红斑狼疮细胞试验的实验室诊断与进展
作者：王惠敏 陶恩喜
单位：宁夏回族自治区第二人民医院
关键词：
医学文选9906111
系统性红斑狼疮(SLE)是一种波及全身结缔组织，使多脏器受损害之慢性炎症性自身免疫性疾病。该病是一种累及多个系统，以慢性非化脓性炎症为特征，临床表现复杂多样化的结缔组织病，病因尚不完全明确，一般认为可能属于多因素性，即与遗传因素、病毒感染、内分泌因素、药物因素、环境因素等有关。SLE的实验室诊断，在早期主要依赖于检查红斑狼疮(LE)细胞，近年来已应用多种简便、快速、可靠的检测手段进行SLE自身抗体的测定，并在临床检验中得到广泛应用。本文简述这方面的进展。
1 LE细胞试验的应用与方法学改进
, http://www.100md.com 1948年，Hagraves等[1]在1例SLE患者的骨髓涂片中，偶然发现了一种吞噬了细胞核物质的细胞，此后，几经研究改进，可以在体外试验中大量获得这种细胞，并正式称之为红斑狼疮(LE)细胞，LE细胞的发现，对于SLE的诊断以及有关人类自身免疫性疾病的基础研究起过历史性的作用。
产生LE细胞的现象需要4个条件，即活的吞噬细胞、已损伤细胞的核、补体和LE因子，前三种为一般人体所共有，只有LE因子才是SLE所特有，并具诊断价值。LE因子是一种抗核蛋白的IgG抗体，它在补体的参与下，作用于细胞核，使核结构破坏，染色质松解，失去原有的致密结构，发生肿胀，形成均质化的团块，此团块旋被中性粒细胞所吞噬，形成LE细胞，有时少数团块未被吞噬，呈游离状态存在于涂片。上述4个因素缺一不可，而且最终又是根据细胞形态学加以确认的，因此，LE细胞试验存在着诸多的影响因素及局限性，其主要表现为敏感性差、特异性不强、不能定量而且操作较费时、技术因素影响大。以往检查LE细胞的方法大致有两类：一类是四种因素均来自病人自身血液，另一类是破损细胞的核(没有种属特异性、高低等动物的细胞核及培养细胞核均可)或活的吞噬细胞来自别人或别的生物。鉴于LE细胞试验存在上述的诸多影响因素，多年来，人们从LE细胞形成的4个因素着手，对该试验的某一个因素或几个因素进行多种改进，如浓集活的吞噬细胞(主要是中性粒细胞，罕见单核及嗜酸性粒细胞)；使用肝素抗凝血收集白细胞层涂片或用患者全血置37℃凝固后将血块加压通过金属筛等以期提高阳性率[1]；采用改良血块法，在标本中加入一定量受损的白细胞和补体[2，3]；在全血中加鼠肝细胞核[4]或采用改良基质片法[5]、去血小板后改良血块法[6]等。上述方法的应用均使LE细胞试验的阳性率有所提高，但是由于试验最终结果还是根据细胞形态学加以确认，试验过程中的各种因素特别是形态学观察上的多种影响因素及局限性必然会对试验结果产生很大影响。
, 百拇医药
2 自身抗体的检测与进展
随着研究的深入，人们发现形成LE细胞现象的关键因素是所谓“LE”因子。LE因子是一种r球蛋白，是针对细胞核的一种自身抗体。此后，人们纷纷从免疫学角度加以深入研究，建立了许多检测SLE患者各种自身抗体的方法，这些方法较之LE细胞试验不仅敏感性高，而且特异性更强，操作也更简便、快速，更具鉴别诊断价值。
众所周知，SLE是一种自身免疫性疾病，而自身抗体是自身免疫病的重要标志。国内外医学界都将检出自身抗体列为诊断自身免疫病的重要条件，各种自身免疫病均可测出一种或多种自身抗体。与SLE相关的自身抗体主要为抗核抗体(antinuclear antibody ANA)。ANA是以真核细胞的核成分为靶抗原的自身抗体的总称，ANA系非器官特异性的自身抗体，多种ANA靶抗原存在于细胞核内的染色质、核质、核仁的不同部位，分布不一。各种ANA有其相应的对应抗原和抗原决定基，其相关疾病也不尽一致。SLE免疫学检测首先应用的是总抗核抗体测定，其代表方法为间接荧光抗体法[7]，该法以大、小鼠的肝、肾组织冷冻切片等底物作为抗原片，在与以细胞核成分为靶抗原的自身抗体时，该抗体可与细胞核成分结合，通过间接荧光抗体法观测结果，根据细胞核着染荧光的图像，可分为4种(或6种)荧光图谱。
