胆道感染时中性粒细胞对肝细胞功能影响的实验研究
作者：黄显凯 朱锡光 韩本立
单位：第三军医大学大坪医院普外科(重庆 400042)
关键词：胆道感染；中性粒细胞；肝功能
胆道感染时中性粒细胞对肝细胞功能影响的实验研究 摘 要 目的：探讨PMN在胆道感染肝损害中的作用。方法：观察胆道感染大鼠PMN对离体肝细胞功能及能量代谢的影响。结果：显示胆道感染大鼠各时相点PMN与正常肝细胞共同孵育，其上清LDH及GPT水平均明显升高(P<0.01)，并呈进行性升高，24小时水平最高；其上清ATP含量明显降低(P<0.01)，并呈进行性降低，24小时水平最低。结论：胆道感染时肝脏PMN聚集对肝细胞功能具有损害作用。
The Effects of PMN on Function of Hepatocytes in Acute Cholangitis
, http://www.100md.com
Huang Xiankai,Zhu Xiguang,Han Benli.Department of
Surgery,Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing,400042.
Abstract Objective:To study the effects of polymorphonuclear (PMN) in hepatic damage in acute cholangitis. Methods:The effects of PMN on function of hepatocytes in acute cholangitis were investigated. Results: Level of LDH and GPT in the supernatum increased obversely(P<0.01),and level of ATP in the supernatum reduced obversely(P<0.01) when hepatocytes were incubated with PMN obtained from infected rats. Conclusion:The results suggested that PMN could cause functional damage of hepatocytes in acute cholangitis.
, 百拇医药
Key words: Cholangitis Polymorphonuclear Hepatic function
我们在实验研究中发现急性胆道感染大鼠肝窦及肝组织有大量PMN聚集，且PMN聚集的量与肝脏损害呈正相关。本实验观察胆道感染大鼠PMN对离体肝细胞功能及能量代谢的影响，从而进一步证实PMN在严重胆道感染时肝损害中的作用。
1 材料与方法
1.1 动物模型及分组
Wistar大鼠，雌雄不拘，体重200～250g，乙醚吸入麻醉，无菌条件下开腹，分离胆总管，结扎远端，近端注入0.3ml大肠杆菌液(1×109/ml)，关腹，造成急性胆管炎模型。同样条件下开腹，游离胆总管，然后关腹，作为假手术对照。分别于术后3、6、12及24小时取材，每个时相点及正常对照组各6只动物。
, 百拇医药
分离胆道感染大鼠及假手术大鼠PMN制成PMN悬液，分离正常大鼠肝细胞，分别将3、6、12及24小时各时相点PMN与肝细胞共同孵育2小时，然后测定指标。按PMN与肝细胞的不同比例分组：Ⅰ组：胆管炎PMN与正常肝细胞的比例为10∶1；Ⅱ组：假手术PMN与正常肝细胞比例10∶1；Ⅲ组：胆管炎PMN与正常肝细胞比例5∶1；Ⅳ组：假手术PMN与正常肝细胞比例5∶1。
1.2 肝细胞的分离培养参照黄俊勇的方法进行[1]。
