肿瘤的癌基因与凋亡
作者：王自强 蔡志民
单位：第三军医大学西南医院普外科(400038)
关键词：
重庆医学990655 随着对凋亡的不断深入的研究，科学家们逐步认识到凋亡具有重要的生物学意义，不仅维持细胞群体数量的自身稳定，胚胎发育和免疫克隆的选择，而且在肿瘤发生，清除转化细胞、细胞损伤反应、抗肿瘤药物治疗等方面均具有十分重要的作用。正是因为如此，凋亡的分子机制作为生命科学中一个研究热点引起越来越广泛的注意。目前的研究普遍认为肿瘤的发生不仅由于细胞过度增殖，同时存在细胞凋亡的减少。其中癌基因对凋亡的启动和调节起到重要作用。本文对参与肿瘤凋亡调节的几个主要癌基因的最新进展进行综述。
1.调节凋亡的癌基因
1.1 Bcl-2家族 Bcl-2首先在人类滤泡性淋巴瘤细胞中tl：18染色体易位的断点发现、命名(B细胞淋巴瘤/白血病基因2)，Bcl-2蛋白由279个氨基酸组成，整合于线粒体内膜、核膜、内质网膜上，是凋亡抑制基因，Bcl-2过度表达使DNA损伤细胞持续存在，导致肿瘤发生，与多种肿瘤的发生有关。正常大肠粘膜Bcl-2表达于隐窝下半部、干细胞增殖带，而浅表上皮表达缺失。有实验观察到大肠腺瘤及腺癌上皮全层染色阳性且染色阳性率高于正常上皮。Bcl-2在结肠癌中的表达强度与P53状态有关，在P53阳性的组织中Bcl-2表达亦增强，而组织自发凋亡减弱[1]。Kikuchi Y等分析了在增殖性结肠息肉、结肠腺瘤、 腺瘤癌变及腺癌中Bcl-2的表达、细胞增殖及凋亡情况，发现在癌变过程中细胞增殖率逐渐增加，而凋亡则明显减弱，Bcl-2在腺瘤表达最强，腺瘤癌变时Bcl-2表达明显减弱，虽然腺癌中Bcl-2表达阳性率达20%，但仍明显低于在腺瘤的表达水平。同时癌变过程中伴随P53表达增强并向胞浆移位及C-myc表达增强，但Bcl-2表达的减弱并不伴随凋亡的增强，其癌变过程中的作用有待阐明[2]。而Frommel等的结果则显示Bcl-2可能参与了慢性胃肠道炎症癌变率增高的机制，在慢性胃肠道炎症中，Bcl-2表达增强虽然有利于防止粘膜细胞为炎症氧介质损伤，但亦因使细胞凋亡减弱，延长了细胞生存，增强了致癌突变在细胞中的堆积，从而增加了癌变率[3]。
, 百拇医药
为检测Bcl-2过度表达在活体中的生物学效应，有实验建立了转基因的小鼠系，将Bcl-2转染于免疫球蛋白增强子的调控之下(Bcl-2-Ig)。这一结构将使B淋巴细胞过度表达Bcl-2，理论上将导致小鼠发生滤泡状淋巴瘤。Bcl-2-Ig小鼠发现静息期B细胞的多克隆滤泡状扩张。由于这些细胞是非增生性的，因此推测细胞数量的增加是由于Bcl-2抑制凋亡后细胞生存延长所致。经过约一年的潜伏期，15%的Bcl-2-Ig小鼠发生了侵袭B淋巴瘤[4]，分析约有50%的肿瘤中发现C-myc过度表达。多个实验表明C-myc与Bcl-2间存在协同作用。当两种损害在细胞内同时出现时一个介导凋亡减弱，另一个使细胞快速转化，这一协同作用可使细胞不断克隆扩增、增加基因的不稳定性从而最终导致恶性肿瘤。Bcl-2的过度表达可通过抑制凋亡影响化疗效果，转染了Bcl-2的小细胞肺癌细胞株对一些抗癌药物的耐受性上升，而转染反义寡核苷酸则使Bcl-2水平下降、凋亡增强[5]。
Bax是Bcl-2家族中的成员，由6个外显子组成，编码21KD蛋白，分布于胞浆。Bax可自身形成二聚体，亦可与Bcl-2的形成异源二聚体，当bax蛋白表达，并与Bcl-2蛋白聚合则加速细胞死亡。Bcl-2与bax表达程度与比例决定接受调亡信号后的命运。Bcl-2缺乏小鼠尽管也能正常发育，但很快发生细胞凋亡，而bax缺乏雄鼠则发生输精管异常及无精症，使细胞增生及发育不全。在已知的所有Bcl-2家族蛋白中，仅Bax的表达与结肠癌的预后有关，提示预后较好[6]。
, 百拇医药
1.2 C-myc C-myc是调控细胞增殖的主要基因，定位于人的第8号染色体上。编码2个磷酸蛋白(P62和P67)。P62粘附于核内DNA，部分定位于胞浆，为一转录因子，与细胞增殖与癌变关系密切。已在许多肿瘤中发现C-myc的高表达，揭示引起C-myc高表达的损害在恶性转化中起重要作用。体外实验揭示其为一促进细胞分化及有丝分裂的基因，C-myc表达缺失能阻止培养的造血细胞[7]及成纤维细胞的增殖，成纤维细胞过度表达C-myc足以促进处于增殖周期及静息期的细胞进入持续增殖状况。当将野生型成纤维细胞培养于低血浆培养液时，发现C-myc下调，同时发现进入周期的细胞大量静息于G1期。如果，将转染C-myc基因的成纤维细胞再培养于低血浆培养液中时，发现尽管细胞增生明显增强，但细胞数并不增多。进一步分析显示细胞凋亡率亦明显上升。说明细胞一旦增殖障碍，C-myc可启动凋亡。提示一个单一损害引起的野生型细胞的C-myc的异常表达可能在体内并不足以细胞转化。尽管C-myc能促进细胞过度增生，但在体内的低生长因子的状况下，因同时存在C-myc依赖的细胞凋亡，这样就削弱了其克隆扩增作用，甚至当细胞产生时即被从组织中清除。因此可以说，当孤立的考虑C-myc的效应时，可以基本上将其认为是一个自限性基因。
, 百拇医药
但当考虑到C-myc突变与肿瘤产生相关时，这一观点又显得有缺陷。唯一可能解释是C-myc发挥作用与其它基因损害存在协同作用。比如，在一存在影响细胞增殖或凋亡的突变细胞中，C-myc过度表达将导致这两种途径失衡，这一失衡的后果将是细胞被清除、长期生存或过度增生。若为后两种结果，将最终导致细致恶性转化。过度表达C-myc的转基因动物模型的建立提供我们直接检测C-myc依赖的凋亡对体内肿瘤发生影响的机会。Burkitt淋巴瘤是以C-myc位点染色体易位为特征的一种肿瘤。通过转染C-myc来模拟这一现象的转基因动物在5个月的潜伏期后，有90%的动物发生B细胞淋巴瘤[8]。在潜伏期期间，观察到血中B淋巴细胞大量增殖，同时凋亡水平易明显增高。Park IC等发现C-myc在TNF-α诱导的肿瘤细胞凋亡中起作用，在C-myc高表达的SNU-16胃癌细胞中，TNF-α诱导凋亡的反应明显减弱[9]。