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由于该法检测的是总抗核抗体(ANA)，敏感性高，但特异性不够强，除SLE外，其它自身免疫病如全身硬皮病、多种药物引起的狼疮、类风湿性关节炎等也可出现阳性，如硬皮病阳性率可达40%[7]，甚至80%[8]。另外，该法操作虽较简单，但荧光抗体的质量和最适稀释度、底物片的种类与固定方法、荧光显微镜的质量及操作等均对检测结果有一定影响。
目前，临床检测SLE已从总抗核抗体(ANA)转向对SLE更具特异性的抗DNA抗体[9～12]。抗DNA抗体是以真核细胞的核成分中的染色质为靶抗原的抗核抗体。抗DNA抗体有三类：即抗ds-DNA，包括只与ds-DNA反应的和既与ds-DNA也与ss-DNA反应的两种；其次为抗ss-DNA，第三为抗z-DΝΑ，此类抗体亦包括只与z-DNA和既与z-DNA也与ss-DNA反应的两种。仅与ds-DNA反应的抗ds-DNA对SLE有极高的特异性，但出现频度极低，临床上检出的一般是指与ds-DNA和ss-DNA都反应的抗ds-DNA抗体。由于抗ds-DNA抗体对SLE有较高的特异性，已经修订的美国(1982)及我国(1985)诊断SLE的标准中都已列入抗ds-DNA的测定。抗ss-DNA抗体的特异性较差，除SLE外，其它的结缔组织病、药物诱发的LE、慢活肝等也可检出。抗z-DNA抗体对SLE有很高的特异性，90%以上的病人可测出，且抗体效价与疾病的活动性密切相关，与抗ds-DNA效价平行变动。
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抗ds-DNA的测定方法很多，如免疫沉降、间接血凝、间接荧光抗体(DNA斑点法、马疫锥虫法、短膜虫法)、间接酶标抗体染色(短膜虫)、ELISA、放射免疫测定等。但是，现有的放免法(Farr法)假阳性率较高[13]，高要用放射性同位素，难以推广。短膜虫免疫荧光法(CL.IFA)敏感性不高，且需要荧光显微镜等设备，亦难普及。近年来建立的ELISA因ds-DNA不易吸附在固相载体上，加之多数作者采用不均一的小牛胸腺DNA(CT.DNA)作为抗原，其稳定性和特异性不够理想。季晓辉等[14]以牛胸腺DNA为抗原建立了快速斑点免疫金银染色法(FD-IGSS)检测抗双链DNA抗体(Ads-DNA)，研究表明，FD-IGSS法批间、批内重复性好，结果稳定，与RIA、ELISA法相比，保持了相似的敏感性与特异性，但更简便实用，快速可靠。兰小鹏等[13]以纯化的不含单链DNA的大肠杆菌质粒双链DNA(ds-DNA)作为抗原，利用亲和素—生物素系统，其结合在硝酸纤维素(NC)膜上，建立了一种新的检测抗ds-DNA抗体的斑点免疫结合试验(DIBA)。由于抗ds-DNA抗体的检测，首要的是选择不含单链DNA(SS-DNA)和蛋白质成分的ds-DNA作为包被抗原，否则检出的抗体中包含了一部分抗ss-DNA或其他针对蛋白质的自身抗体，而缺乏特异性。文献报道[15]CT.DNA含有ss-DNA或在ds-DNA中存在ss-DNA区段，短膜虫的动基体除ds-DNA以外还含有组蛋白，因而都不是理想的ds-DNA抗原，DIBA法应用大肠肝菌pBR322质粒作为抗原是因为质粒是纯的ds-DNA，而且该质粒容易提取和纯化，又因ds-DNA很难直接吸附在固相载体上，而改用NC作为固相载体，并应用亲和素-生物素作为固相免疫法中的连接剂，因而缩短了反应时间，阳性率亦有所提高，且方法更为简便、迅速、可靠，不需任何仪器，国内亦有成品试剂盒供应(如福建三强公司)，因而适合各级医院应用。
, 百拇医药
综上所述，由于LE细胞试验存在着敏感性差、特异性不强、不能定量、操作费时、技术因素影响大等局限性，因而早在1987年kahn就已对是否还需要再检查LE细胞提出疑问[1]。1994年，美国临床病理学家协会(ASCP)的实用参数/测定结果委员会更明确提出LE细胞检查是一项已过时(废弃)的试验(obsolete test)，它应被更具有确定性的免疫学方法所取代。
陶义训[16]指出：快速斑点免疫结合试验是80年代中期发展起来的固相标记免疫测定新技术，该试验的特异性与ELISA相仿，敏感性略低于ELISA，但远高于胶乳凝集试验。并具有敏感、特异、简便、快速、试剂稳定等优点，作为单份快速测定，本试验属首选方法。应用DIBA检测抗双链DNA抗体被认为是目前最有用的诊断SLE的试验，该法与原有的检测方法相比敏感性更高，特异性更强，而且极为简便、快速、不需任何仪器设备，因而可作为SLE诊断的常规检测方法。