1.3 大鼠PMN分离 参照严鸣的方法进行[2]。
1.4 培养肝细胞ATP测定[3]
按Rolland的方法进行，细胞悬液离心100rpm，10min，弃上清，沉淀中加入1ml3%HCLO4冷冻离心3000G8分钟，上清中加500μlIMKOH，离心弃沉淀，标本用去离子水1∶5稀释，荧光酶法测定。
, 百拇医药
1.5 常规生化测定LDH、BT，赖氏法测定GPT
2 结 果
2.1 培养上清LDH及GPT水平变化
假手术对照大鼠PMN与正常肝细胞共同培养，其上清LDH及GPT水平均较低，且各时相点及不同比例的PMN之间均无明显差异(P>0.05)。胆道感染大鼠各时相点PMN与正常肝细胞共同孵育，其上清LDH及GPT水平均明显升高(P<0.01)，并呈进行性升高，24小时水平最高，PMN与肝细胞比例10∶1组比PMN与肝细胞比例5∶1组水平最高。见表1、2。
表1 培养上清LDH水平变化(IU/L)
组别
术后PMN分离时间
, http://www.100md.com
3h
6h
12h
24h
Ⅰ
4.75±1.16△△
6.87±0.91△△
8.47±2.29△△
10.50±1.66△△
Ⅱ
2.48±0.15
, http://www.100md.com
2.53±0.14
3.15±0.66
2.62±0.29
Ⅲ
3.70±0.60**
5.65±0.99**
7.13±1.05**
9.02±0.86**
Ⅳ
2.42±0.15
2.83±0.87
, 百拇医药
3.33±0.60
2.68±0.22
△△P<0.01与Ⅱ组比较；**P<0.01与Ⅳ组比较 表2 培养上清GPT水平变化(IU/L)
组别
术后PMN分离时间
3h
6h
12h
24h
Ⅰ
1.85±0.43△△
, http://www.100md.com
3.84±0.63△△
5.03±0.99△△
5.40±0.79△△
Ⅱ
0.98±0.26
1.08±0.26
1.33±0.23
1.28±0.38
Ⅲ
1.67±0.27**
3.37±0.61**
, http://www.100md.com
4.48±0.70**
4.78±0.50**
Ⅳ
0.95±0.31
1.08±0.25
1.28±0.26
1.30±0.34
△△P<0.01与Ⅱ组比较；**P<0.01与Ⅳ组比较
2.2 培养上清ATP水平变化
胆道感染大鼠各时相点PMN与正常肝细胞共同孵育，其上清ATP含量均较假手术大鼠PMN与正常肝细胞孵育组低(P<0.01)，且PMN与肝细胞比例10∶1组比5∶1组ATP水平下降更明显。见表3。
, 百拇医药
表3 培养上清ATP水平变化(nM/L)
组别
术后PMN分离时间
3h
6h
12h
24h
Ⅰ
0.42±0.10△
0.24±0.04△△
0.20±0.02△△
, 百拇医药 0.15±0.05△△
Ⅱ
0.57±0.10
0.53±0.08
0.50±0.08
0.49±0.10
Ⅲ
0.47±0.11**
0.27±0.05**
0.22±0.05**
0.18±0.04**
, 百拇医药
Ⅳ
0.60±0.10
0.60±0.10
0.50±0.08
0.50±0.09
△P<0.05，△△P<0.01与Ⅱ组比较，**P<0.01与Ⅳ组比较
3 讨 论
我们在实验中发现急性胆管炎时PMN在肝窦大量聚集，随着感染的发展，PMN穿过肝窦内皮细胞(HSEC)进入肝细胞周围，PMN在肝窦及肝细胞周围大量聚集与肝损伤密切相关；而CD11b、CD18、ICAM-1、E-selectint等细胞粘附分子参与PMN与HSEC粘附及穿越内皮迁移。那么PMN与HSEC粘附并穿越HSEC，到达肝细胞周围后是否对肝细胞直接产生损害作用呢?