1.3 P53 P53定位于17号染色体短臂(17q13.1)，有11个外显子，P53基因产生的野生型P53蛋白是Mr53000，有393个氨基酸的核磷酸化蛋白，可分别与DNA、RNA聚合酶连接，作为核转录因子调节相关基因的表达。其主要功能是调节细胞周期，促进G1期细胞进入S期，促进细胞凋亡，起分子警察的作用，控制基因组完整性。当DNA受损时，P53表达增强，使DNA损伤的细胞发生凋亡，还可激活WAF-1基因表达P21蛋白，使增殖细胞终止于G1期，同时过度表达P53及bax时，后者可解除Bcl-2对凋亡的抑制作用[10]，从而起到协同作用。P53基因的突变产生突变型P53能与野生型P53亚单位结合形成寡聚体，干扰其功能使增殖失控。促进细胞增殖，同时突变型P53还可抑制C-myc介导的凋亡。
, 百拇医药
P53对细胞突变率的影响：预计若缺乏P53依赖的凋亡途径将导致DNA损伤细胞增加。在运用短期的前B细胞培养或转染P53的成纤维细胞株的实验中，揭示了缺乏P53能增加基因毒性刺激后的突变细胞数量。在活体实验中应用DLB-1位点作为突变标志，亦显示缺乏P53能增加小鼠小肠细胞的突变率[11]，这一现象亦仅出现于高水平DNA损害后。综合以上，不同的实验均支持P53在阻碍突变获得中其一定的作用。但这并不是唯一机制，特别是当低水平DNA损害时，凋亡的发生是对DNA损害的一个重要反应。因此，当突变率与克隆生存被单独计数时，显示在生存克隆中突变率不受P53状态影响，但P53缺失却能增加突变子代细胞数量，因其增强了细胞生存。因此，P53缺失增加DNA受损细胞量是因为凋亡减弱的直接后果。
P53功能缺失对体内肿瘤形成的影响：在人体内多种肿瘤中均观察到野生型P53的表达缺失和突变型P53表达增强的现象。利用转基因动物的研究亦提示P53的缺失对肿瘤的生成起重要作用。大多数P53-/-小鼠虽然正常出生，但却迅速发生，特别是胸腺系肿瘤”；P53+/-小鼠产生淋巴瘤及肉瘤机率高于P53+/+小鼠，但低于P53-/-小鼠，并且存在一个较长的潜伏期。用P53阴性基因方法结合无P53鼠的实验强烈支持这一突变类型通过阻滞野生型P53功能使小鼠易发生肿瘤[7]。进一步研究发现P53缺失并不能单独致瘤：利用DMBA这一致癌剂涂抹于小鼠皮肤，将导致肿瘤生成。TPA可以加速DMBA的致瘤进程。起初导致多发性乳头状瘤，2个月内一部分乳头状瘤转变为癌。Kemp等利用这一多阶段的肿瘤生成模型研究P53状况对不同阶段肿瘤生成的影响。给P53-/-小鼠涂抹TPA，没有发生乳头状瘤，说明P53缺失并不足以启动肿瘤生成。实际上资料显示P53这一显型反而限制乳头状瘤的形成。P53状况对乳头状瘤形成的潜伏期的影响在+/+、+/-、-/-三种动物间相关不显著，再一次揭示在肿瘤形成的这一阶段存在其它基因损害作用。而乳头状瘤向癌转变的过程显得高度依赖P53状况。 在P53缺失小鼠恶性转化过程发生更快，而且肿瘤侵袭性更强。
, 百拇医药
P53的表达状况对肿瘤化疗放疗的敏感性的影响依药物类型不尽一致。P53缺失的结肠肿瘤细胞株对DNA损伤试剂敏感性升高，可能与缺失P53后不能诱导P21等CDK抑制蛋白(CKI)表达，细胞大量进入S期，从而对DNA损伤试剂增敏。而P53功能缺失细胞对于抗代谢药物如5-FU耐药，P53对5-FU化疗的效应不依赖P21，并且发现其原因可能与RNA代谢紊乱有关[12]。Zheng等的研究显示P53突变的结肠癌细胞对5-FU及羟基喜树碱的凋亡敏感性较无P53突变细胞低。tatebs等利用P53腺病毒载体Axca-P53转染人6株胃癌细胞株，对MKN-1引起明显细胞凋亡，对MKN-45，MKN-74及KARO-Ⅲ细胞引起周期静息，而对TMK-1及OCUM-2细胞没有效应，在所有转染细胞均有P21表达增强，而仅在MKN-1细胞bax、bcl-xl蛋白表达增强。提示bcl-2在P53介导的细胞凋亡中发挥重要作用[13]。向P53功能丧失的H1299肺癌细胞株及DLD-1、SW620结肠癌细胞株转染wtp53，迅速引起凋亡，并发现CD95表达提高。CD95激动性抗体CH11可以增强H1299细胞的凋亡，对于DLD-1及SW620细胞在4H9存在时反而增强。提示P53介导的细胞凋亡亦可通过Fas/FasL途径实现[14]。
, 百拇医药
1.4 WAF-1 WAF-1是野生型P53的一个活化片段(wide type p53 activated fragement 1),为一种凋亡促进基因，属于CDK抑制蛋白家族(CIP-KIP)。其作用机理如下：CDK酶的活性要cyclin参与，WAF-1的蛋白产物P21通过与cyclin及PCNA等作用形成复合物，从而抑制CDK活性(CDK为一参与使细胞进入S期的酶)，使细胞终止于G1而发生凋亡。Chen等进行肿瘤细胞培养时，表明过度表达WAF-1时产生的P21蛋白可抑制肿瘤细胞增生。Waldman等的研究表明，WAF-1缺失的肿瘤细胞对射线、化疗等介导的凋亡反应减弱。Nakano等发现5.0mM的丁酸钠可通过与P21的SP1位点作用，诱导结肠癌细胞株WiDr凋亡增强，并且P21在人类肿瘤中突变率低，从而提出转染抑癌基因结合化疗的“基因调节化疗”(gene regulating chemoprevention)的治疗方案[15]。Gomyo Y等观察到P21的表达与胃癌的预后有关，93例病人中有30例P21表达阳性，P21+患者的5年生存率为68.4%，明显高于P21-者(38%)[16]。
, 百拇医药
1.5 Rb Rb是一种抑癌基因，缺失Rb基因功能经常与肺、乳腺、前列腺、膀胱肿瘤相关。同时人Rb杂合子将几乎100%导致视网膜母细胞瘤，很多人将在童年时间发生骨肉瘤。PRb是一个110K道尔顿的磷酸蛋白，其作用是通过隔离转录因子复合物E2F家族，Rb与E2F的相互作用能抑制特异性下游基因的转录上调，从而阻止DNA的大量合成，防止细胞进入S期。从大量资料看来PRb是P53依赖的G1期生长静息的下游介质之一，当PRb被CDK4、6-cyclinD、A、E复合物磷酸化后释放出E2K。从而促进下游基因的转录。PRb的磷酸化具有周期特异性。G0/G1期主要是未磷酸化的Rb(110Kd)，而磷酸化的蛋白主要见于G2期(112-114Kd)。PRb的磷酸化可为CDK激酶抑制蛋白(包括CIP/KIP家族如P21、P27、P57及INK4/CDKN家族如P15、P18、P16、P19)所抑制，从而使细胞静息于G1期。PRb在高分化及早期结肠癌中表达较强，而P53与表达存在负相关[17]。
, 百拇医药
