c-myc癌基因与血管平滑肌细胞增殖关系的研究进展
作者：栾荣华 贾国良
单位：第四军医大学附属西京医院心血管内科， 陕西 西安 710032
关键词：
心血管病学进展990617
文章编号：1004-3934(1999)06-0368-04
中图分类号：R329.28 ；Q754
文献标识码：A
Progresses in Relationship between c-myc Oncogene and
Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells
, http://www.100md.com
LUAN Rong-hua, JIA Guo-liang
(Department of Cardiology,Xijing Hospital of Fourth Military Medi cal University, Shaanxi Xian 710032)
冠状动脉腔内成形术(PTCA)已被公认为是治疗冠心病最有效的非手术方法，然而其术后 3～6个月内扩张动脉段再狭窄的发生率达30%～50%，其中血管平滑肌细胞的增殖、迁移是关 键因素之一[1]。近年来的研究表明，再狭窄的发生与某些癌基因激活有关，c- myc癌 基因是其中一个重要的基因。c-myc癌基因属速发-早期基因(immediate-early gene)， 其编码 产物为核内DNA结合蛋白，在核内的信息传递过程中起重要作用，可促进与细胞增殖有关的 基因开放，从而产生细胞增殖效应，是血管平滑肌细胞增殖、迁移的触发和调控因素，在再 狭窄的发生过程中起重要作用[2，3]。
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1 c-myc癌基因的结构和表达
c-myc癌基因是髓细胞性病毒MC-29的病毒癌基因v-myc的细胞同系物，从MC-29病毒中分 离的 v-myc是gag-myc融合体，它由1 358个bp的gag基因与1 568个bp的v-myc基因共同组成 [ 4]。c-myc癌基因由3个外显子及2个内含子组成。第一外显子不编码，只起调节作用， 只有第二和第三外显子与v-myc相对应，编码一个439个氨基酸的蛋白质。在各种不同动物 中 ，c-myc癌基因的第二和第三外显子具有高度保守性，而第一外显子则有较大差异 [5]。c-myc癌基因由启动子P1或P2起始转录并在第一内含子中尚有一个潜在启动子P， 当第一个内含子发生断裂时，P可被激活而成为一个异常转录起始点，但蛋白合成起始位点 不变，并与正常c-myc基因产物相同[6]。
正常的c-myc癌基因是受反位作用抑制作用的调节。这种反位作用抑制调节的靶位于c-myc 癌基因 5端的两个启动子引导序列上。这种调节与细胞内c-myc蛋白的水平有关，在c-myc蛋白 水平 的影响下，直接或间接地调控c-myc癌基因的表达。其调节方式有三种：(1)由c-myc蛋白 直接引起 启动子引导序列的自动抑制；(2)由对c-myc蛋白起反应的抑制子间接引起启动子引导序列 的自动调节；(3)由与c-myc蛋白无关的抑制子引起的启动子引导序列调节。
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通常情况下c-myc癌基因mRNA相当不稳定，半衰期一般在15～30分钟。然而在细胞受到生长 刺激或分化时，其稳定性常发生改变，如在Burkitts淋巴瘤中，c-myc癌基因存在各种转 位、剪接异常，产生5端异常的c-myc mRNA，导致其稳定性明显提高[7]。在生 理 学上，c-myc癌基因的表达一般与细胞的生长状态有关。在细胞培养过程中发现，c-myc癌 基 因在细胞从G0期到S期的过程中起重要作用。c-myc癌基因表达的变化与细胞的增殖及分 化状态有关，其表达产物在调节细胞生长、分化或恶性转化中发挥作用。
2 c-myc癌基因的表达产物与功能