, http://www.100md.com
本实验胆道感染大鼠各时相点PMN与正常肝细胞共同孵育，其上清LDH及GPT水平均明显升高，且各时相点呈进行性升高。LDH及GPT均为反映肝细胞功能较灵敏的重要指标，因此说明胆道感染时活化的PMN对肝细胞功能有明显损害作用。胆道感染大鼠各时相点PMN与正常肝细胞共同孵育，其上清ATP含量均较假手术大鼠PMN与正常肝细胞孵育组低。ATP是反映肝细胞能量代谢状态的重要指标，线粒体是细胞进行氧化磷酸化生成ATP的主要场所，ATP减少可能因肝细胞受损，肝细胞线粒体呼吸链功能障碍，氧化磷酸脱耦联，而丧失合成ATP的能力。
胆道感染时PMN被细胞因子和各种炎症介质活化，产生大量氧自由基，并释放MPO及弹性硬蛋白酶、胶原酶和明胶酶等各种蛋白水解酶，造成肝脏损害。氧自由基可直接造成肝细胞损伤，并使肝细胞线粒体受损，抑制线粒体呼吸功能[4，5]。活化的PMN释放MPO，MPO可将H2O2和氯离子转为次氯酸；次氯酸与胺反应生成氯胺。超氧阴离子及次氯酸是强氧化剂，可以氧化巯基，使氨基酸和蛋白质降解，从而造成细胞损伤。激活的PMN释放弹性硬蛋白酶、胶原酶和明胶酶等，这些酶半衰期长，可降解基质，攻击组织细胞，造成严重组织损伤，正常情况下机体内有大量α1-蛋白酶抑制物(α1-P1)，能很快与弹性硬蛋白酶结合使之失活，从而使组织细胞免受损伤。激活的PMN不仅可以增加酶的数量，而且通过产生氧自由基如H2O2等代谢产物使α1-蛋白酶抑制物失活，使弹性硬蛋白酶、胶原酶和明胶酶能更有效地起破坏作用，促进组织细胞损伤[5]。次氯酸与氯胺这些卤氧化物可与PMN释放的蛋白酶联合作用，增强对组织细胞的损伤。
, 百拇医药
参考文献
1 黄俊勇，冷欣夫.大鼠肝细胞的分离技术.细胞生物学杂志，1991，13(3)42
2 严鸣，龚肖崎，张亚霏。大鼠中性粒细胞的分离及糖皮质激素受体阻断率的测定。第二军医大学学报，1994，15(1)：85
3 Rolland CD,Brook SF, Gires GJ,et al.Glycine cytoprotection during lethalhepatocellular injury from adenosine triphosphate depletion.Gastroenterology，1992，102：2098
4 Lum H,Gibbs L,Lai L,et al.CE18 integrin-dependent endothelial injury:effects of opsonized zymosan and phorbol esther activation.J Leukoc Biol，1994，55：58
5 Jaeschke H.Pathogenetic mechanisms of acute liver failure.Zentralbl Chir，1994，119：309
6 Ossanna PJ,Test ST,Matheson NR,et al.Oxidative regulaiton of etastese-alpha-proteinase inhibitor interactions.J Clin Invest，1986，77：1939, 百拇医药
单位：第三军医大学大坪医院普外科(重庆 400042)
关键词：胆道感染；中性粒细胞；肝功能
胆道感染时中性粒细胞对肝细胞功能影响的实验研究 摘 要 目的：探讨PMN在胆道感染肝损害中的作用。方法：观察胆道感染大鼠PMN对离体肝细胞功能及能量代谢的影响。结果：显示胆道感染大鼠各时相点PMN与正常肝细胞共同孵育，其上清LDH及GPT水平均明显升高(P<0.01)，并呈进行性升高，24小时水平最高；其上清ATP含量明显降低(P<0.01)，并呈进行性降低，24小时水平最低。结论：胆道感染时肝脏PMN聚集对肝细胞功能具有损害作用。
The Effects of PMN on Function of Hepatocytes in Acute Cholangitis
, http://www.100md.com
Huang Xiankai,Zhu Xiguang,Han Benli.Department of
Surgery,Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing,400042.
Abstract Objective:To study the effects of polymorphonuclear (PMN) in hepatic damage in acute cholangitis. Methods:The effects of PMN on function of hepatocytes in acute cholangitis were investigated. Results: Level of LDH and GPT in the supernatum increased obversely(P<0.01),and level of ATP in the supernatum reduced obversely(P<0.01) when hepatocytes were incubated with PMN obtained from infected rats. Conclusion:The results suggested that PMN could cause functional damage of hepatocytes in acute cholangitis.