为进一步研究活体组织对Rb基因功能的需求，建立了Rb+/+至-/-嵌合体小鼠模型，尽管Rb-/-小鼠有较高的胚胎致死率，但出生的小鼠的所有组织均含有一定比例的Rb-/-细胞。该小鼠肿瘤生成仅在腺垂体出现，瘤细胞基因显型为Rb-/-。所有Rb-/-细胞理论上均具备无限增殖能力，但这与所有肿瘤增多不侵出腺垂体这一事实显得自相矛盾。一个可能的解释是Rb-/-细胞为凋亡显型，实际上检测Rb嵌合体动物揭示细胞增殖和凋亡增加均存在，特别是视网膜及晶体。因此推测一些有Rb缺失引起的增生失常可通过凋亡机制得到限制。继而可推测Rb缺失导致肿瘤发生至少要依赖于另一途径的协同作用。但也有实验显示在另外一些组织中这种通过凋亡的安全机制似乎并不存在或存在不足，包括鼠的垂体细胞及视网膜细胞为进一步研究这一安全网络，建立了Rb及P53的突变动物模型。显示在Rb-/-动物的凋亡部分 为P53依赖性的，两 者均缺陷的胚胎在晶体产生过程中不在显示广泛凋亡及出现未分化晶体细胞。Rb+/-、P53-/-动物获得的资料揭示P53在限制Rb-/-细胞扩增中起重要作用。因为这一类动物产生了较单一基因显型动物更多的肿瘤类型，包括胰岛细胞肿瘤细胞、支气管上皮增生、视网膜增生、成松果体细胞瘤。综上所述，缺失Rb功能与C-myc促增生一样，易感肿瘤，可能是因为增加了影响细胞死亡的其它突变的选择压力。近来研究显示这并不是Rb缺失致瘤的唯一因素，因为转染野生型Rb于Rb阴性的SAOS-2细胞株显示Rb对保护放射诱导凋亡有直接作用[18]。
, 百拇医药
1.6 Fas及Fas配体：Fas属于肿瘤坏死因子超家族之一员。其基因定位于人10号染色体长臂，表达含325个氨基酸残基的跨膜蛋白，其胞外区含富半胱氨酸的重复区，胞内区含一“死亡区”。当FasL与Fas结合后使Fas发生交联，从而引发Caspase级联反应导致细胞凋亡。活化的T细胞同时表达Fas及FasL，使其既可以通过Fas来杀伤靶细胞，也可杀伤T细胞来控制自身数量，下调免疫。研究表明肿瘤细胞可通过多种途径逃避Fas介导的细胞凋亡：①在多种肿瘤如肝细胞癌Fas表达水平下调；②肿瘤细胞可分泌可溶性Fas受体，能与T淋巴细胞的FasL结合从而阻断其杀伤肿瘤细胞；③肿瘤细胞能表达FasL，从细胞自身凋亡。这种现象被称为免疫特权，包括结肠癌、黑色素瘤、星型胶质细胞瘤，肺癌、肝癌等均具有免疫特权现象[19]。Bonnote等发现应用丁酸钠部分纠正结肠癌细胞的这一免疫特权，表达Fas的结肠癌细胞株与可溶性FasL混合培养不引起明显的凋亡，当加入丁酸钠后8个细胞株中有7个凋亡明显增强，并且使细胞对TNF-α的凋亡敏感性增强，但其作用机制并不明确，不涉及Fas受体、Bcl-2/Bax表达变化，亦无胞内FADD(FAS相关的死亡功能区)的变化[20]。Fas凋亡途径还参与了多种抗癌药物的作用机制，羟基喜树碱、强力霉素、丝裂霉素等均可诱导结肠癌细胞Fas受体、FADD、前天冬氨酸酶(Caspase-8、-3及2L)的表达上调[21]。
, http://www.100md.com
2.凋亡在肿瘤治疗中的初步应用
近来的实验揭示凋亡在预防肿瘤中发挥中心作用。对凋亡对肿瘤抑制效应的评价研究正在推动新的肿瘤治疗方法和治疗策略的设计，特别是促进肿瘤的凋亡率。在这方面研究最多的是P53。P53阴性对传统DNA损伤治疗缺乏反应。大量体外实验提示，在P53阴性的肿瘤细胞中重新导入P53将调节其显型。靶细胞将识别其为恶性细胞，继而导致生长静息及肿瘤细胞凋亡，至少这一转染将使靶细胞对传统治疗敏感。目前已有这一方面的临床实验报道，Roth[22]等用腺病毒wtp-53肿瘤内注射治疗了28例失去手术时机的非小细胞肺癌患者，2个病人中部分缓解，16病人肿瘤稳定。直接对凋亡的调节不应被视为P53治疗肿瘤的唯一基础。有人将不能表达E1B蛋白的突变腺病毒用于治疗，E1B能灭活P53——推测这一功能可能是为了逃避凋亡而允许病毒繁殖——缺乏此蛋白该病毒只能在P53阴性的细胞中繁殖，从而引起细胞溶解。这种溶解P53阴性细胞的病毒被用于鼠肿瘤模型，诱导了肿瘤消退。
, 百拇医药
总之，无论是对凋亡途径的直接调节或是从凋亡过程更深一层的理解出发，以凋亡为基础的肿瘤治疗都是一个方兴未艾而前景诱人的治疗措施。最终，可以设想我们能了解某个肿瘤的个性化特征，从而容许我们采取精确的治疗方案，获得最佳的治疗效果。
参考文献
1 De Angelis PM,Stokke T,Thorstensen L.Apoptosis and expression of Bax,and bcl2 apoptotic regulatory proteins in colorectal carcinomas,and association with p53 genotype/phenotype.Mol Pathol，1998 Oct，51(5)：254
2 Kikuchi Y,dinjens WN,Bosman FT.Proliferaton,and apoptosis in proliferative lesions of the colon and rectum.Virchows Arch，1997 Aug，431(2):111
, http://www.100md.com
3 Frommel TO,Zarling EJ.Chronic inflammation and cancer:potential role of Bcl-2 gene family members as regulators of cellular antioxidant status.Med Hypotheses，1999 Jan，52(1):27
4 McDonnell TJ,Deane N.Progression from lymphoid hyperplasia to high-grade malignant lymphoma in mice transgenic for the t(14∶18).Nature，1991，349:254
5 Koty PP,Zhang H,Levitt Ml Antisense bcl-2 treatment increases programmed cell death in non-small cell lung cancer cell lines.Lung Cancer，1999 Feb，23(2):115