c-myc癌基因的产物为62KD(6.2×104u)的磷酸化蛋白P62，是由c-myc癌基因的第二外 显子 和第三外显子共同编码的由439个氨基酸组成的蛋白质。通过DNA亲和层析检测发现，c-myc 蛋白主要位于细胞核，并结合在双链或单链DNA上[8]。依照c-onc编码产物的功能 分类，c-myc癌基因属核蛋白基因，c-myc蛋白为核内DNA结合蛋白，具有细胞转化的能力 ， 并且具有与染色体DNA结合的特性，在调节细胞生长、分化及恶性转化中起重要作用[ 9]。有丝分裂时，c-myc蛋白是一种调控细胞增殖和分化的调控蛋白，它可以识别和结 合 到基因组中特定的调控序列，激活那些与细胞的增殖和分化有关的基因。一旦受到某些因素 的影响，c-myc癌基因会被激活，破坏细胞内刺激系统的控制，导致细胞生长失去调控。
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c-myc蛋白是一种富含脯氨酸的磷酸化蛋白，其合成是在胞浆内，然后与其它蛋白进行寡聚 化，再转移到核内发挥作用。在结构上分为转录激活区、非特异DNA结合区，核靶系列区、 碱性区、螺旋-环-螺旋(HLH)及亮氨酸拉链(ZIP)等区域。其中c-myc蛋白有两个邻近的区 ， 即螺旋-环-螺旋区及亮氨酸拉链区，在已知的转录因子中可介导蛋白的寡聚化，这两个区 同 时存在是c-myc蛋白所特有的，在其它蛋白质中很少发现。在c-myc蛋白中，螺旋-环-螺 旋紧随着碱性区，揭示其以特异性序列方式和DNA相互作用[10]。
许多研究表明，与c-myc癌基因激活有关的DNA靶位置可能包含一个CACGTG或CACATG核心序 列。 转录激动剂由c-myc蛋白上两个 独立的功能区组成：一个特异性DNA识别区，一个转录活性 区。c-myc蛋白转录活性区是富含酸性谷氨酰胺、脯氨酸的序列，c-myc蛋白的转化活性区 需 N末端和C末端120个氨基酸的完整。c-myc蛋白C-端包含核靶序列，把c-myc蛋白送入胞核 ， 在那里c-myc蛋白非特异地结合DNA，以使碱性区、螺旋-环-螺旋区及亮氨酸拉链区特异 性地 识别DNA位置。c-myc蛋白N-端为细胞转化所必需，富含谷氨酰胺和脯氨酸[10]。
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3 c-myc癌基因的激活
c-myc癌基因主要通过染色体重排和基因扩增的方式激活。染色体重排包括易位、倒位和插 入等，以易位研究最多。正常情况下，一定基因扩增与许多细胞对环境因素应激性反应有关 。与正常细胞中单拷贝基因相比，基因扩增程度相差可达几百倍。在细胞中扩增癌基因有四 种表现形式：(1)双微粒染色体；(2)整合到线性染色体内形成均匀的染色体区；(3)不等性 姊妹染色体互换；(4)独立存在于染色体外的染色小体。其中以前两者多见。c-myc癌基因 扩 增后在mRNA水平和蛋白水平上都相应地过量表达，而其蛋白水平又直接或间接地影响着c-m y c癌基因的表达[11]。在血管成形术中，c-myc癌基因在动脉球囊损伤后被激活并 出现扩增和高表达，触发血管平滑肌细胞的增殖和迁移[2，3]。
4 c-myc癌基因与血管平滑肌细胞增殖的关系
血管平滑肌细胞增殖及向内膜下迁移是血管成形术后再狭窄的基本病理变化之一[12] 。许多研究发现，血管平滑肌细胞的增殖与c-myc癌基因密切相关。在培养的血管平滑肌 细胞发现，c-myc癌基因的mRNA水平在血清刺激后30分钟开始升高，2～4小时达 到高峰[13]，在细胞进入第一和接下来的细胞周期，c-myc癌基因表达维持一稳定 的略 低水平[14]，提示c-myc癌基因具有使血管平滑肌细胞进入细胞周期和维持细胞增 殖的双重作用。基于此点，Bennett等[15]证实，在众多血管平滑肌细胞增殖 抑制剂中，使c-myc癌基因表达下调是其作用的最基本的组成成分。在动 脉球囊损伤模型中，c-myc癌基因mRNA水平在损伤后2小时达到高峰，4小时时恢复正常。Mi ano等[16]在动脉球囊损伤模型中观察到c-myc癌基因表达呈双向方式，即在动脉 损 伤后第6小时和第7天时各出现另一次高峰，而第7天时的c-myc癌基因再次激活与血管内膜 增 生的快速相是相一致的。c-myc癌基因表达增加，其编码蛋白与DNA结合，可促进与细胞增 殖 有关的基因开放，从而产生细胞增殖效应，也提示c-myc基因的激活可能是血管平滑肌细胞 增殖的始动因素。c-myc癌基因通过三种机制使血管平滑肌细胞增殖与迁移：(1)其羧基端 与 特异的DNA序列结合，开放与细胞增殖有关的基因；(2)氨基端与抑制基因结合，使其抑制作 用解除，刺激细胞增生；(3)诱导丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶P34cdc2产 生，使细胞迁移[17]。
