养液稀释细胞，计细胞数，调整达5万～10万/ml，使消化后的正常和造型组内皮细胞数目大致相等。以3ml细胞液种于直径35mm塑料培养皿(Nuclon公司)，在5%CO2培养箱中(37℃)静置培养。
2.3 细胞传代培养 细胞原代培养8d～10d后，细胞呈单层密集生长近亚融合时，进行传代繁殖。传代时，将细胞数调至10万/ml～15万/ml左右。
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2.4 细胞冻存和复苏 细胞悬液用含10%二甲基亚砜的199培养液吹打制成单细胞悬液，使密度为50万/ml～100万/mL将1ml悬液封存于塑料冷冻管内，置4℃1h，20℃30min，-70℃30min，再放入液氮中储存。
复苏 从液氮中取出冷冻管，迅速放入39℃温水中融化，然后在无菌条件下将细胞悬液吸入离心管中，离心去上清液，除去二甲基亚砜，换入20%胎牛血清199培养液，稀释细胞数为20万/ml，以3ml细胞液接种于培养瓶内，置37℃5%CO2温箱中静置培养。
2.5 内皮细胞生长率的测定 传代培养至第五代的正常组、造型组内皮细胞制备细胞悬液，使其密度约为6.5万/ml，接种于16个15ml培养瓶内，每瓶2ml。在1d～8d内，每天收集2瓶细胞进行消化，计细胞数取其平均值，在坐标纸上绘制曲线。
2.6 内皮细胞的鉴定[3]及形态学观察
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2.6.1 倒置显微镜观察内皮细胞的形态学和生长特征
2.6.2 电镜检查 原代或传代的兔内皮细胞生长成单层时，用0.25%胰蛋白酶与0.04%EDTA等量混合消化单层细胞1min，离心去上清。加2.5%戊二醛固定2h，进行常规透射电镜制样后，于日电JEM-100CXⅡ/T透射电镜观察。扫描电镜样品经临界点干燥、离子镀膜制成后，于日电JSM-J300型扫描电镜观察。
2.6.3 第Ⅷ因子间接免疫荧光检查 将造型组内皮细胞传代培养于4片盖玻片上，用PBS轻轻冲洗，丙酮固定15min后再用PBS冲洗3次，加兔抗人第Ⅷ因子相关抗原抗血清(原液1∶4稀释)37℃孵育60min。用PBS再洗3次，滤纸吸干，加羊抗兔IgG荧光抗体(原液1∶16稀释)37℃，30min，PBS冲洗吸干，用纯甘油和PBS按1∶9配制的缓冲液封片检查。以上程序中免去兔抗人第Ⅷ因子血清处理的为对照1，免去羊抗兔IgG荧光抗体处理的为对照2，只加PBS孵育的为对照3。以上玻片在荧光显微镜(Nikon LABOPHOT附ET-D)下检查，高压汞灯光源为HBO100W/L，滤色块为B，主波长495nm。
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结果
1 原代培养内皮细胞的形态学特征
1.1 倒置显微镜观察正常对照组原代培养的内皮细胞，初为圆形或椭圆形，单个或数十个成团沉于培养皿底部。静置培养24小时换液后，视野下可见由数个或数十个数量不均匀的贴壁细胞组成大小不同的多边形“集落”。细胞透明呈扁平状、多角形镶嵌状紧密排列，胞核居中明显，无重叠生长现象，偶见极少量长棱形纤维细胞(图1)。等量种植的造型组内皮细胞，初始镜下观察有较多的细胞碎片，细胞成团现象少于对照组。24h换液后，视野下贴壁细胞数量较少，细胞集落较小，集落中细胞轮廓比对照组明显，部分内皮细胞的胞质中可见有暗色颗粒，极少数细胞形状巨大，有一定数量的平滑肌细胞混杂于内皮细胞集落之间(图2)。
1.2 扫描和透射电镜观察 扫描电镜观察，正常组贴壁内皮细胞呈薄片状多角形或短梭形，细胞表面有少量丝状突起。核微隆起，呈椭圆形，有的细胞核有两个以上的核仁(图3)。造型组贴壁内皮细胞中间杂一些有较粗大指状突起的内皮细胞。质膜面可见有小泡状突起或小泡状凹陷及细长的长沟(图4)。透射电镜观察到正常组内皮细胞表面有较丰富的微绒毛，胞质内含有数量不同、大小不等的吞饮泡，有一定数目的线粒体，并可见粗、滑面内质网及核糖体、少量高尔基体(图5)。未见到Weibel氏小体。核形态多样，有圆形、椭圆形。有较长的微丝束分布于胞浆内。造型组内皮细胞表面部分微绒毛末端膨大，多数内皮细胞质内吞饮泡数量较多，少数基质密度不密均，核形态除椭圆形外，还有一些呈扭曲、凹陷或不规则形。部分内皮细胞线粒体数目较少，结构肿胀欠清晰，粗面内质网数目少并有扩张，平滑内质网明显扩张呈空泡状(图6)。未见到Weibel氏小体。有少数细胞有密体、密斑样结构，说明混杂有平滑肌细胞。