, 百拇医药
6 Ogura E,Senzaki H,Yamamoto D Prognostic significance of Bcl-2，Bcl-xL/S,Bax and Bak expressions in colorectal carcinomas.Oncol Rep 1999 Mar-Apr，6(2):365
7 Harvey M,Vogel H,Morris D et al.Amutant p53 transgene accelerates tumour development in heterozygous but not nullizygous p53-deficient mice.Nature Genet，1994，8:66
8 Harris AW,Pinkert CA,Crawford M et al.The u-myc transgenic mouse.A model for highincidence spontaneous lymphoma and leukemia off earrly Bcells J Exp Med，1998，167:353
, 百拇医药
9 Park IC,Park MJ,Lee SH.Imcreased susceptibility of the c-Myc overexpressing cell line,SNU-16,to TNF-alpha.Cancer Lett，1998 Mar，13;125(1-2):17
10 Akiko S,David EF.P53 inlife and death.Clin Cancer Res 96;2(3):345
11 Pardie CA,Harrison DJ,Peter Aet al.Tumour incidence spectrum and ploidy in mice with a large deletion in the P53 gene.Oncogene，1994，9:603
12 Bunz F,Hwang PM,Torrance C Disruption of P53 in human cancer cells alters the responses to therapeutic agents.J ClinInvest，1999 Aug，104(3):263
, 百拇医药
13 Tatebe S,Matsuura T,Endo K.Adenovirus-mediated transfer of wild-type p53gene results in apoptosis or growth arrest in human cultured gastric carcinoma cells.Int J Oncol，1999 Aug，15(2):229
14 Fudazawa T,Fujiwara T,Morimoto Y.Differential involvement of the CD95(Fas/APO-1)receptor/ligand system on apoptosis induced by the wild-type p53gene transfer in human cancer cells.Oncogene，1999 Apr 1，18(13):2189
15 Nakano K,Yamagishi H,Oka,T,Sakai T Anovel approach for cancer chemoprevention referred to as "gene-regulating chemoprevention Nippon Geka Gakkai Zasshi，1998 Jun，99(6):373
, 百拇医药
16 Gomyo Y,Ikeda M,Osaki M Expression of p21(wafl/cipl/sdil),but notp53protein,is a factor in the survival of patients with advanced gastric carcinoma Cancer，1997 Jun 1，79(11):2067
17 Schwartz B,Avivi-Green C,Polak-Charcon S.Sodium butyrate induces retinoblastoma protein dephosphorylation,p16 expression and growth arrest of colon cancer cells.Mol Cell Biochem，1998Nov，188(1-2):21
18 Haas-Kogan DA,Kogan SC,Levi D et al.Inhibition of apoptosis by the tetinoblastoma gene product.EMBO J，1995，14:461
, 百拇医药
19 Nidhans,G.A.et al.Human lung cancer cells express Fas ligand,Cancer res，1997，57：1007
20 Bonnotte B,Favre N,Reveneau S,Cancer cell sensytization,to fas-mediated apoptosis by sodium butyrate.Cell Death Differ，1998 Jun,5(6):480
21 Micheau O,Hammann A,Solary E.Mar 24;256(3):603-7 STAT-1-independent upregulation of FADD and procaspase-3 and -8 in cancer cells treated with cytotoxic drugs.Biochem biophys Res Commun，1999
22 Swisher SG,Roth JA,Nenumaitis J.Adenovirus-mediated p53 gene transfer in advanved non-small-cell lung cancer.J Natl Cancer Inst，1999 May，5;91(9):763, http://www.100md.com