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近来研究发现，血管紧张素Ⅱ、内皮素-Ⅰ、血小板衍生生长因子、胰岛素生长因子等可以 促进c-myc癌基因的表达，从而促进血管平滑肌细胞的增殖。其可能的机制是上述的物质与 血管平滑肌细胞的膜受体结合，激活磷脂酶C，促进磷脂酰肌醇水解，生成IP3和DG，打开IP 3/Ca2+和DG/蛋白激酶C两条通路，二者促使癌基因转录、促进DNA、蛋白质合成及细 胞分裂。酪氨酸蛋白激酶的激活在血管平滑肌细胞增殖中也起重要作用。因为表皮生长因子 受体、胰岛素样因子受体、血小板衍生生长因子受体等本身为酪氨酸激酶，一旦与配体结合 ，活性增强。
由于血管平滑肌细胞增殖、迁移需要c-myc癌基因持续表达，加之c-myc癌基因mRNA和c-m yc 蛋白较短的半衰期，许多抑制血管平滑肌细胞增殖作为血管成形术后再狭窄的基因治疗研究 选择c-myc癌基因作为靶基因，并且已经取得令人鼓舞的成果。
5 以c-myc癌基因为靶基因抑制血管平滑肌细胞增殖的基因治疗
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近年来，直接向动脉段转移治疗基因成为血管成形术后再狭窄基因治疗的主要途径。目前针 对血管平滑肌细胞增殖、以c-myc癌基因为靶基因的基因治疗主要采用反义寡聚核苷酸技术 。依据碱基互补原则，能与c-myc癌基因或其mRNA结合的RNA或DNA片断称为反义c-myc癌基 因 寡聚核苷酸，一般由十个至几十个核苷酸组成。反义核酸导入细胞后可以抑制c-myc癌基因 或其mRNA的复制、转录、翻译，可以降低靶细胞内c-myc蛋白含量，抑制c-myc癌基因高表 达，从而达到抑制细胞增殖的目的。
目前常用的反义核酸转移载体有：(1)脂质体：多采用阳离子脂质体，可提高细胞摄取率， 如Lipofectin、Lipofectamine，它们与反义核酸共用可明显增加细胞对其的摄取。(2)HJV - 脂质体-反义核酸复合物：为近年来采用的载体，无活性的HJV能够明显提高细胞对脂质体 包 裹反义核酸的摄取率。(3)多聚凝胶：为反义核酸转移的特有载体，目前多采用pluronic凝 胶，使 用时首先体外4℃下将反义核酸与pluronic凝胶制成液态复合物，当将之涂布于血管壁时，3 7℃下则变成高粘度凝胶，使反义核酸缓慢进入细胞发挥作用[18]。
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反义核酸转移方法：(1)多聚凝胶涂布：直接将多聚凝胶涂布于拟治疗血管段外膜即可。虽 然目前尚不知有效转移的确切机制，但多项研究显示它不仅能抑制靶基因mRNA表达，而且可 降低内膜增生程度。(2)直接注射：既能用于动脉管腔基因转移，移植静脉反义核酸转移亦 可采用此方法。(3)定位转移：采用多孔球囊导管将反义核酸直接定位转移至球囊损伤动脉 段。由于球囊导管定位转移技术的诸多优点，可能会成为反义核酸转移和治疗的主要途径。
近年来，在离体、在体条件下采用反义c-myc寡聚核苷酸抑制血管平滑肌细胞增殖的研究已 屡见报道。1992年，Ebbecke等[19]在培养人血管平滑肌细胞模型上，采用与c-my c 癌基因第二外显子的前五个密码子互补的硫代磷酸修饰的反义核酸，明显降低血管平滑肌细 胞c-myc蛋白的含量，且呈剂量依赖方式明显抑制血管平滑肌细胞的增殖。1993年，Biro等 [20]用与c-myc癌基因mRNA的前五个密码子互补的氨基磷酸修饰的反义核酸以及氨 基磷酸修饰的18聚体寡聚核苷酸，在培养的大鼠血管平滑肌细胞上证实，反义核酸可以明显 抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移，作用呈浓度依赖方式。