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2 传代培养内皮细胞的形态学特征
2.1 倒置显微镜观察 正常组第5代的内皮细胞呈扁平的长梭形和多角形，还可见到一些较大的椭圆形细胞，镶嵌状排列，彼此不重叠，整个视野大多数内皮细胞形状要比原代培养的略大(图7)。造型组传代培养的内皮细胞形态与正常组基本类似，少数未融合的细胞边缘呈指状，胞浆丰富。仍混杂少量的平滑肌细胞(图8)。
2.2 扫描和透射电镜观察 扫描电镜观察正常组传代培养的大多数内皮细胞与原代培养的类似，但一些内皮细胞有指状突起(图9)。造型组传代后的内皮细胞形状大小较一致，指状突起的内皮细胞比原代培养的减少，胞核大多微隆起(图10)。透射电镜观察正常组传代培养的内皮细胞内部结构与原代培养的基本相似，造型组传代后内皮细胞中的吞饮泡的数量比原代减少，核多呈肾形或椭圆形，大多可见到一定数量的粗面内质网(图11)。
3 第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检查
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荧光显微镜下可见细胞核周呈黄绿色发亮荧光环，胞浆为淡黄绿色，细胞轮廓清楚(图12)。作为对照的内皮细胞各片子中，偶见发亮的自发荧光斑点，未见细胞轮廓，证明培养的细胞为内皮细胞。
图1～12 血瘀证兔模型血管内皮细胞培养的形态结构改变
4 原代和传代内皮细胞的生长特点
正常组主动脉消化后细胞数目为24.83±7.99万/每只兔(n=10)，造型组主动脉消化后细胞数目为31.65±7.17万/每只兔(n=10)。Wilcoxon秩和检验，P=0.045。
正常组原代培养的内皮细胞在培养瓶中静止2h～3h后，已有部分粘附、贴壁，8小时大部分细胞粘附，少数细胞开始伸展，到24小时左右细胞全部伸展，并开始分裂。接种时未分散的成团内皮细胞所形成的多边形集落生长较快，培养4d～6d后，细胞生长迅速，集落增大，某些数量较多的细胞集落之间接近融合；到7d～8d，整个培养皿底细胞近亚融合或融合状态。造型组的内皮细胞生长较缓慢，至融合状态一般需12d～13d。
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正常组传代培养的内皮细胞在培养瓶中静置0.5h～1h左右，开始贴壁生长，至3d～4d，瓶底内皮细胞已近融合状态。测定第5代内皮细胞的生长率表明，内皮细胞的生长高峰在2d～7d。冻存复苏内皮细胞的生长特点与传代内皮细胞的相似。造型组第五代内皮细胞的生长潜伏期、指数增长期和生长稳定期均比同代的对照组要推迟1d～2d(图13)。
图13 第五代内皮细胞的生长曲线
讨论
目前，血瘀证实验研究多进行在体实验研究，至今已复制多种血瘀证动物模型。以往我们也用去甲肾上腺素、牛血清白蛋白诱发慢性血瘀证兔模型，并用于活血化瘀方药的研究[4]。这些研究对探讨血瘀证实质及活血化瘀方药的作用机理起到了积极的推动作用。但由于在体实验受神经、体液等因素的影响，使其对血瘀证实质及活血化瘀方药作用机理的阐明受到一定的限制，而细胞培养技术可人为控制、干预各种影响因素，观察处理因素对细胞、组织的直接作用，弥补在体实验之不足。两者相互结合、补充，可使血瘀证实质及活血化瘀方药的作用机理研究更深入、更全面[5、6]。用内皮细胞培养方法进行疾病的发病机理或药物作用机理的研究，国内外已有较多的报道。目前大多数人均从正常动物或人身上取材、培养，然后在培养的内皮细胞中加入高脂血清等处理因素造成细胞的病理损伤。这些研究方法发展至今已较为成熟、稳定，仍发挥着重要的作用。但其不足之处是这种病理性损伤不能直接反应体内的病理状态。