单位：第三军医大学西南医院普外科(400038)
关键词：
重庆医学990655 随着对凋亡的不断深入的研究，科学家们逐步认识到凋亡具有重要的生物学意义，不仅维持细胞群体数量的自身稳定，胚胎发育和免疫克隆的选择，而且在肿瘤发生，清除转化细胞、细胞损伤反应、抗肿瘤药物治疗等方面均具有十分重要的作用。正是因为如此，凋亡的分子机制作为生命科学中一个研究热点引起越来越广泛的注意。目前的研究普遍认为肿瘤的发生不仅由于细胞过度增殖，同时存在细胞凋亡的减少。其中癌基因对凋亡的启动和调节起到重要作用。本文对参与肿瘤凋亡调节的几个主要癌基因的最新进展进行综述。
1.调节凋亡的癌基因
1.1 Bcl-2家族 Bcl-2首先在人类滤泡性淋巴瘤细胞中tl：18染色体易位的断点发现、命名(B细胞淋巴瘤/白血病基因2)，Bcl-2蛋白由279个氨基酸组成，整合于线粒体内膜、核膜、内质网膜上，是凋亡抑制基因，Bcl-2过度表达使DNA损伤细胞持续存在，导致肿瘤发生，与多种肿瘤的发生有关。正常大肠粘膜Bcl-2表达于隐窝下半部、干细胞增殖带，而浅表上皮表达缺失。有实验观察到大肠腺瘤及腺癌上皮全层染色阳性且染色阳性率高于正常上皮。Bcl-2在结肠癌中的表达强度与P53状态有关，在P53阳性的组织中Bcl-2表达亦增强，而组织自发凋亡减弱[1]。Kikuchi Y等分析了在增殖性结肠息肉、结肠腺瘤、 腺瘤癌变及腺癌中Bcl-2的表达、细胞增殖及凋亡情况，发现在癌变过程中细胞增殖率逐渐增加，而凋亡则明显减弱，Bcl-2在腺瘤表达最强，腺瘤癌变时Bcl-2表达明显减弱，虽然腺癌中Bcl-2表达阳性率达20%，但仍明显低于在腺瘤的表达水平。同时癌变过程中伴随P53表达增强并向胞浆移位及C-myc表达增强，但Bcl-2表达的减弱并不伴随凋亡的增强，其癌变过程中的作用有待阐明[2]。而Frommel等的结果则显示Bcl-2可能参与了慢性胃肠道炎症癌变率增高的机制，在慢性胃肠道炎症中，Bcl-2表达增强虽然有利于防止粘膜细胞为炎症氧介质损伤，但亦因使细胞凋亡减弱，延长了细胞生存，增强了致癌突变在细胞中的堆积，从而增加了癌变率[3]。
, 百拇医药
为检测Bcl-2过度表达在活体中的生物学效应，有实验建立了转基因的小鼠系，将Bcl-2转染于免疫球蛋白增强子的调控之下(Bcl-2-Ig)。这一结构将使B淋巴细胞过度表达Bcl-2，理论上将导致小鼠发生滤泡状淋巴瘤。Bcl-2-Ig小鼠发现静息期B细胞的多克隆滤泡状扩张。由于这些细胞是非增生性的，因此推测细胞数量的增加是由于Bcl-2抑制凋亡后细胞生存延长所致。经过约一年的潜伏期，15%的Bcl-2-Ig小鼠发生了侵袭B淋巴瘤[4]，分析约有50%的肿瘤中发现C-myc过度表达。多个实验表明C-myc与Bcl-2间存在协同作用。当两种损害在细胞内同时出现时一个介导凋亡减弱，另一个使细胞快速转化，这一协同作用可使细胞不断克隆扩增、增加基因的不稳定性从而最终导致恶性肿瘤。Bcl-2的过度表达可通过抑制凋亡影响化疗效果，转染了Bcl-2的小细胞肺癌细胞株对一些抗癌药物的耐受性上升，而转染反义寡核苷酸则使Bcl-2水平下降、凋亡增强[5]。
Bax是Bcl-2家族中的成员，由6个外显子组成，编码21KD蛋白，分布于胞浆。Bax可自身形成二聚体，亦可与Bcl-2的形成异源二聚体，当bax蛋白表达，并与Bcl-2蛋白聚合则加速细胞死亡。Bcl-2与bax表达程度与比例决定接受调亡信号后的命运。Bcl-2缺乏小鼠尽管也能正常发育，但很快发生细胞凋亡，而bax缺乏雄鼠则发生输精管异常及无精症，使细胞增生及发育不全。在已知的所有Bcl-2家族蛋白中，仅Bax的表达与结肠癌的预后有关，提示预后较好[6]。
, 百拇医药
1.2 C-myc C-myc是调控细胞增殖的主要基因，定位于人的第8号染色体上。编码2个磷酸蛋白(P62和P67)。P62粘附于核内DNA，部分定位于胞浆，为一转录因子，与细胞增殖与癌变关系密切。已在许多肿瘤中发现C-myc的高表达，揭示引起C-myc高表达的损害在恶性转化中起重要作用。体外实验揭示其为一促进细胞分化及有丝分裂的基因，C-myc表达缺失能阻止培养的造血细胞[7]及成纤维细胞的增殖，成纤维细胞过度表达C-myc足以促进处于增殖周期及静息期的细胞进入持续增殖状况。当将野生型成纤维细胞培养于低血浆培养液时，发现C-myc下调，同时发现进入周期的细胞大量静息于G1期。如果，将转染C-myc基因的成纤维细胞再培养于低血浆培养液中时，发现尽管细胞增生明显增强，但细胞数并不增多。进一步分析显示细胞凋亡率亦明显上升。说明细胞一旦增殖障碍，C-myc可启动凋亡。提示一个单一损害引起的野生型细胞的C-myc的异常表达可能在体内并不足以细胞转化。尽管C-myc能促进细胞过度增生，但在体内的低生长因子的状况下，因同时存在C-myc依赖的细胞凋亡，这样就削弱了其克隆扩增作用，甚至当细胞产生时即被从组织中清除。因此可以说，当孤立的考虑C-myc的效应时，可以基本上将其认为是一个自限性基因。
, 百拇医药
但当考虑到C-myc突变与肿瘤产生相关时，这一观点又显得有缺陷。唯一可能解释是C-myc发挥作用与其它基因损害存在协同作用。比如，在一存在影响细胞增殖或凋亡的突变细胞中，C-myc过度表达将导致这两种途径失衡，这一失衡的后果将是细胞被清除、长期生存或过度增生。若为后两种结果，将最终导致细致恶性转化。过度表达C-myc的转基因动物模型的建立提供我们直接检测C-myc依赖的凋亡对体内肿瘤发生影响的机会。Burkitt淋巴瘤是以C-myc位点染色体易位为特征的一种肿瘤。通过转染C-myc来模拟这一现象的转基因动物在5个月的潜伏期后，有90%的动物发生B细胞淋巴瘤[8]。在潜伏期期间，观察到血中B淋巴细胞大量增殖，同时凋亡水平易明显增高。Park IC等发现C-myc在TNF-α诱导的肿瘤细胞凋亡中起作用，在C-myc高表达的SNU-16胃癌细胞中，TNF-α诱导凋亡的反应明显减弱[9]。