对血管平滑肌细胞增殖的最大抑 制效应为50%，对血管平滑肌细胞迁移的最大抑制效应为90%。血管平滑肌细胞的c-myc蛋白 表达亦明显降低。1994年，Bennett等[18]选用c-myc癌基因mRNA的前五个密码子 作 为靶序列，反义核酸可以降低培养的大鼠血管平滑肌细胞c-myc蛋白水平50%～55%，并且可 以明显抑制细胞的增殖，作用呈剂量依赖关系；在大鼠颈动脉球囊损伤模型上，反义c-myc 寡聚核苷酸通过Pluronic凝胶涂布于损伤动脉外膜，可降低2小时c-myc基因mRNA表达峰值 的 75%；在损伤2周后，可明显减轻血管新生内膜的形成。认为c-myc癌基因表达既是血管平滑 肌 细胞进入细胞周期所必需的，又是细胞持续不断增殖所必需的。反义c-myc寡聚核苷酸阻止 血管平滑肌细胞进入细胞周期，而且抑制已经进入细胞周期的血管平滑肌细胞的增殖。1995 年，Edelman等[21]采用pluronic凝胶及乙烯乙烯基醋酸盐复合多聚体(EVAC)两个 基于多聚体的反义核酸释放系统，选择c-myc基因第二外显子的第二至第六个密码子序列为 靶结构区，合成硫代磷酸修饰的反义核酸，在体外培养大鼠平滑肌细胞上观察到，pluronic 凝胶快速释放系统抑制血管平滑肌细胞增殖达54.5%，而EVAC持续更长时间的释放系统则为 47.3%。在大鼠颈动脉球囊损伤模型上，损伤2周后观察到，EVAC系统可见明显抑制内膜增 生的作用，然而pluronic凝胶系统则未观察到该种作用。分析造成这一现象的原因是在损伤 早期反义核酸成功的抑制作用，晚期丧失调节作用，而并非由于反义寡聚核苷酸在pluronic 凝胶中灭活。在损伤后24小时，pluronic凝胶释放反义核酸可以降低血管壁中膜c-myc mRN A 水平2.5倍，抑制c-myc蛋白达98.8%。损伤3天后增殖细胞的数量降低6.5倍，损 伤 后1周这种作用基本丧失。与之相对应的是，在EVAC系统，反义核酸抑制c-myc蛋白表达99 . 6%，损伤2周后降低内膜增生达11.1倍，因此，反义c-myc寡聚核苷酸抑制血管内膜增生 依赖于反义核酸对靶基因表达过程的抑制和有效的反义核酸释放系统。
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6 存在问题及展望
c-myc癌基因是一较早发现的癌基因，对其结构、功能及致病机理研究较为深入。虽然许多 c -myc癌基因的激活、高表达在血管平滑肌细胞的增殖、迁移过程中发挥着重要作用，然而 对 于c-myc癌基因调控血管平滑肌细胞增殖的确切机制仍有待于进一步研究认识，这样才能使 针对c-myc癌基因抑制血管平滑肌细胞增殖的基因治疗更加准确有效。
目前在抑制血管平滑肌细胞增殖的基因治疗中，反义核酸技术应用占有十分重要的地位，但 其存在转化效率低、易于降解的缺点。通过化学修饰的方法防止其降解，延长其半衰期，增 加其与靶序 列的亲和力，研究靶序列的二级结构，以及改进反义核酸的释放系统，增加细 胞穿透力等将会有助于提高反义核酸技术的治疗效果。
虽然反义核酸技术有效，但是如何保持抑制血管内膜增生持续有效；研究反义核酸量-效关 系，确定最小有效剂量；另外，血管壁含有多种细胞成分，反义核酸对各种细胞的作用，有 待进一步研究，例如血管损伤后c-myc癌基因高表达也有可能诱导内皮细胞增殖，虽然没有 观察到反义核酸影响伤口愈合的作用，但是如果反义c-myc寡聚核苷酸抑制血管内皮细胞的 分化和迁移，有可能会影响血管的再内皮化，从而影响损伤血管的修复。