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本研究从已造模的整体血瘀证兔主动脉直接取材，进行细胞培养，并与正常兔主动脉血管内皮细胞培养进行对照，观察“血瘀证”兔模型主动脉内皮细胞原代和传代培养后的形态学改变(有关培养的内皮细胞分泌血管活性物质的研究将在另文发表)，以期观察的结果能保持血瘀证的整体病理特征，更为接近体内的病理状态。此外，本研究每次实验用一个动物取材进行培养，有助于排除个体差异及其他影响因素。
与正常兔比较，造型兔原代细胞培养发现大多数内皮细胞饮液泡数量增多，部分内皮细胞胞质内有暗色颗粒，胞核形状扭曲，线粒体结构肿胀欠清晰，内质网扩张呈空泡状，提示造型兔原代培养融合的内皮细胞损伤，这与血瘀证整体动物模型的病理改变相一致[1]。尤其是部分内皮细胞体积增大，与Tokunaga用动脉粥样硬化病人的内皮细胞进行培养所观察到的含有巨大变异细胞结果相近[7]，但本研究未发现有多核细胞。造型兔主动脉消化后得到的细胞数比正常兔多，也提示由于造型兔主动脉内膜的病理损伤，使胰蛋白酶和胶原酶消化后脱落的内皮细胞的数量增多。造型组在原代培养时生长缓慢，至融合状态的时间比正常组平均要长5天，培养至第五代时内皮细胞的生长曲线表明造型组内皮细胞的生长速度已逐渐接近正常组。
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本实验内皮细胞传代结果表明，原代培养时内皮细胞所表现的病理特征并未随传代而得以完全保留，损伤的内皮细胞随着细胞传代而被逐渐淘汰，这是否是由于细胞生长过程中其自身的新陈代谢作用及培养液中所含的营养因素如胎牛血清等导致细胞的自我修复，尚有待进一步研究。
综上所述，造型兔的主动脉内皮细胞易于消化，原代培养时内皮细胞生长减慢，出现病理性损伤，细胞传代后具有一定的自我修复能力。我们的研究结果对血瘀证的实质研究提供了进一步的实验依据，并为建立血瘀证的细胞损伤模型进行了有益的尝试。
致谢：本研究得到上海第二医科大学黄桂秋、徐德敏老师，上海医科大学陈思白老师，中山医科大学刘青老师及解放军总医院景京同志的大力支持和帮助，在此致以衷心感谢。
* 本项目为国家自然科学基金、国家中医药管理局及广东省自然科学基金资助
作者简介：陈云波，男，35岁，讲师。1986年毕业于华南师范大学生物系。现在广州中医药大学临床流行病学应用研究室从事老年脑病及证候的中西医结合基础研究工作。
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参考文献
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[2] 赖世隆，王奇，梁伟雄，等.去甲肾上腺素、牛血清白蛋白诱发血瘀证动物模型的研究.广州中医学院学报 1993；10(4)：206～210
[3] Jaffe EA,Nachman RL,Becker CG,et al.Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins-Identification by morphological and immundogic criteria.J Clin Inverst 1973;52:2754～2756
[4] 王奇，梁伟雄，谭芬来，等.活血化瘀复方对血瘀证兔模型作用的实验研究.中药新药与临床药理 1991；2(2)：37～40
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[5] 陈云波，王奇，赖世隆.从血管内皮细胞功能改变看血瘀证实质及活血化瘀机理.中国中医基础医学杂志 1996；2(1)：37～38
[6] 李连达.组织和细胞培养技术的应用.陈可冀等主编.血瘀证与活血化瘀研究.第1版.上海：上海科技出版社，1990：103～109
[7] Tokunaga O,Fan J,Watanaba T.Atherosclerosis-and age-related mulitinucleated variant endothelial cells in primary culture from human aorta.Am J Pathol.1989:135:967～76
(收稿日期 1999—12—03 修回日期 1999—02—30), http://www.100md.com