1.3 P53 P53定位于17号染色体短臂(17q13.1)，有11个外显子，P53基因产生的野生型P53蛋白是Mr53000，有393个氨基酸的核磷酸化蛋白，可分别与DNA、RNA聚合酶连接，作为核转录因子调节相关基因的表达。其主要功能是调节细胞周期，促进G1期细胞进入S期，促进细胞凋亡，起分子警察的作用，控制基因组完整性。当DNA受损时，P53表达增强，使DNA损伤的细胞发生凋亡，还可激活WAF-1基因表达P21蛋白，使增殖细胞终止于G1期，同时过度表达P53及bax时，后者可解除Bcl-2对凋亡的抑制作用[10]，从而起到协同作用。P53基因的突变产生突变型P53能与野生型P53亚单位结合形成寡聚体，干扰其功能使增殖失控。促进细胞增殖，同时突变型P53还可抑制C-myc介导的凋亡。
, 百拇医药
P53对细胞突变率的影响：预计若缺乏P53依赖的凋亡途径将导致DNA损伤细胞增加。在运用短期的前B细胞培养或转染P53的成纤维细胞株的实验中，揭示了缺乏P53能增加基因毒性刺激后的突变细胞数量。在活体实验中应用DLB-1位点作为突变标志，亦显示缺乏P53能增加小鼠小肠细胞的突变率[11]，这一现象亦仅出现于高水平DNA损害后。综合以上，不同的实验均支持P53在阻碍突变获得中其一定的作用。但这并不是唯一机制，特别是当低水平DNA损害时，凋亡的发生是对DNA损害的一个重要反应。因此，当突变率与克隆生存被单独计数时，显示在生存克隆中突变率不受P53状态影响，但P53缺失却能增加突变子代细胞数量，因其增强了细胞生存。因此，P53缺失增加DNA受损细胞量是因为凋亡减弱的直接后果。
P53功能缺失对体内肿瘤形成的影响：在人体内多种肿瘤中均观察到野生型P53的表达缺失和突变型P53表达增强的现象。利用转基因动物的研究亦提示P53的缺失对肿瘤的生成起重要作用。大多数P53-/-小鼠虽然正常出生，但却迅速发生，特别是胸腺系肿瘤”；P53+/-小鼠产生淋巴瘤及肉瘤机率高于P53+/+小鼠，但低于P53-/-小鼠，并且存在一个较长的潜伏期。用P53阴性基因方法结合无P53鼠的实验强烈支持这一突变类型通过阻滞野生型P53功能使小鼠易发生肿瘤[7]。进一步研究发现P53缺失并不能单独致瘤：利用DMBA这一致癌剂涂抹于小鼠皮肤，将导致肿瘤生成。TPA可以加速DMBA的致瘤进程。起初导致多发性乳头状瘤，2个月内一部分乳头状瘤转变为癌。Kemp等利用这一多阶段的肿瘤生成模型研究P53状况对不同阶段肿瘤生成的影响。给P53-/-小鼠涂抹TPA，没有发生乳头状瘤，说明P53缺失并不足以启动肿瘤生成。实际上资料显示P53这一显型反而限制乳头状瘤的形成。P53状况对乳头状瘤形成的潜伏期的影响在+/+、+/-、-/-三种动物间相关不显著，再一次揭示在肿瘤形成的这一阶段存在其它基因损害作用。而乳头状瘤向癌转变的过程显得高度依赖P53状况。 在P53缺失小鼠恶性转化过程发生更快，而且肿瘤侵袭性更强。
, 百拇医药
P53的表达状况对肿瘤化疗放疗的敏感性的影响依药物类型不尽一致。P53缺失的结肠肿瘤细胞株对DNA损伤试剂敏感性升高，可能与缺失P53后不能诱导P21等CDK抑制蛋白(CKI)表达，细胞大量进入S期，从而对DNA损伤试剂增敏。而P53功能缺失细胞对于抗代谢药物如5-FU耐药，P53对5-FU化疗的效应不依赖P21，并且发现其原因可能与RNA代谢紊乱有关[12]。Zheng等的研究显示P53突变的结肠癌细胞对5-FU及羟基喜树碱的凋亡敏感性较无P53突变细胞低。tatebs等利用P53腺病毒载体Axca-P53转染人6株胃癌细胞株，对MKN-1引起明显细胞凋亡，对MKN-45，MKN-74及KARO-Ⅲ细胞引起周期静息，而对TMK-1及OCUM-2细胞没有效应，在所有转染细胞均有P21表达增强，而仅在MKN-1细胞bax、bcl-xl蛋白表达增强。提示bcl-2在P53介导的细胞凋亡中发挥重要作用[13]。向P53功能丧失的H1299肺癌细胞株及DLD-1、SW620结肠癌细胞株转染wtp53，迅速引起凋亡，并发现CD95表达提高。CD95激动性抗体CH11可以增强H1299细胞的凋亡，对于DLD-1及SW620细胞在4H9存在时反而增强。提示P53介导的细胞凋亡亦可通过Fas/FasL途径实现[14]。
, 百拇医药
1.4 WAF-1 WAF-1是野生型P53的一个活化片段(wide type p53 activated fragement 1),为一种凋亡促进基因，属于CDK抑制蛋白家族(CIP-KIP)。其作用机理如下：CDK酶的活性要cyclin参与，WAF-1的蛋白产物P21通过与cyclin及PCNA等作用形成复合物，从而抑制CDK活性(CDK为一参与使细胞进入S期的酶)，使细胞终止于G1而发生凋亡。Chen等进行肿瘤细胞培养时，表明过度表达WAF-1时产生的P21蛋白可抑制肿瘤细胞增生。Waldman等的研究表明，WAF-1缺失的肿瘤细胞对射线、化疗等介导的凋亡反应减弱。Nakano等发现5.0mM的丁酸钠可通过与P21的SP1位点作用，诱导结肠癌细胞株WiDr凋亡增强，并且P21在人类肿瘤中突变率低，从而提出转染抑癌基因结合化疗的“基因调节化疗”(gene regulating chemoprevention)的治疗方案[15]。Gomyo Y等观察到P21的表达与胃癌的预后有关，93例病人中有30例P21表达阳性，P21+患者的5年生存率为68.4%，明显高于P21-者(38%)[16]。
, 百拇医药
1.5 Rb Rb是一种抑癌基因，缺失Rb基因功能经常与肺、乳腺、前列腺、膀胱肿瘤相关。同时人Rb杂合子将几乎100%导致视网膜母细胞瘤，很多人将在童年时间发生骨肉瘤。PRb是一个110K道尔顿的磷酸蛋白，其作用是通过隔离转录因子复合物E2F家族，Rb与E2F的相互作用能抑制特异性下游基因的转录上调，从而阻止DNA的大量合成，防止细胞进入S期。从大量资料看来PRb是P53依赖的G1期生长静息的下游介质之一，当PRb被CDK4、6-cyclinD、A、E复合物磷酸化后释放出E2K。从而促进下游基因的转录。PRb的磷酸化具有周期特异性。G0/G1期主要是未磷酸化的Rb(110Kd)，而磷酸化的蛋白主要见于G2期(112-114Kd)。PRb的磷酸化可为CDK激酶抑制蛋白(包括CIP/KIP家族如P21、P27、P57及INK4/CDKN家族如P15、P18、P16、P19)所抑制，从而使细胞静息于G1期。PRb在高分化及早期结肠癌中表达较强，而P53与表达存在负相关[17]。
, 百拇医药