参考文献
, http://www.100md.com
1 朱晓辉，朱忠勇.红斑狼疮细胞试验的再评价.临床检验杂志，1995，13(6)：315～316
2 王 谦.改良血块法红斑狼疮细胞的检查，陕西医学检验.1996，11(1)：30～31
3 王传新，王 谦，展凤霞，等.全血中加破损白细胞与补体检查红斑狼疮细胞，临床检验杂志，1996，14(2)：92
4 赵小卫，于 玲，包小玲，等.全血中加鼠肝细胞，检测红斑狼疮细胞.临床检验杂志，1996，14(1)：10
5 贺 抗.SLE细胞形成试验改良基质片法与血块法的比较.山西医学院学报，1992，23(2)：169
6 方宗信.去血小板后改良血块法检查红斑狼疮细胞.蚌埠医学院学报，1995，20(3)：185
, http://www.100md.com
7 叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程.南京：东南大学出版社，1991：327～328
8 武建国.实用临床免疫学检验.南京：江苏科学技术出版社，1989：272
9 王 杰，朱世钧，殷文金，等.四种抗双链DNA抗体检测方法的评价.临床检验杂志，1996，14(3)：139
10 韩 松.快速斑点免疫结合试验的进展.中华医学检验杂志，1994，17(4)：249
11 武建国.临床免疫学的某些进展.临床检验杂志，1995，13(5)：274
12 武建国.风湿病的实验室检查.临床检验杂志，1996，14(6)：326
13 兰小鹏，朱忠勇.一种新的检测抗双链DNA抗体的斑点免疫结合试验.中华医学检验杂志，1994，17(3)：133～136
14 季晓辉，杜文平，袁淑云，等.快速斑点免疫金银染色检测抗双链DNA抗体.中华医学检验杂志，1994，17(4)：238
15 Emien W,Jarusiripipat p,Burdick G.A new ELISA for the detection of douvie-strand DNA antibodies.J Immunoi Methods,1990,132:91
16 陶义训.快速斑点免疫结合试验在医学检验中的 应用评价.中华医学检验杂志，1994，17(4)：197, http://www.100md.com
单位：宁夏回族自治区第二人民医院
关键词：
医学文选9906111
系统性红斑狼疮(SLE)是一种波及全身结缔组织，使多脏器受损害之慢性炎症性自身免疫性疾病。该病是一种累及多个系统，以慢性非化脓性炎症为特征，临床表现复杂多样化的结缔组织病，病因尚不完全明确，一般认为可能属于多因素性，即与遗传因素、病毒感染、内分泌因素、药物因素、环境因素等有关。SLE的实验室诊断，在早期主要依赖于检查红斑狼疮(LE)细胞，近年来已应用多种简便、快速、可靠的检测手段进行SLE自身抗体的测定，并在临床检验中得到广泛应用。本文简述这方面的进展。
1 LE细胞试验的应用与方法学改进
, http://www.100md.com 1948年，Hagraves等[1]在1例SLE患者的骨髓涂片中，偶然发现了一种吞噬了细胞核物质的细胞，此后，几经研究改进，可以在体外试验中大量获得这种细胞，并正式称之为红斑狼疮(LE)细胞，LE细胞的发现，对于SLE的诊断以及有关人类自身免疫性疾病的基础研究起过历史性的作用。
产生LE细胞的现象需要4个条件，即活的吞噬细胞、已损伤细胞的核、补体和LE因子，前三种为一般人体所共有，只有LE因子才是SLE所特有，并具诊断价值。LE因子是一种抗核蛋白的IgG抗体，它在补体的参与下，作用于细胞核，使核结构破坏，染色质松解，失去原有的致密结构，发生肿胀，形成均质化的团块，此团块旋被中性粒细胞所吞噬，形成LE细胞，有时少数团块未被吞噬，呈游离状态存在于涂片。上述4个因素缺一不可，而且最终又是根据细胞形态学加以确认的，因此，LE细胞试验存在着诸多的影响因素及局限性，其主要表现为敏感性差、特异性不强、不能定量而且操作较费时、技术因素影响大。