, 百拇医药
Key words: Cholangitis Polymorphonuclear Hepatic function
我们在实验研究中发现急性胆道感染大鼠肝窦及肝组织有大量PMN聚集，且PMN聚集的量与肝脏损害呈正相关。本实验观察胆道感染大鼠PMN对离体肝细胞功能及能量代谢的影响，从而进一步证实PMN在严重胆道感染时肝损害中的作用。
1 材料与方法
1.1 动物模型及分组
Wistar大鼠，雌雄不拘，体重200～250g，乙醚吸入麻醉，无菌条件下开腹，分离胆总管，结扎远端，近端注入0.3ml大肠杆菌液(1×109/ml)，关腹，造成急性胆管炎模型。同样条件下开腹，游离胆总管，然后关腹，作为假手术对照。分别于术后3、6、12及24小时取材，每个时相点及正常对照组各6只动物。
, 百拇医药
分离胆道感染大鼠及假手术大鼠PMN制成PMN悬液，分离正常大鼠肝细胞，分别将3、6、12及24小时各时相点PMN与肝细胞共同孵育2小时，然后测定指标。按PMN与肝细胞的不同比例分组：Ⅰ组：胆管炎PMN与正常肝细胞的比例为10∶1；Ⅱ组：假手术PMN与正常肝细胞比例10∶1；Ⅲ组：胆管炎PMN与正常肝细胞比例5∶1；Ⅳ组：假手术PMN与正常肝细胞比例5∶1。
1.2 肝细胞的分离培养参照黄俊勇的方法进行[1]。
1.3 大鼠PMN分离 参照严鸣的方法进行[2]。
1.4 培养肝细胞ATP测定[3]
按Rolland的方法进行，细胞悬液离心100rpm，10min，弃上清，沉淀中加入1ml3%HCLO4冷冻离心3000G8分钟，上清中加500μlIMKOH，离心弃沉淀，标本用去离子水1∶5稀释，荧光酶法测定。
, 百拇医药
1.5 常规生化测定LDH、BT，赖氏法测定GPT
2 结 果
2.1 培养上清LDH及GPT水平变化
假手术对照大鼠PMN与正常肝细胞共同培养，其上清LDH及GPT水平均较低，且各时相点及不同比例的PMN之间均无明显差异(P>0.05)。胆道感染大鼠各时相点PMN与正常肝细胞共同孵育，其上清LDH及GPT水平均明显升高(P<0.01)，并呈进行性升高，24小时水平最高，PMN与肝细胞比例10∶1组比PMN与肝细胞比例5∶1组水平最高。见表1、2。
表1 培养上清LDH水平变化(IU/L)
组别
术后PMN分离时间
, http://www.100md.com
3h
6h
12h
24h
Ⅰ
4.75±1.16△△
6.87±0.91△△
8.47±2.29△△
10.50±1.66△△
Ⅱ
2.48±0.15
, http://www.100md.com
2.53±0.14
3.15±0.66
2.62±0.29
Ⅲ
3.70±0.60**
5.65±0.99**
7.13±1.05**
9.02±0.86**
Ⅳ
2.42±0.15
2.83±0.87
, 百拇医药
3.33±0.60
2.68±0.22
△△P<0.01与Ⅱ组比较；**P<0.01与Ⅳ组比较 表2 培养上清GPT水平变化(IU/L)
组别
术后PMN分离时间
3h
6h
12h
24h
Ⅰ
1.85±0.43△△
, http://www.100md.com
3.84±0.63△△
5.03±0.99△△
5.40±0.79△△
Ⅱ
0.98±0.26
1.08±0.26
1.33±0.23
1.28±0.38
Ⅲ
1.67±0.27**
3.37±0.61**
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4.48±0.70**
4.78±0.50**
Ⅳ
0.95±0.31
1.08±0.25
1.28±0.26
1.30±0.34
△△P<0.01与Ⅱ组比较；**P<0.01与Ⅳ组比较
2.2 培养上清ATP水平变化
胆道感染大鼠各时相点PMN与正常肝细胞共同孵育，其上清ATP含量均较假手术大鼠PMN与正常肝细胞孵育组低(P<0.01)，且PMN与肝细胞比例10∶1组比5∶1组ATP水平下降更明显。见表3。
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表3 培养上清ATP水平变化(nM/L)
组别
术后PMN分离时间
3h
6h
12h
24h
Ⅰ
0.42±0.10△
0.24±0.04△△
0.20±0.02△△
, 百拇医药 0.15±0.05△△
Ⅱ
0.57±0.10
0.53±0.08
0.50±0.08
0.49±0.10
Ⅲ
0.47±0.11**
0.27±0.05**
0.22±0.05**
0.18±0.04**
, 百拇医药
Ⅳ
0.60±0.10
0.60±0.10
0.50±0.08
0.50±0.09
△P<0.05，△△P<0.01与Ⅱ组比较，**P<0.01与Ⅳ组比较
3 讨 论
我们在实验中发现急性胆管炎时PMN在肝窦大量聚集，随着感染的发展，PMN穿过肝窦内皮细胞(HSEC)进入肝细胞周围，PMN在肝窦及肝细胞周围大量聚集与肝损伤密切相关；而CD11b、CD18、ICAM-1、E-selectint等细胞粘附分子参与PMN与HSEC粘附及穿越内皮迁移。那么PMN与HSEC粘附并穿越HSEC，到达肝细胞周围后是否对肝细胞直接产生损害作用呢?