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采用新的方法阻断c-myc癌基因的表达、抑制血管平滑肌细胞增殖有待进一步研究。核酶(R ibo zyme)为具有催化活性的RNA分子，可以序列特异性地切割靶RNA，在切割靶RNA后可以从其余 靶RNA形成的杂交链上解离下来，对新的靶RNA进行切割反应，因此能够重复利用。核酶具有 反义和切割的双重作用，在阻断基因表达方面比反义核酸更为有效，已成为近年来基因治疗 的一种新方法。1995年，Gu等[22]针对白细胞型12-脂肪氧合酶(12-lipoxygenas e )活化后在血管紧张素Ⅱ介导的血管平滑肌细胞增殖中起重要作用，设计了DNA-RNA嵌合的 切 割白细胞型12-脂肪氧合酶mRNA的核酶，体外和脂质体转染血管平滑肌细胞均出现剂量依赖 性降低白细胞型12-脂肪氧合酶mRNA水平，作用明显强于反义核酸。1996年，Jarvis等 [23]合成硫代磷酸修饰的特异性切割c-myc癌基因mRNA的锤头状核酶，用阳离子脂质体 包裹导入培养大鼠血管平滑肌细胞，可以明显抑制细胞的增殖，与同一位点的硫代磷酸修饰 的反义寡聚核苷酸相比，核酶的抑制作用更明显，并且更具有特异性。设计合成针对c-myc 癌基因的mRNA核酶，或构建c-myc癌基因mRNA核酶真核表达载体，通过转基因技术转入血管 平滑肌细胞，观察其对血管平滑肌细胞增殖、迁移的作用，是一种有希望的途径，有待进一 步研究。
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收稿日期：1998-03-24 修回日期：1999-07-28, 百拇医药
单位：第四军医大学附属西京医院心血管内科， 陕西 西安 710032
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心血管病学进展990617
文章编号：1004-3934(1999)06-0368-04
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正常的c-myc癌基因是受反位作用抑制作用的调节。这种反位作用抑制调节的靶位于c-myc 癌基因 5端的两个启动子引导序列上。这种调节与细胞内c-myc蛋白的水平有关，在c-myc蛋白 水平 的影响下，直接或间接地调控c-myc癌基因的表达。其调节方式有三种：(1)由c-myc蛋白 直接引起 启动子引导序列的自动抑制；(2)由对c-myc蛋白起反应的抑制子间接引起启动子引导序列 的自动调节；(3)由与c-myc蛋白无关的抑制子引起的启动子引导序列调节。
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通常情况下c-myc癌基因mRNA相当不稳定，半衰期一般在15～30分钟。然而在细胞受到生长 刺激或分化时，其稳定性常发生改变，如在Burkitts淋巴瘤中，c-myc癌基因存在各种转 位、剪接异常，产生5端异常的c-myc mRNA，导致其稳定性明显提高[7]。在生 理 学上，c-myc癌基因的表达一般与细胞的生长状态有关。在细胞培养过程中发现，c-myc癌 基 因在细胞从G0期到S期的过程中起重要作用。c-myc癌基因表达的变化与细胞的增殖及分 化状态有关，其表达产物在调节细胞生长、分化或恶性转化中发挥作用。
2 c-myc癌基因的表达产物与功能
c-myc癌基因的产物为62KD(6.2×104u)的磷酸化蛋白P62，是由c-myc癌基因的第二外 显子 和第三外显子共同编码的由439个氨基酸组成的蛋白质。通过DNA亲和层析检测发现，c-myc 蛋白主要位于细胞核，并结合在双链或单链DNA上[8]。依照c-onc编码产物的功能 分类，c-myc癌基因属核蛋白基因，c-myc蛋白为核内DNA结合蛋白，具有细胞转化的能力 ， 并且具有与染色体DNA结合的特性，在调节细胞生长、分化及恶性转化中起重要作用[ 9]。有丝分裂时，c-myc蛋白是一种调控细胞增殖和分化的调控蛋白，它可以识别和结 合 到基因组中特定的调控序列，激活那些与细胞的增殖和分化有关的基因。一旦受到某些因素 的影响，c-myc癌基因会被激活，破坏细胞内刺激系统的控制，导致细胞生长失去调控。
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c-myc蛋白是一种富含脯氨酸的磷酸化蛋白，其合成是在胞浆内，然后与其它蛋白进行寡聚 化，再转移到核内发挥作用。在结构上分为转录激活区、非特异DNA结合区，核靶系列区、 碱性区、螺旋-环-螺旋(HLH)及亮氨酸拉链(ZIP)等区域。其中c-myc蛋白有两个邻近的区 ， 即螺旋-环-螺旋区及亮氨酸拉链区，在已知的转录因子中可介导蛋白的寡聚化，这两个区 同 时存在是c-myc蛋白所特有的，在其它蛋白质中很少发现。在c-myc蛋白中，螺旋-环-螺 旋紧随着碱性区，揭示其以特异性序列方式和DNA相互作用[10]。