以往检查LE细胞的方法大致有两类：一类是四种因素均来自病人自身血液，另一类是破损细胞的核(没有种属特异性、高低等动物的细胞核及培养细胞核均可)或活的吞噬细胞来自别人或别的生物。鉴于LE细胞试验存在上述的诸多影响因素，多年来，人们从LE细胞形成的4个因素着手，对该试验的某一个因素或几个因素进行多种改进，如浓集活的吞噬细胞(主要是中性粒细胞，罕见单核及嗜酸性粒细胞)；使用肝素抗凝血收集白细胞层涂片或用患者全血置37℃凝固后将血块加压通过金属筛等以期提高阳性率[1]；采用改良血块法，在标本中加入一定量受损的白细胞和补体[2，3]；在全血中加鼠肝细胞核[4]或采用改良基质片法[5]、去血小板后改良血块法[6]等。上述方法的应用均使LE细胞试验的阳性率有所提高，但是由于试验最终结果还是根据细胞形态学加以确认，试验过程中的各种因素特别是形态学观察上的多种影响因素及局限性必然会对试验结果产生很大影响。
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2 自身抗体的检测与进展
随着研究的深入，人们发现形成LE细胞现象的关键因素是所谓“LE”因子。LE因子是一种r球蛋白，是针对细胞核的一种自身抗体。此后，人们纷纷从免疫学角度加以深入研究，建立了许多检测SLE患者各种自身抗体的方法，这些方法较之LE细胞试验不仅敏感性高，而且特异性更强，操作也更简便、快速，更具鉴别诊断价值。
众所周知，SLE是一种自身免疫性疾病，而自身抗体是自身免疫病的重要标志。国内外医学界都将检出自身抗体列为诊断自身免疫病的重要条件，各种自身免疫病均可测出一种或多种自身抗体。与SLE相关的自身抗体主要为抗核抗体(antinuclear antibody ANA)。ANA是以真核细胞的核成分为靶抗原的自身抗体的总称，ANA系非器官特异性的自身抗体，多种ANA靶抗原存在于细胞核内的染色质、核质、核仁的不同部位，分布不一。各种ANA有其相应的对应抗原和抗原决定基，其相关疾病也不尽一致。SLE免疫学检测首先应用的是总抗核抗体测定，其代表方法为间接荧光抗体法[7]，该法以大、小鼠的肝、肾组织冷冻切片等底物作为抗原片，在与以细胞核成分为靶抗原的自身抗体时，该抗体可与细胞核成分结合，通过间接荧光抗体法观测结果，根据细胞核着染荧光的图像，可分为4种(或6种)荧光图谱。
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由于该法检测的是总抗核抗体(ANA)，敏感性高，但特异性不够强，除SLE外，其它自身免疫病如全身硬皮病、多种药物引起的狼疮、类风湿性关节炎等也可出现阳性，如硬皮病阳性率可达40%[7]，甚至80%[8]。另外，该法操作虽较简单，但荧光抗体的质量和最适稀释度、底物片的种类与固定方法、荧光显微镜的质量及操作等均对检测结果有一定影响。
目前，临床检测SLE已从总抗核抗体(ANA)转向对SLE更具特异性的抗DNA抗体[9～12]。抗DNA抗体是以真核细胞的核成分中的染色质为靶抗原的抗核抗体。抗DNA抗体有三类：即抗ds-DNA，包括只与ds-DNA反应的和既与ds-DNA也与ss-DNA反应的两种；其次为抗ss-DNA，第三为抗z-DΝΑ，此类抗体亦包括只与z-DNA和既与z-DNA也与ss-DNA反应的两种。仅与ds-DNA反应的抗ds-DNA对SLE有极高的特异性，但出现频度极低，临床上检出的一般是指与ds-DNA和ss-DNA都反应的抗ds-DNA抗体。由于抗ds-DNA抗体对SLE有较高的特异性，已经修订的美国(1982)及我国(1985)诊断SLE的标准中都已列入抗ds-DNA的测定。抗ss-DNA抗体的特异性较差，除SLE外，其它的结缔组织病、药物诱发的LE、慢活肝等也可检出。抗z-DNA抗体对SLE有很高的特异性，90%以上的病人可测出，且抗体效价与疾病的活动性密切相关，与抗ds-DNA效价平行变动。