为进一步研究活体组织对Rb基因功能的需求，建立了Rb+/+至-/-嵌合体小鼠模型，尽管Rb-/-小鼠有较高的胚胎致死率，但出生的小鼠的所有组织均含有一定比例的Rb-/-细胞。该小鼠肿瘤生成仅在腺垂体出现，瘤细胞基因显型为Rb-/-。所有Rb-/-细胞理论上均具备无限增殖能力，但这与所有肿瘤增多不侵出腺垂体这一事实显得自相矛盾。一个可能的解释是Rb-/-细胞为凋亡显型，实际上检测Rb嵌合体动物揭示细胞增殖和凋亡增加均存在，特别是视网膜及晶体。因此推测一些有Rb缺失引起的增生失常可通过凋亡机制得到限制。继而可推测Rb缺失导致肿瘤发生至少要依赖于另一途径的协同作用。但也有实验显示在另外一些组织中这种通过凋亡的安全机制似乎并不存在或存在不足，包括鼠的垂体细胞及视网膜细胞为进一步研究这一安全网络，建立了Rb及P53的突变动物模型。显示在Rb-/-动物的凋亡部分 为P53依赖性的，两 者均缺陷的胚胎在晶体产生过程中不在显示广泛凋亡及出现未分化晶体细胞。Rb+/-、P53-/-动物获得的资料揭示P53在限制Rb-/-细胞扩增中起重要作用。因为这一类动物产生了较单一基因显型动物更多的肿瘤类型，包括胰岛细胞肿瘤细胞、支气管上皮增生、视网膜增生、成松果体细胞瘤。综上所述，缺失Rb功能与C-myc促增生一样，易感肿瘤，可能是因为增加了影响细胞死亡的其它突变的选择压力。近来研究显示这并不是Rb缺失致瘤的唯一因素，因为转染野生型Rb于Rb阴性的SAOS-2细胞株显示Rb对保护放射诱导凋亡有直接作用[18]。
, 百拇医药
1.6 Fas及Fas配体：Fas属于肿瘤坏死因子超家族之一员。其基因定位于人10号染色体长臂，表达含325个氨基酸残基的跨膜蛋白，其胞外区含富半胱氨酸的重复区，胞内区含一“死亡区”。当FasL与Fas结合后使Fas发生交联，从而引发Caspase级联反应导致细胞凋亡。活化的T细胞同时表达Fas及FasL，使其既可以通过Fas来杀伤靶细胞，也可杀伤T细胞来控制自身数量，下调免疫。研究表明肿瘤细胞可通过多种途径逃避Fas介导的细胞凋亡：①在多种肿瘤如肝细胞癌Fas表达水平下调；②肿瘤细胞可分泌可溶性Fas受体，能与T淋巴细胞的FasL结合从而阻断其杀伤肿瘤细胞；③肿瘤细胞能表达FasL，从细胞自身凋亡。这种现象被称为免疫特权，包括结肠癌、黑色素瘤、星型胶质细胞瘤，肺癌、肝癌等均具有免疫特权现象[19]。Bonnote等发现应用丁酸钠部分纠正结肠癌细胞的这一免疫特权，表达Fas的结肠癌细胞株与可溶性FasL混合培养不引起明显的凋亡，当加入丁酸钠后8个细胞株中有7个凋亡明显增强，并且使细胞对TNF-α的凋亡敏感性增强，但其作用机制并不明确，不涉及Fas受体、Bcl-2/Bax表达变化，亦无胞内FADD(FAS相关的死亡功能区)的变化[20]。Fas凋亡途径还参与了多种抗癌药物的作用机制，羟基喜树碱、强力霉素、丝裂霉素等均可诱导结肠癌细胞Fas受体、FADD、前天冬氨酸酶(Caspase-8、-3及2L)的表达上调[21]。
, http://www.100md.com
2.凋亡在肿瘤治疗中的初步应用
近来的实验揭示凋亡在预防肿瘤中发挥中心作用。对凋亡对肿瘤抑制效应的评价研究正在推动新的肿瘤治疗方法和治疗策略的设计，特别是促进肿瘤的凋亡率。在这方面研究最多的是P53。P53阴性对传统DNA损伤治疗缺乏反应。大量体外实验提示，在P53阴性的肿瘤细胞中重新导入P53将调节其显型。靶细胞将识别其为恶性细胞，继而导致生长静息及肿瘤细胞凋亡，至少这一转染将使靶细胞对传统治疗敏感。目前已有这一方面的临床实验报道，Roth[22]等用腺病毒wtp-53肿瘤内注射治疗了28例失去手术时机的非小细胞肺癌患者，2个病人中部分缓解，16病人肿瘤稳定。直接对凋亡的调节不应被视为P53治疗肿瘤的唯一基础。有人将不能表达E1B蛋白的突变腺病毒用于治疗，E1B能灭活P53——推测这一功能可能是为了逃避凋亡而允许病毒繁殖——缺乏此蛋白该病毒只能在P53阴性的细胞中繁殖，从而引起细胞溶解。这种溶解P53阴性细胞的病毒被用于鼠肿瘤模型，诱导了肿瘤消退。
, 百拇医药
总之，无论是对凋亡途径的直接调节或是从凋亡过程更深一层的理解出发，以凋亡为基础的肿瘤治疗都是一个方兴未艾而前景诱人的治疗措施。最终，可以设想我们能了解某个肿瘤的个性化特征，从而容许我们采取精确的治疗方案，获得最佳的治疗效果。
参考文献
1 De Angelis PM,Stokke T,Thorstensen L.Apoptosis and expression of Bax,and bcl2 apoptotic regulatory proteins in colorectal carcinomas,and association with p53 genotype/phenotype.Mol Pathol，1998 Oct，51(5)：254
2 Kikuchi Y,dinjens WN,Bosman FT.Proliferaton,and apoptosis in proliferative lesions of the colon and rectum.Virchows Arch，1997 Aug，431(2):111
, http://www.100md.com
3 Frommel TO,Zarling EJ.Chronic inflammation and cancer:potential role of Bcl-2 gene family members as regulators of cellular antioxidant status.Med Hypotheses，1999 Jan，52(1):27
4 McDonnell TJ,Deane N.Progression from lymphoid hyperplasia to high-grade malignant lymphoma in mice transgenic for the t(14∶18).Nature，1991，349:254
5 Koty PP,Zhang H,Levitt Ml Antisense bcl-2 treatment increases programmed cell death in non-small cell lung cancer cell lines.Lung Cancer，1999 Feb，23(2):115
, 百拇医药