许多研究表明，与c-myc癌基因激活有关的DNA靶位置可能包含一个CACGTG或CACATG核心序 列。 转录激动剂由c-myc蛋白上两个 独立的功能区组成：一个特异性DNA识别区，一个转录活性 区。c-myc蛋白转录活性区是富含酸性谷氨酰胺、脯氨酸的序列，c-myc蛋白的转化活性区 需 N末端和C末端120个氨基酸的完整。c-myc蛋白C-端包含核靶序列，把c-myc蛋白送入胞核 ， 在那里c-myc蛋白非特异地结合DNA，以使碱性区、螺旋-环-螺旋区及亮氨酸拉链区特异 性地 识别DNA位置。c-myc蛋白N-端为细胞转化所必需，富含谷氨酰胺和脯氨酸[10]。
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3 c-myc癌基因的激活
c-myc癌基因主要通过染色体重排和基因扩增的方式激活。染色体重排包括易位、倒位和插 入等，以易位研究最多。正常情况下，一定基因扩增与许多细胞对环境因素应激性反应有关 。与正常细胞中单拷贝基因相比，基因扩增程度相差可达几百倍。在细胞中扩增癌基因有四 种表现形式：(1)双微粒染色体；(2)整合到线性染色体内形成均匀的染色体区；(3)不等性 姊妹染色体互换；(4)独立存在于染色体外的染色小体。其中以前两者多见。c-myc癌基因 扩 增后在mRNA水平和蛋白水平上都相应地过量表达，而其蛋白水平又直接或间接地影响着c-m y c癌基因的表达[11]。在血管成形术中，c-myc癌基因在动脉球囊损伤后被激活并 出现扩增和高表达，触发血管平滑肌细胞的增殖和迁移[2，3]。
4 c-myc癌基因与血管平滑肌细胞增殖的关系
血管平滑肌细胞增殖及向内膜下迁移是血管成形术后再狭窄的基本病理变化之一[12] 。许多研究发现，血管平滑肌细胞的增殖与c-myc癌基因密切相关。在培养的血管平滑肌 细胞发现，c-myc癌基因的mRNA水平在血清刺激后30分钟开始升高，2～4小时达 到高峰[13]，在细胞进入第一和接下来的细胞周期，c-myc癌基因表达维持一稳定 的略 低水平[14]，提示c-myc癌基因具有使血管平滑肌细胞进入细胞周期和维持细胞增 殖的双重作用。基于此点，Bennett等[15]证实，在众多血管平滑肌细胞增殖 抑制剂中，使c-myc癌基因表达下调是其作用的最基本的组成成分。在动 脉球囊损伤模型中，c-myc癌基因mRNA水平在损伤后2小时达到高峰，4小时时恢复正常。Mi ano等[16]在动脉球囊损伤模型中观察到c-myc癌基因表达呈双向方式，即在动脉 损 伤后第6小时和第7天时各出现另一次高峰，而第7天时的c-myc癌基因再次激活与血管内膜 增 生的快速相是相一致的。c-myc癌基因表达增加，其编码蛋白与DNA结合，可促进与细胞增 殖 有关的基因开放，从而产生细胞增殖效应，也提示c-myc基因的激活可能是血管平滑肌细胞 增殖的始动因素。c-myc癌基因通过三种机制使血管平滑肌细胞增殖与迁移：(1)其羧基端 与 特异的DNA序列结合，开放与细胞增殖有关的基因；(2)氨基端与抑制基因结合，使其抑制作 用解除，刺激细胞增生；(3)诱导丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶P34cdc2产 生，使细胞迁移[17]。
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近来研究发现，血管紧张素Ⅱ、内皮素-Ⅰ、血小板衍生生长因子、胰岛素生长因子等可以 促进c-myc癌基因的表达，从而促进血管平滑肌细胞的增殖。其可能的机制是上述的物质与 血管平滑肌细胞的膜受体结合，激活磷脂酶C，促进磷脂酰肌醇水解，生成IP3和DG，打开IP 3/Ca2+和DG/蛋白激酶C两条通路，二者促使癌基因转录、促进DNA、蛋白质合成及细 胞分裂。酪氨酸蛋白激酶的激活在血管平滑肌细胞增殖中也起重要作用。因为表皮生长因子 受体、胰岛素样因子受体、血小板衍生生长因子受体等本身为酪氨酸激酶，一旦与配体结合 ，活性增强。