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抗ds-DNA的测定方法很多，如免疫沉降、间接血凝、间接荧光抗体(DNA斑点法、马疫锥虫法、短膜虫法)、间接酶标抗体染色(短膜虫)、ELISA、放射免疫测定等。但是，现有的放免法(Farr法)假阳性率较高[13]，高要用放射性同位素，难以推广。短膜虫免疫荧光法(CL.IFA)敏感性不高，且需要荧光显微镜等设备，亦难普及。近年来建立的ELISA因ds-DNA不易吸附在固相载体上，加之多数作者采用不均一的小牛胸腺DNA(CT.DNA)作为抗原，其稳定性和特异性不够理想。季晓辉等[14]以牛胸腺DNA为抗原建立了快速斑点免疫金银染色法(FD-IGSS)检测抗双链DNA抗体(Ads-DNA)，研究表明，FD-IGSS法批间、批内重复性好，结果稳定，与RIA、ELISA法相比，保持了相似的敏感性与特异性，但更简便实用，快速可靠。兰小鹏等[13]以纯化的不含单链DNA的大肠杆菌质粒双链DNA(ds-DNA)作为抗原，利用亲和素—生物素系统，其结合在硝酸纤维素(NC)膜上，建立了一种新的检测抗ds-DNA抗体的斑点免疫结合试验(DIBA)。由于抗ds-DNA抗体的检测，首要的是选择不含单链DNA(SS-DNA)和蛋白质成分的ds-DNA作为包被抗原，否则检出的抗体中包含了一部分抗ss-DNA或其他针对蛋白质的自身抗体，而缺乏特异性。文献报道[15]CT.DNA含有ss-DNA或在ds-DNA中存在ss-DNA区段，短膜虫的动基体除ds-DNA以外还含有组蛋白，因而都不是理想的ds-DNA抗原，DIBA法应用大肠肝菌pBR322质粒作为抗原是因为质粒是纯的ds-DNA，而且该质粒容易提取和纯化，又因ds-DNA很难直接吸附在固相载体上，而改用NC作为固相载体，并应用亲和素-生物素作为固相免疫法中的连接剂，因而缩短了反应时间，阳性率亦有所提高，且方法更为简便、迅速、可靠，不需任何仪器，国内亦有成品试剂盒供应(如福建三强公司)，因而适合各级医院应用。
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综上所述，由于LE细胞试验存在着敏感性差、特异性不强、不能定量、操作费时、技术因素影响大等局限性，因而早在1987年kahn就已对是否还需要再检查LE细胞提出疑问[1]。1994年，美国临床病理学家协会(ASCP)的实用参数/测定结果委员会更明确提出LE细胞检查是一项已过时(废弃)的试验(obsolete test)，它应被更具有确定性的免疫学方法所取代。
陶义训[16]指出：快速斑点免疫结合试验是80年代中期发展起来的固相标记免疫测定新技术，该试验的特异性与ELISA相仿，敏感性略低于ELISA，但远高于胶乳凝集试验。并具有敏感、特异、简便、快速、试剂稳定等优点，作为单份快速测定，本试验属首选方法。应用DIBA检测抗双链DNA抗体被认为是目前最有用的诊断SLE的试验，该法与原有的检测方法相比敏感性更高，特异性更强，而且极为简便、快速、不需任何仪器设备，因而可作为SLE诊断的常规检测方法。
参考文献
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1 朱晓辉，朱忠勇.红斑狼疮细胞试验的再评价.临床检验杂志，1995，13(6)：315～316
2 王 谦.改良血块法红斑狼疮细胞的检查，陕西医学检验.1996，11(1)：30～31
3 王传新，王 谦，展凤霞，等.全血中加破损白细胞与补体检查红斑狼疮细胞，临床检验杂志，1996，14(2)：92
4 赵小卫，于 玲，包小玲，等.全血中加鼠肝细胞，检测红斑狼疮细胞.临床检验杂志，1996，14(1)：10
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10 韩 松.快速斑点免疫结合试验的进展.中华医学检验杂志，1994，17(4)：249
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14 季晓辉，杜文平，袁淑云，等.快速斑点免疫金银染色检测抗双链DNA抗体.中华医学检验杂志，1994，17(4)：238
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16 陶义训.快速斑点免疫结合试验在医学检验中的 应用评价.中华医学检验杂志，1994，17(4)：197, http://www.100md.com