6 Ogura E,Senzaki H,Yamamoto D Prognostic significance of Bcl-2，Bcl-xL/S,Bax and Bak expressions in colorectal carcinomas.Oncol Rep 1999 Mar-Apr，6(2):365
7 Harvey M,Vogel H,Morris D et al.Amutant p53 transgene accelerates tumour development in heterozygous but not nullizygous p53-deficient mice.Nature Genet，1994，8:66
8 Harris AW,Pinkert CA,Crawford M et al.The u-myc transgenic mouse.A model for highincidence spontaneous lymphoma and leukemia off earrly Bcells J Exp Med，1998，167:353
, 百拇医药
9 Park IC,Park MJ,Lee SH.Imcreased susceptibility of the c-Myc overexpressing cell line,SNU-16,to TNF-alpha.Cancer Lett，1998 Mar，13;125(1-2):17
10 Akiko S,David EF.P53 inlife and death.Clin Cancer Res 96;2(3):345
11 Pardie CA,Harrison DJ,Peter Aet al.Tumour incidence spectrum and ploidy in mice with a large deletion in the P53 gene.Oncogene，1994，9:603
12 Bunz F,Hwang PM,Torrance C Disruption of P53 in human cancer cells alters the responses to therapeutic agents.J ClinInvest，1999 Aug，104(3):263
, 百拇医药
13 Tatebe S,Matsuura T,Endo K.Adenovirus-mediated transfer of wild-type p53gene results in apoptosis or growth arrest in human cultured gastric carcinoma cells.Int J Oncol，1999 Aug，15(2):229
14 Fudazawa T,Fujiwara T,Morimoto Y.Differential involvement of the CD95(Fas/APO-1)receptor/ligand system on apoptosis induced by the wild-type p53gene transfer in human cancer cells.Oncogene，1999 Apr 1，18(13):2189
15 Nakano K,Yamagishi H,Oka,T,Sakai T Anovel approach for cancer chemoprevention referred to as "gene-regulating chemoprevention Nippon Geka Gakkai Zasshi，1998 Jun，99(6):373
, 百拇医药
16 Gomyo Y,Ikeda M,Osaki M Expression of p21(wafl/cipl/sdil),but notp53protein,is a factor in the survival of patients with advanced gastric carcinoma Cancer，1997 Jun 1，79(11):2067
17 Schwartz B,Avivi-Green C,Polak-Charcon S.Sodium butyrate induces retinoblastoma protein dephosphorylation,p16 expression and growth arrest of colon cancer cells.Mol Cell Biochem，1998Nov，188(1-2):21
18 Haas-Kogan DA,Kogan SC,Levi D et al.Inhibition of apoptosis by the tetinoblastoma gene product.EMBO J，1995，14:461
, 百拇医药
19 Nidhans,G.A.et al.Human lung cancer cells express Fas ligand,Cancer res，1997，57：1007
20 Bonnotte B,Favre N,Reveneau S,Cancer cell sensytization,to fas-mediated apoptosis by sodium butyrate.Cell Death Differ，1998 Jun,5(6):480
21 Micheau O,Hammann A,Solary E.Mar 24;256(3):603-7 STAT-1-independent upregulation of FADD and procaspase-3 and -8 in cancer cells treated with cytotoxic drugs.Biochem biophys Res Commun，1999
22 Swisher SG,Roth JA,Nenumaitis J.Adenovirus-mediated p53 gene transfer in advanved non-small-cell lung cancer.J Natl Cancer Inst，1999 May，5;91(9):763, http://www.100md.com