由于血管平滑肌细胞增殖、迁移需要c-myc癌基因持续表达，加之c-myc癌基因mRNA和c-m yc 蛋白较短的半衰期，许多抑制血管平滑肌细胞增殖作为血管成形术后再狭窄的基因治疗研究 选择c-myc癌基因作为靶基因，并且已经取得令人鼓舞的成果。
5 以c-myc癌基因为靶基因抑制血管平滑肌细胞增殖的基因治疗
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近年来，直接向动脉段转移治疗基因成为血管成形术后再狭窄基因治疗的主要途径。目前针 对血管平滑肌细胞增殖、以c-myc癌基因为靶基因的基因治疗主要采用反义寡聚核苷酸技术 。依据碱基互补原则，能与c-myc癌基因或其mRNA结合的RNA或DNA片断称为反义c-myc癌基 因 寡聚核苷酸，一般由十个至几十个核苷酸组成。反义核酸导入细胞后可以抑制c-myc癌基因 或其mRNA的复制、转录、翻译，可以降低靶细胞内c-myc蛋白含量，抑制c-myc癌基因高表 达，从而达到抑制细胞增殖的目的。
目前常用的反义核酸转移载体有：(1)脂质体：多采用阳离子脂质体，可提高细胞摄取率， 如Lipofectin、Lipofectamine，它们与反义核酸共用可明显增加细胞对其的摄取。(2)HJV - 脂质体-反义核酸复合物：为近年来采用的载体，无活性的HJV能够明显提高细胞对脂质体 包 裹反义核酸的摄取率。(3)多聚凝胶：为反义核酸转移的特有载体，目前多采用pluronic凝 胶，使 用时首先体外4℃下将反义核酸与pluronic凝胶制成液态复合物，当将之涂布于血管壁时，3 7℃下则变成高粘度凝胶，使反义核酸缓慢进入细胞发挥作用[18]。
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反义核酸转移方法：(1)多聚凝胶涂布：直接将多聚凝胶涂布于拟治疗血管段外膜即可。虽 然目前尚不知有效转移的确切机制，但多项研究显示它不仅能抑制靶基因mRNA表达，而且可 降低内膜增生程度。(2)直接注射：既能用于动脉管腔基因转移，移植静脉反义核酸转移亦 可采用此方法。(3)定位转移：采用多孔球囊导管将反义核酸直接定位转移至球囊损伤动脉 段。由于球囊导管定位转移技术的诸多优点，可能会成为反义核酸转移和治疗的主要途径。
近年来，在离体、在体条件下采用反义c-myc寡聚核苷酸抑制血管平滑肌细胞增殖的研究已 屡见报道。1992年，Ebbecke等[19]在培养人血管平滑肌细胞模型上，采用与c-my c 癌基因第二外显子的前五个密码子互补的硫代磷酸修饰的反义核酸，明显降低血管平滑肌细 胞c-myc蛋白的含量，且呈剂量依赖方式明显抑制血管平滑肌细胞的增殖。1993年，Biro等 [20]用与c-myc癌基因mRNA的前五个密码子互补的氨基磷酸修饰的反义核酸以及氨 基磷酸修饰的18聚体寡聚核苷酸，在培养的大鼠血管平滑肌细胞上证实，反义核酸可以明显 抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移，作用呈浓度依赖方式。对血管平滑肌细胞增殖的最大抑 制效应为50%，对血管平滑肌细胞迁移的最大抑制效应为90%。血管平滑肌细胞的c-myc蛋白 表达亦明显降低。1994年，Bennett等[18]选用c-myc癌基因mRNA的前五个密码子 作 为靶序列，反义核酸可以降低培养的大鼠血管平滑肌细胞c-myc蛋白水平50%～55%，并且可 以明显抑制细胞的增殖，作用呈剂量依赖关系；在大鼠颈动脉球囊损伤模型上，反义c-myc 寡聚核苷酸通过Pluronic凝胶涂布于损伤动脉外膜，可降低2小时c-myc基因mRNA表达峰值 的 75%；在损伤2周后，可明显减轻血管新生内膜的形成。认为c-myc癌基因表达既是血管平滑 肌 细胞进入细胞周期所必需的，又是细胞持续不断增殖所必需的。反义c-myc寡聚核苷酸阻止 血管平滑肌细胞进入细胞周期，而且抑制已经进入细胞周期的血管平滑肌细胞的增殖。