, http://www.100md.com
本实验胆道感染大鼠各时相点PMN与正常肝细胞共同孵育，其上清LDH及GPT水平均明显升高，且各时相点呈进行性升高。LDH及GPT均为反映肝细胞功能较灵敏的重要指标，因此说明胆道感染时活化的PMN对肝细胞功能有明显损害作用。胆道感染大鼠各时相点PMN与正常肝细胞共同孵育，其上清ATP含量均较假手术大鼠PMN与正常肝细胞孵育组低。ATP是反映肝细胞能量代谢状态的重要指标，线粒体是细胞进行氧化磷酸化生成ATP的主要场所，ATP减少可能因肝细胞受损，肝细胞线粒体呼吸链功能障碍，氧化磷酸脱耦联，而丧失合成ATP的能力。
胆道感染时PMN被细胞因子和各种炎症介质活化，产生大量氧自由基，并释放MPO及弹性硬蛋白酶、胶原酶和明胶酶等各种蛋白水解酶，造成肝脏损害。氧自由基可直接造成肝细胞损伤，并使肝细胞线粒体受损，抑制线粒体呼吸功能[4，5]。活化的PMN释放MPO，MPO可将H2O2和氯离子转为次氯酸；次氯酸与胺反应生成氯胺。超氧阴离子及次氯酸是强氧化剂，可以氧化巯基，使氨基酸和蛋白质降解，从而造成细胞损伤。激活的PMN释放弹性硬蛋白酶、胶原酶和明胶酶等，这些酶半衰期长，可降解基质，攻击组织细胞，造成严重组织损伤，正常情况下机体内有大量α1-蛋白酶抑制物(α1-P1)，能很快与弹性硬蛋白酶结合使之失活，从而使组织细胞免受损伤。激活的PMN不仅可以增加酶的数量，而且通过产生氧自由基如H2O2等代谢产物使α1-蛋白酶抑制物失活，使弹性硬蛋白酶、胶原酶和明胶酶能更有效地起破坏作用，促进组织细胞损伤[5]。次氯酸与氯胺这些卤氧化物可与PMN释放的蛋白酶联合作用，增强对组织细胞的损伤。
, 百拇医药
参考文献
1 黄俊勇，冷欣夫.大鼠肝细胞的分离技术.细胞生物学杂志，1991，13(3)42
2 严鸣，龚肖崎，张亚霏。大鼠中性粒细胞的分离及糖皮质激素受体阻断率的测定。第二军医大学学报，1994，15(1)：85
3 Rolland CD,Brook SF, Gires GJ,et al.Glycine cytoprotection during lethalhepatocellular injury from adenosine triphosphate depletion.Gastroenterology，1992，102：2098
4 Lum H,Gibbs L,Lai L,et al.CE18 integrin-dependent endothelial injury:effects of opsonized zymosan and phorbol esther activation.J Leukoc Biol，1994，55：58
5 Jaeschke H.Pathogenetic mechanisms of acute liver failure.Zentralbl Chir，1994，119：309
6 Ossanna PJ,Test ST,Matheson NR,et al.Oxidative regulaiton of etastese-alpha-proteinase inhibitor interactions.J Clin Invest，1986，77：1939, 百拇医药