1995 年，Edelman等[21]采用pluronic凝胶及乙烯乙烯基醋酸盐复合多聚体(EVAC)两个 基于多聚体的反义核酸释放系统，选择c-myc基因第二外显子的第二至第六个密码子序列为 靶结构区，合成硫代磷酸修饰的反义核酸，在体外培养大鼠平滑肌细胞上观察到，pluronic 凝胶快速释放系统抑制血管平滑肌细胞增殖达54.5%，而EVAC持续更长时间的释放系统则为 47.3%。在大鼠颈动脉球囊损伤模型上，损伤2周后观察到，EVAC系统可见明显抑制内膜增 生的作用，然而pluronic凝胶系统则未观察到该种作用。分析造成这一现象的原因是在损伤 早期反义核酸成功的抑制作用，晚期丧失调节作用，而并非由于反义寡聚核苷酸在pluronic 凝胶中灭活。在损伤后24小时，pluronic凝胶释放反义核酸可以降低血管壁中膜c-myc mRN A 水平2.5倍，抑制c-myc蛋白达98.8%。损伤3天后增殖细胞的数量降低6.5倍，损 伤 后1周这种作用基本丧失。与之相对应的是，在EVAC系统，反义核酸抑制c-myc蛋白表达99 . 6%，损伤2周后降低内膜增生达11.1倍，因此，反义c-myc寡聚核苷酸抑制血管内膜增生 依赖于反义核酸对靶基因表达过程的抑制和有效的反义核酸释放系统。
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6 存在问题及展望
c-myc癌基因是一较早发现的癌基因，对其结构、功能及致病机理研究较为深入。虽然许多 c -myc癌基因的激活、高表达在血管平滑肌细胞的增殖、迁移过程中发挥着重要作用，然而 对 于c-myc癌基因调控血管平滑肌细胞增殖的确切机制仍有待于进一步研究认识，这样才能使 针对c-myc癌基因抑制血管平滑肌细胞增殖的基因治疗更加准确有效。
目前在抑制血管平滑肌细胞增殖的基因治疗中，反义核酸技术应用占有十分重要的地位，但 其存在转化效率低、易于降解的缺点。通过化学修饰的方法防止其降解，延长其半衰期，增 加其与靶序 列的亲和力，研究靶序列的二级结构，以及改进反义核酸的释放系统，增加细 胞穿透力等将会有助于提高反义核酸技术的治疗效果。
虽然反义核酸技术有效，但是如何保持抑制血管内膜增生持续有效；研究反义核酸量-效关 系，确定最小有效剂量；另外，血管壁含有多种细胞成分，反义核酸对各种细胞的作用，有 待进一步研究，例如血管损伤后c-myc癌基因高表达也有可能诱导内皮细胞增殖，虽然没有 观察到反义核酸影响伤口愈合的作用，但是如果反义c-myc寡聚核苷酸抑制血管内皮细胞的 分化和迁移，有可能会影响血管的再内皮化，从而影响损伤血管的修复。
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采用新的方法阻断c-myc癌基因的表达、抑制血管平滑肌细胞增殖有待进一步研究。核酶(R ibo zyme)为具有催化活性的RNA分子，可以序列特异性地切割靶RNA，在切割靶RNA后可以从其余 靶RNA形成的杂交链上解离下来，对新的靶RNA进行切割反应，因此能够重复利用。核酶具有 反义和切割的双重作用，在阻断基因表达方面比反义核酸更为有效，已成为近年来基因治疗 的一种新方法。1995年，Gu等[22]针对白细胞型12-脂肪氧合酶(12-lipoxygenas e )活化后在血管紧张素Ⅱ介导的血管平滑肌细胞增殖中起重要作用，设计了DNA-RNA嵌合的 切 割白细胞型12-脂肪氧合酶mRNA的核酶，体外和脂质体转染血管平滑肌细胞均出现剂量依赖 性降低白细胞型12-脂肪氧合酶mRNA水平，作用明显强于反义核酸。1996年，Jarvis等 [23]合成硫代磷酸修饰的特异性切割c-myc癌基因mRNA的锤头状核酶，用阳离子脂质体 包裹导入培养大鼠血管平滑肌细胞，可以明显抑制细胞的增殖，与同一位点的硫代磷酸修饰 的反义寡聚核苷酸相比，核酶的抑制作用更明显，并且更具有特异性。设计合成针对c-myc 癌基因的mRNA核酶，或构建c-myc癌基因mRNA核酶真核表达载体，通过转基因技术转入血管 平滑肌细胞，观察其对血管平滑肌细胞增殖、迁移的作用，是一种有希望的途径，有待进一 步研究。
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收稿日期：1998-03-24 修回日期：1999-07-28, 百拇医药